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Artigo de método

Investigações eletrofisiológicas de Retinogeniculate e função do Synapse de Corticogeniculate

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⸱

DOI:

10.3791/59680

⸱

7 de agosto de 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Pathophysiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos protocolos para a preparação de cortes cerebrais agudos contendo o núcleo geniculado lateral e a investigação eletrofisiológica da função das sinapses retinogeniculado e corticogeniculado. Este protocolo fornece uma maneira eficiente de estudar sinapses com a probabilidade de liberação alta e de baixa liberação nas mesmas fatias cerebrais agudas.

Resumo

O núcleo geniculado lateral é a primeira estação de retransmissão para a informação visual. Os neurônios do relé deste núcleo thalamic integram a entrada das pilhas retinal do gânglio e projetam-na ao córtice visual. Além disso, os neurônios de retransmissão recebem excitação de cima para baixo do córtex. As duas principais entradas excitatórias para os neurônios de retransmissão diferem em vários aspectos. Cada neurônio do relé recebe a entrada de somente algumas sinapses retinogeniculate, que são grandes terminais com muitos locais da liberação. Isto é refletido pela excitação comparativamente forte, os neurônios do relé recebem, das pilhas retinal do gânglio. As sinapses corticogeniculate, ao contrário, são mais simples com poucos locais da liberação e uma força sináptica mais fraca. As duas sinapses também diferem em sua plasticidade sináptica de curto prazo. As sinapses retinogeniculate têm uma probabilidade elevada da liberação e apresentam conseqüentemente uma depressão a curto prazo. Ao contrário, as sinapses corticogeniculate têm uma baixa probabilidade da liberação. As fibras corticogeniculate atravessam os núcleos thalamic reticular antes de incorporar o núcleo geniculado lateral. Os diferentes locais do núcleo talâmico reticular (rostrally do núcleo geniculado lateral) e do trato óptico (ventro-lateralmente do núcleo geniculado lateral) permitem estimular as sinapses corticogeniculados ou retinogeniculados separadamente com eletrodos de estimulação extracelular. Isto faz o núcleo geniculado lateral uma área ideal do cérebro onde duas sinapses excitatórios com propriedades muito diferentes que colide no mesmo tipo da pilha, podem ser estudadas simultaneamente. Aqui, nós descrevemos um método para investigar a gravação dos neurônios do relé e para executar a análise detalhada da função retinogeniculate e corticogeniculate do sinapse em fatias agudas do cérebro. O artigo contém um protocolo passo-a-passo para a geração de fatias cerebrais agudas do núcleo geniculado lateral e etapas para a atividade de gravação de neurônios de retransmissão, estimulando o trato óptico e as fibras corticogeniculate separadamente.

Introdução

Os neurônios do relé do núcleo geniculado lateral integram e retransmitem a informação visual ao córtice visual. Esses neurônios recebem entrada excitatória de células ganglionares via sinapses retinogeniculadas, que fornecem a principal unidade excitatória para os neurônios de retransmissão. Além, os neurônios do relé recebem entradas excitatórios dos neurônios corticais através das sinapses corticogeniculate. Além disso, os neurônios de retransmissão recebem entradas inibitórias de interneurônios locais e neurônios gabaérgicos do núcleo Livedo reticular thalami1. O núcleo Livedo reticular thalami está presente como um escudo entre o tálamo e o córtex de tal forma que as fibras que projetam do córtex para o tálamo e no sentido oposto devem atravessar o núcleo Livedo reticular thalami2.

As entradas de retinogeniculate e as entradas do corticogeniculate exibem propriedades sinápticasdistintas3,4,5,6,7,8. As entradas do retinogeniculate formam grandes terminais com os locais múltiplos da liberação9,10. Em contrapartida, os insumos corticogeniculados exibem pequenos terminais com locais de liberação única7. Além disso, as sinapses retinogeniculate impulsionam eficientemente potenciais de ação de neurônios de retransmissão, apesar de constituírem apenas 5 − 10% de todas as sinapses nos neurônios de retransmissão3,8,11. As sinapses corticogeniculate, por outro lado, servem como um modulador de transmissões retinogeniculate controlando o potencial de membrana de neurônios de relé12,13.

Estas duas principais entradas excitatórias para retransmissão de neurônios também são funcionalmente diferentes. Uma diferença proeminente é a depressão de curto prazo das sinapses retinogeniculate e a facilitação a curto prazo de sinapses corticogeniculate3,5,8. A plasticidade de curto prazo refere-se a um fenômeno em que a força sináptica muda quando a sinapse é repetidamente ativa dentro de um período de tempo de poucos milissegundos a vários segundos. A probabilidade de liberação sináptica é um fator importante subjacente à plasticidade de curto prazo. As sinapses, com uma baixa probabilidade de liberação inicial, exibem a facilitação a curto prazo devido ao acúmulo de CA2 + na pré-síntese e, consequentemente, um aumento na probabilidade de liberação é observado após a atividade repetida. Em contraste, as sinapses com alta probabilidade de liberação geralmente exibem depressão de curto prazo devido à depleção de vesículas prontas-liberáveis14. Além disso, a dessensibilização dos receptores pós-sinápticos contribui para a plasticidade de curto prazo em algumas sinapses de alta probabilidade de liberação8,15. A probabilidade da liberação elevada e a dessensibilização de receptores do ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) contribuem à depressão a curto prazo proeminente de sinapses retinogeniculate. Por outro lado, a probabilidade de baixa liberação está subjacente à facilitação de curto prazo de sinapses corticogeniculados.

Em camundongos, o trato óptico entra no núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) do local caudolateral, enquanto as fibras corticogeniculate entram no dLGN rostroventrally. A distância entre as duas entradas permite a investigação das propriedades individuais de duas entradas excitatórios muito diferentes que colide na mesma pilha. Aqui, nós construímos sobre e melhoramos um método previamente descrito da dissecção em que as fibras do retinogeniculate e do corticogeniculate são preservadas em fatias agudas do cérebro3. Nós, então, descrevemos a investigação electrofisiológica de neurônios do relé e a estimulação de fibras retinogeniculate e corticogeniculate com os elétrodos extracelular da estimulação. Finalmente, nós fornecemos um protocolo para o enchimento de neurônios do relé com biocytin e a análise anatômica subseqüente.

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Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo painel governamental de supervisão em experimentos com animais da Renânia-Palatinado.

1. soluções

  1. Solução de dissecção
    1. Para reduzir a excitotoxicidade, prepare uma solução à base de colina para ser usado durante a dissecção como apresentado aqui (em mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 cloreto de colina, 25 NaHCO3, 1,25 NaH2po4, 0,5 CAcl2, 7 MgCl2, e 25 de glicose. Prepare a solução de dissecção menos de 1 semana antes do experimento.
  2. Solução de gravação
    1. Prepare uma solução de fluido espinhal cerebral artificial (ACSF) contendo (em mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 2,5 KCl, 2 CAcl2, 1 MgCl2e 25 glicose. Adicione 50 μM D-APV e 10 μM SR 95531 Hydrobromide para bloquear receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) e GABAa , respectivamente.
  3. Solução intracelular
    1. Prepare uma solução intracelular contendo (em mM): 35 cs-gluconato, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA e 0,1 D-600 (cloridrato de metoxiverapamil). Ajuste o pH a 7,3 com CsOH. Filtre, aliquot, e armazene a solução de estoque em-20 ° c até o uso.

2. dissecção

  1. Prepare duas câmaras de corte, das quais uma é preenchida com 100 mL da solução de dissecção e a outra com 100 mL de solução de gravação. Coloc os dois copos em um banho de água (° c 37) e borbulhe as soluções com o Carbogen por pelo menos 15 minutos antes da dissecção.
  2. Encha uma taça de plástico com 250 mL de solução de dissecção gelada (mas não congelada) próxima. Bolha com Carbogen pelo menos 15 min antes do uso.
  3. Encha um prato de Petri plástico (100 milímetros x 20 milímetros), em que a dissecção do cérebro será executada, com a solução fria da dissecção. Coloque um pedaço de papel de filtro na tampa do prato de Petri.
  4. Esfrie a câmara de dissecção do vibratome.
  5. Anestesie um rato com 2,5% de isoflurano, por exemplo, na gaiola do rato. Assim que o mouse não responde a uma pitada de cauda, decapitar o mouse perto da medula cervical e mergulhar a cabeça na solução de dissecção gelada na base do prato de Petri.
  6. Corte a pele da cabeça do caudal ao nasal e mantenha-a lateralmente com os dedos para expor o crânio. Para tirar o forebrain, primeiro corte o crânio junto com a linha média posterior-anterior e, em seguida, corte mais duas vezes através da sutura coronal e sutura lambdóide (Figura 1a).
  7. Retire o crânio entre a sutura coronal e a sutura lambdóide, de forma que o encéfalo esteja exposto. Corte o bulbo olfativo e separe o prosencéfalo do midbrain com uma lâmina fina (Figura 1b). Retire o cérebro do crânio com uma espátula fina e coloque-o sobre o papel de filtro na tampa do prato de Petri.
    Nota: as etapas 2,6 e 2,7 devem ser executadas o mais rápido possível para reduzir a morte celular.
  8. Para preservar a integridade das entradas sensoriais e corticais ao dLGN na fatia do cérebro, separe os dois hemisférios com um corte parasagittal com um ângulo de 3 − 5 ° (Figura 1C,D). Seque os planos mediolateral dos dois hemisférios colocando-os no papel de filtro e cole-os no estágio de corte com um ângulo de 10 − 25 ° do plano horizontal (Figura 1e).
  9. Coloque o palco no centro da bandeja de tampão de metal e despeje suavemente o resto da solução de dissecção gelada na bandeja de buffer. Execute esta etapa com cuidado desde que um derramar forte pôde remover o cérebro colado (Figura 1F).
  10. Coloque a bandeja de tampão na bandeja cheia de gelo, o que ajuda a manter a temperatura baixa durante a dissecção. Cortar 250 μm fatias com uma lâmina de barbear a uma velocidade de 0,1 mm/s e uma amplitude de 1 mm.
  11. Manter as fatias na câmara de retenção preenchidas com solução de dissecção oxigenada a 34 ° c durante cerca de 30 min e, em seguida, permitir que as fatias se recuperem na solução de gravação a 34 ° c por mais 30 min.
  12. Após a recuperação, retire a câmara de retenção da fatia do banho de água e mantenha as fatias à temperatura ambiente (RT) até serem utilizadas em experimentos.

3. eletrofisiologia

  1. Puxe pipetas utilizando capilares de vidro de borosilicato e um extrator de filamento. Manter a resistência das pipetas de gravação a 3 − 4 MΩ. Puxe as pipetas estimulantes utilizando o mesmo protocolo, mas quebre a ponta ligeiramente depois de puxar para aumentar o diâmetro. Encha as pipetas de gravação com a solução intracelular e a biocitina, enquanto preenche as pipetas estimulantes com a solução de gravação.
  2. Coloque as fatias na câmara de gravação e perfuse continuamente as fatias com a solução de gravação oxigenada em RT. Verifique todas as fatias e selecione aquelas que exibem um trato óptico intacto.
  3. Visualize a fatia e as pilhas com um microscópio ereto equipado com a microscopia de vídeo infravermelha do contraste da interferência diferencial (IR-DIC).
    Nota: os neurônios de retransmissão são diferenciados dos interneurônios por seu tamanho maior de soma e mais dendritos primários (ramos emergentes do soma). Os interneurônios exibem a morfologia bipolar com um soma menor.
  4. Coloque a pipeta estimulante sobre a fatia antes de remendar a célula com a pipeta de gravação. Para investigar sinapses retinogeniculate, coloc a pipeta de estimulação diretamente no intervalo ótico, onde as fibras do AXON das pilhas retinal do gânglio são empacotadas (Figura 2a). Para analisar as sinapses corticogeniculados, coloque o eletrodo estimulante no núcleo Livedo reticular thalami, que é rostroventrally adjacente ao dlgn (Figura 2b).
  5. Uma vez que a pipeta de gravação é imersa na solução de gravação, aplique uma etapa de tensão de 5 mV para monitorar a resistência da pipeta. Defina o potencial de retenção para 0 mV e cancele o potencial de deslocamento para que a corrente de retenção seja de 0 pA.
  6. Aproxime a pilha com a pipeta da gravação ao aplicar a pressão positiva. Quando a pipeta está em contato direto com a membrana celular, liberar a pressão positiva, e definir o potencial de retenção para-70 mV. Aplique uma ligeira pressão negativa para permitir que a membrana celular se encaixe na pipeta de vidro de forma que um selo do forme (resistência > 1 gω). Compensar a capacitância da pipeta e abrir a célula por aplicação de pulsos de pressão negativa.
  7. Para investigar a função sináptica, aplique 0,1 MS pulsos atuais (ca. 30 μA) através da pipeta de estimulação. Se não forem observadas Respostas sinápticas, as pipetas estimulantes poderão ter de ser substituídas. Tenha cuidado durante a colocação das pipetas estimulantes para uma posição diferente, de tal forma que a célula gravada não é perdida.
    Nota: nas gravações de exemplo mostradas na Figura 2, a plasticidade de curto prazo sináptica foi investigada estimulando o trato óptico ou as fibras corticogeniculadas duas vezes com intervalos interestímulos de 30 ms. A relação de pulso pareado (PPR) foi calculada dividindo-se a amplitude da segunda corrente pós-sináptica excitatória (EPSC) pela primeira EPSC (EPSC2/EPSC1). Cada protocolo de estimulação foi repetido 20 vezes. A amplitude da EPSC foi medida a partir das correntes médias das 20 varreduras. O intervalo de tempo entre cada repetição foi de pelo menos 5 s para evitar a plasticidade de curto prazo induzida pelas repetições.
  8. Monitore a resistência da série continuamente aplicando um passo de tensão de 5 mV. Use somente as pilhas com a resistência da série menor de 20 MΩ para a análise.

4. rotulagem do biocytin

  1. Manter a configuração de células inteiras por pelo menos 5 min para permitir a difusão de biocitina nos dendritos distais.
  2. Após a gravação, retire suavemente a pipeta da célula para que o soma não seja destruído.
    Observação: se mais de uma célula é gravada em uma fatia, seus somas devem ser suficientemente longe de suas células vizinhas. Certifique-se de que os dendritos de células diferentes não interferem uns com os outros durante a imagem.
  3. Prepare uma placa da cultura da pilha de 24 poços. Encha cada poço com 300 μL de paraformaldeído a 4% (PFA). Tome cuidado para não contaminar qualquer coisa com PFA que estará em contato com as fatias a serem gravadas.
  4. Transfira as fatias da câmara de gravação para a placa contendo PFA com uma pipeta de borracha e fixe as fatias durante a noite. Certifique-se de que a pipeta está sempre impedida de contaminação por PFA.
    PRECAUÇÃO: Use sempre luvas e utilize um capuz químico ao manipular o PFA.
  5. Após a fixação de fatias durante a noite na PFA, substitua a PFA por solução salina com tampão fosfato (PBS). Armazene as fatias em PBS a 4 ° c para processamento futuro (menos de 2 semanas).
  6. Lave as fatias com PBS fresco 3 vezes (10 min cada lavagem).
  7. Bloqueie sítios de ligação não específicos incubando as fatias na solução de bloqueio (0,2% de surfactante não iônico e 5% de albumina sérica bovina em PBS) por 2 h em RT em um agitador orbital.
  8. Descarte a solução de bloqueio. Incubar as fatias com streptavidin-Alexa 568 diluída na solução de bloqueio (1:1000) a 4 ° c durante a noite em um agitador orbital.
  9. Descarte a solução de anticorpos e lave as fatias 3 vezes com PBS por 10 min em RT em um agitador orbital. Lave as fatias com água da torneira antes de montar.
  10. Coloque as fatias de um mouse em um slide de vidro. Assegure-se de que as células manchadas estejam presentes na superfície superior das fatias. Absorva a água ao redor das fatias com os tecidos e, em seguida, deixe as fatias para secar por aproximadamente 15 min.
  11. Aplique duas gotas de meio de montagem em cada fatia. Monte uma lamínula no slide sem produzir bolhas de ar.
  12. Guarde as fatias rotuladas a 4 ° c após a visualização com um microscópio confocal.

5. imagem latente e reconstrução celulares

  1. Escaneie fatias com um microscópio confocal e use o software associado para a análise.
  2. Excitar a fluorescência a 561 nm.
  3. Imagem das fatias com 0,7 de abertura numérica (NA), objetivo de imersão em óleo.
  4. Ajuste a célula de destino no meio da exibição e aplique uma ampliação de 2,5 vezes.
  5. Renderize os conjuntos de dados z-Stack para digitalizar todo o neurônio com os seguintes parâmetros: Format = 2.550 x 2.550 pixels, Scan Frequency = 400 Hz, Z Number = 40. VOXEL tamanho foi em torno de 0,1211 x 0,1211 x 1,8463 μm3.
  6. Semi-rastrear automaticamente os neurônios usando um software de reconstrução neuronal (por exemplo, NeuronStudio). Um exemplo de um neurônio de retransmissão rastreado em 3D é mostrado na Figura 3B.

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Resultados

A preparação da fatia de dLGN contendo as vias retinogeniculada e corticogeniculado é mostrada um objetivo de 4x (Figura 2). Os axônios das células ganglionares retinianas agrupam-se no trato óptico (Figura 2). A pipeta estimulante foi colocada no trato óptico para induzir a corrente mediada por sinapse retinogeniculado (Figura 2a) e no núcleo Livedo reticular thalami para induzir a corrente mediada ...

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Discussão

Nós descrevemos um protocolo melhorado baseado em um método previamente publicado3, que permita a investigação da probabilidade elevada de sinapses retinogeniculate da liberação e da baixa probabilidade de sinapses corticogeniculate da liberação da mesma fatia. Isto é de grande importância uma vez que estas duas entradas interagem entre si para modular a transmissão do sinal visual: as entradas de retinogeniculate são a movimentação excitatórios principal de neurônios do relé, visto que as entrada...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Fundação alemã de pesquisa (DFG) no centro de pesquisa colaborativa (SFB) 1134 "conjuntos funcionais" (J.v.E. e X.C.) e o subsídio de pesquisa EN948/1-2 (J.v.E.).

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Materiais

2
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Amplificador HEKA ElektronikEPC 10 USB Amplificador de braçadeira de patch duplo
EMSURE1.02038.0100
Cs-gluconatoAuto-preparadoComo não havia Cs-gluconato comercial, nós o preparamos por nós mesmos 
D-600 Cloridrato de methoxyverapamilD-APV Sigma-AldrichM5644-50MG
D-APV Biotendência BN0085-100NMDA-receptor antagonista
Câmera digital para microscópioOlympusXM10
EGTASERVA11290.02
ForeneAbbvie2594.00.00isoflurano
GlicoseSigma-Aldrich49159-1KG
HEPESROTH9105.2
Isolador de estímulo de alta correnteInstrumentos de precisão mundialA385
KClEMSURE1.04936.1000
MgCl2EMSURE1.05833.0250
MicromanipuladoresLuigs & Miroscópio NeumannSM7
OlympusBX51
meio de montagem ThermoFisher ScientificP36930Prolong Gold Invitrogen
NaClROTH3957.1
NaH2PO4EMSURE1.06346.1000
NaHCO3EMSURE1.06329.1000
PipetaHilgenberg1807502
Extrator Sutter Lâmina de barbear P-1000
Personna 60-0138
Vibratome Semiautomático Leica  BiosystemsVT1200S
bromidrato SR 95531Biotendência AOB5680-10antagonista do receptor GABAA 
Biocytin Sigma-Aldrich B4261-250MG CaClEMSURE 1.02382.1000 cloreto de colina Sigma-Aldrich C1879-1KG Microscópio confocal de varredura a laser Leica Microsystems TCS SP5 CsCl

Referências

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