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Método avançado da imunoprecipitação da reticulação (eCLIP) para a identificação eficiente do RNA proteína-ligado no testis do rato

DOI:

10.3791/59681

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May 10th, 2019

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1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Nanjing Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, nós apresentamos um protocolo de eCLIP para determinar alvos principais do RNA de candidatos do RBP no testis.

Abstract

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A espermatogênese define um processo altamente ordenado de diferenciação de células germinativas masculinas em mamíferos. No testis, a transcrição e a tradução são desacopladas, sublinhando a importância da regulação pós-transcripcional da expressão gênica orquestrada por RBPs. Para elucidar papéis mecanísticos de um RBP, a metodologia da imunoprecipitação da reticulação (grampo) pode ser usada para capturar seus alvos diretos endógenos do RNA e para definir os locais reais da interação. O grampo realçado (eCLIP) é um método recentemente desenvolvido que ofereça diversas vantagens sobre os grampos convencionais. No entanto, o uso do eCLIP foi até agora limitado a linhas de célula, chamando para aplicativos expandidos. Aqui, nós empregamos eCLIP para estudar MOV10 e MOV10L1, dois helicases conhecidos do RNA-emperramento, no testis do rato. Como esperado, nós encontramos que MOV10 se liga predominantly a 3 ' as regiões Untranslated (UTRs) de mRNA e MOV10L1 ligam seletivamente às transcrições do precursor do RNA Piwi-interagindo (piRNA). Nosso método eCLIP permite a determinação rápida de espécies de RNA principais vinculadas por vários RBPs através de sequenciamento em pequena escala de subclones e, portanto, disponibilidade de bibliotecas qualificadas, como um mandado para prosseguir com sequenciamento profundo. Este estudo estabelece uma base aplicável para eclip no testis mamíferos.

Introduction

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O testis mammalian representa um modelo desenvolvente excelente onde um programa intricado da diferenciação da pilha funcione ciclicamente para render espermatozóides numerosos. Um valor único deste modelo reside no surgimento da inativação transcricional em determinados estágios da espermatogênese, tipicamente quando a inativação do cromossomo meiótico (MSCI) ocorre1,2 e quando os espermatozídeos redondos sofrem compactação nuclear drástica durante a spermiogênese3. Estes eventos transcricional inconsecutivos necessitam a regulação borne-transcricional do gene, em que as proteínas RNA-obrigatórias (rbps) jogam um papel crucial, dando forma ao transcriptoma e mantendo a fertilidade masculina.

Para identificar os alvos de RNA de bona fide de uma RBP individual in vivo, o método da imunoprecipitação de reticulação (clip) foi desenvolvido4,5, com base no mas além da imunoprecipitação de RNA regular (RIP)6,7 , pela incorporação de etapas chaves que incluem a reticulação ultravioleta (UV), a lavagem estrita e a transferência do gel para melhorar a especificidade do sinal. A aplicação avançada do grampo combinada com o seqüenciamento da elevado-taxa de transferência provocou o grande interesse na interação da proteína-RNA do perfil em níveis do genoma-largo8. Além do que estudos genéticos na função de RBP, tais métodos bioquímicos que identificam a interação direta da proteína endógena e do RNA foram indispensáveis para elucidar exatamente os papéis regulatórios do RNA de RBPs. Por exemplo, MOV10L1 é um helicase do RNA do testis-específico exigido para a fertilidade masculina e a biogênese Piwi-interagindo do RNA (piRNA)9. Seu MOV10 do parálogo é sabido como um helicase ubiquitously expressado e multifunctional do RNA com papéis em aspectos múltiplos da biologia do RNA10,11,12,13,14 , 15 anos de , 16 anos de , 17 anos de , 18. empregando o clip-Seq convencional, nós encontramos que MOV10L1 liga e regula precursores preliminares de Pirna para iniciar o processamento adiantado de Pirna19,20, e esse MOV10 liga UTRs de mRNA 3 ' e assim como o RNA RNAs espécies em células germinativas testiculares (dados não mostrados).

No entanto, CLIP é originalmente um procedimento laborioso, radioativo seguido de sequenciamento de preparação da biblioteca com uma notável perda de Tags CLIP. No clipe convencional, uma biblioteca de cDNA é preparada usando adaptadores ligados em ambas as extremidades do RNA. Após a digestão da proteína, os polypeptídeos curtos reticulados permanecem unidos aos fragmentos do RNA. Esta marca de reticulação bloqueia parcialmente a progressão da transcriptase reversa (RTase) durante a síntese do cDNA, resultando em cDNAs truncados que representam cerca de 80% da biblioteca do cDNA21,22. Assim, apenas os fragmentos de cDNA resultantes de RTase ignorando o site de reticulação (read-through) são seqüenciados. Recentemente, as várias aproximações do grampo, tais como PAR-grampo, iCLIP, eCLIP e uvCLAP, foram empregadas para identificar os locais da ligação cruzada de RBPs em pilhas vivas. O par-grampo envolve a aplicação da radiação UV de 365 nanômetro e dos análogos photoactivatable do nucleotide e é conseqüentemente exclusivo às pilhas vivas in-culturing, e a incorporação de análogos do nucleosídeo em transcritos recentemente sintetizados é propenso a produzir a polarização onde o RNA interage fisicamente com a proteína23,24. No iCLIP, apenas um único adaptador é ligado à extremidade 3 ' de fragmentos de RNA reticulado. Após a transcrição reversa (RT), ambos os cDNAs truncados e lidos são obtidos por circularização intramolecularmente e relinearização seguida pela amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR)25,26. Entretanto, a eficiência da circularização intramolecular é relativamente baixa. Embora os protocolos mais velhos do grampo precisem de etiquetar do RNA reticulado com um radioisótopo, reticulação ultravioleta e purificação da afinidade (uvCLAP), com um processo de purificação em tandem estrita da afinidade, não confia na radioactividade27. Não obstante, uvCLAP é limitado às pilhas cultivadas que devem ser transfected com o vetor da expressão que carreg a etiqueta de 3x FLAG-HBH para a purificação em tandem da afinidade.

Em eCLIP, os adaptadores foram ligados primeiramente na extremidade 3 ' do RNA seguido pelo RT, e em seguida na extremidade 3 ' dos cDNAs em uma modalidade intermolecular. Assim, o eCLIP é capaz de capturar todos os cDNA28truncados e lidos. Além disso, não é restrito à rotulagem radioativa, nem ao uso de linhas celulares com base em seu princípio, mantendo a resolução de nucleotídeo único.

Aqui, nós fornecemos uma descrição passo a passo de um protocolo eCLIP adaptado para testagem do mouse. Momentaneamente, este protocolo de eCLIP começa com reticulação UV de tubules testicular, seguidos pela digestão parcial de RNase e pela imunoprecipitação usando um anticorpo proteína-específico. Em seguida, o RNA proteína-ligado é dephosphorylated, e o adaptador é ligado a sua extremidade 3 '. Após a electroforese do gel da proteína e a transferência da gel-à-membrana, o RNA é isolado cortando a área da membrana de uma escala esperada do tamanho. Após RT, o adaptador do ADN é ligado à extremidade 3 ' do cDNA seguido pela amplificação do PCR. O rastreamento de subclones antes do sequenciamento de alta taxa de transferência é tomado como um controle de qualidade de biblioteca. Este protocolo é eficiente na identificação das principais espécies de RNA proteico-dependente de RBPs, exemplificada pelos dois testamentos expressando RNA helicases MOV10L1 e MOV10.

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Protocol

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Todos os experimentos realizados em animais foram aprovados pelo Comitê da universidade médica de Nanjing. Camundongos machos C57BL/6 foram mantidos condições controladas de fotoperíodo e foram fornecidos com alimentos e água.

1. colheita de tecidos e reticulação UV

  1. Eutanizar 2 camundongos adultos usando dióxido de carbono (CO2) por 1-2 min ou até que a respiração pare. Em seguida, realize a deslocação cervical em cada rato.
  2. Colha cerca de 100 mg de testículos de camundongos de idade apropriada (um testículo adulto neste estudo) para cada experimento de imunoprecipitação e coloque os tecidos em soro fisiológico tamponado com fosfato frio (PBS).
  3. Retire a túnica albugínea suavemente com um par de pinças de ponta fina.
  4. Adicione 3 mL de PBS gelado em um moedor de tecido e triturar o tecido pela força mecânica suave usando um pilão de vidro frouxo (tipo um pilão de vidro).
    Nota: O objetivo desta etapa não é a lyse células, mas para separar o tecido. A preservação da viabilidade celular e da integridade é importante.
  5. Transfira a suspensão do tecido para um prato de cultura celular (10 cm de diâmetro) e adicione PBS gelado até 6 mL.
  6. Agite a placa rapidamente para que o líquido cubra a parte inferior do prato uniformemente. Se o tecido é terra corretamente, os túbulos seminíferos uniformente distribuídos serão visíveis, visto que a presença de grupos do tecido indica que a dispersão do tecido é suboptimal.
  7. Crosslink a suspensão três vezes com 400 mJ/cm2 em 254 nm no gelo. Misture a suspensão entre cada irradiação.
    Nota: Para cada novo experimento, a reticulação deve ser otimizada.
  8. Colete a suspensão em um tubo cônico de 15 mL e pellet em 1.200 x g por 5 min a 4 ° c. Retire o sobrenadante, Ressuspender o pellet em 1 mL de PBS e, em seguida, transferir a suspensão para um tubo de centrifugação de 1,5 mL. Girar a 4 ° c e 1.000 x g por 2 min, e remover o sobrenadante.
  9. Neste ponto, proceder imediatamente com o resto do protocolo, ou congelar a pressão das pelotas em nitrogênio líquido e armazenar a-80 ° c até o uso.

2. preparação de grânulos

  1. Adicionar 125 μL de proteína A grânulos magnéticos por amostra (pellet) a um tubo de centrífuga fresco.
    Nota: Use grânulos magnéticos da proteína G para anticorpos do rato.
  2. Coloque o tubo no íman para separar os grânulos da solução. Após 10 s, retire o sobrenadante. Lave os grânulos duas vezes com 1 mL de tampão de Lise gelado.
    Nota: Subsequente separação da proteína um grânulos magnéticos segue esta etapa. A composição do tampão do lysis é 50 milímetros Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% de desoxicolato de sódio; 1/50 ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-cocktail livre do inibidor de protease (adicione fresco).
  3. Resuspender os grânulos em 100 μL de tampão de Lise a frio com anticorpo 10 μg de eCLIP. Gire os tubos à temperatura ambiente por 45 min.
    Nota: A concentração final de anticorpos para a imunoprecipitação é de 10 μg/mL. Se a concentração de anticorpos for desconhecida, a quantidade de anticorpos deve ser otimizada.
  4. Lave os grânulos duas vezes com 1 mL de tampão de Lise gelado.

3. lise tecidual e digestão de RNA parcial

  1. Resuspend pelotas do tecido em 1 mL do amortecedor frio do lysis (adicione 22 μL do cocktail do inibidor de proteína 50x (EDTA)-livre e 11 μL do inibidor de RNase a 1 mL do amortecedor do lysis).
    1. Resuspend duas pelotas UV-reticuladas e duas pelotas non-reticuladas por o grupo de experiências: UV-reticulado-1 pelotas para a biblioteca de eCLIP (UV-1); UV-crosslinked-2 pelotas para a biblioteca eCLIP (UV-2); Não-reticulado-1 pelotas para eCLIP biblioteca como um controle (não-UV); pelotas não-reticuladas-2 para o IP de IgG para demonstrar a especificidade dos anticorpos.
      Nota: o controle ideal para a biblioteca eCLIP do UV-crosslinked testes de tipo largo é o dos testículos de nocaute UV-reticulado de camundongos da mesma maca.
  2. Mantenha lise as amostras no gelo por 15 minutos (para impedir a degradação da proteína e do RNA).
  3. SONICATE em um sonicador digital em 10% de amplitude por 5 min, em 30 s on/30 s off. Coloque sempre a amostra no gelo e limpe a sonda com água sem nuclease entre cada amostra.
  4. Adicione 4 μL de DNase a cada tubo e misture bem. Incubar durante 10 min a 37 ° c, agitando a 1.200 rpm.
  5. Adicionar 10 μL de RNase I diluída (4 U/μL RNase I em PBS) e misturar bem. Incubar durante 5 min a 37 ° c, agitando a 1.200 rpm.
  6. Limpe o lisado por centrifugação a 15.000 x g durante 20 min (a 4 ° c).
  7. Colete cuidadosamente o sobrenadante. Deixar 50 μL de lisado e descartar o pellet com ele.
  8. Salvar amostras de insumos como RWB (executar para Western blot) e RRI (executar para isolamento de RNA). Poupe 20 μL (2%) de UV-1, UV-2, amostras não-UV e de IgG como entradas para o carregamento do gel de RWB. Poupe 20 μL (2%) de amostras UV-1 ou UV-2 como entradas para o carregamento de gel RRI.

4. imunoprecipitação

  1. Adicionar 1 mL do lisado (da etapa 3,7) às esferas (preparadas na secção 2) e rodar as amostras a 4 ° c durante 2 h ou durante a noite.
  2. Colete as contas com um suporte magnético e descarte o sobrenadante. Lave as contas duas vezes com 900 μL de tampão de sal elevado (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl; 1 mM EDTA; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% Deoxycholate de sódio), e então lave contas duas vezes com 900 μL de tampão de lavagem (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2; 0,2% Tween-20).
    Nota: Para a amostra de IgG, pause o procedimento aqui e armazene no gelo no tampão de lavagem.
  3. Lave os grânulos uma vez com 500 μL de tampão do desfosforilação 1x (10 milímetros Tris-HCl, pH 7,5; 5 milímetros MgCl2; 100 milímetros KCl; 0, 2% Triton X-100).

5. dephosphorylation de RNA 3 ' extremidades

  1. Colete as contas com um suporte magnético e descarte o sobrenadante. Remova o líquido residual usando pontas finas da pipeta. Adicionar 100 μl de mistura mestra de dephosphorilação (10 μL de tampão de desfosforilação 10x [100 mm Tris-HCl, pH 8,0; 50 mm MgCl2; 1 M KCl; 0,2% Triton X-100; 1 mg/ml albumina sérica bovina (BSA)]; 78 μL de água sem nuclease; 2 μL de inibidor de RNase; 2 μL de DNase; 8 μL de Al fosfatase de Kaline) a cada amostra, e incubar por 15 minutos em 37 ° c, agitando em 1.200 rpm.
  2. Adicionar 300 μL de mistura mestra de polinucleotídeo quinase (PNK) (60 μL de 5x PNK pH 6,5 tampão [350 mM Tris-HCl, pH 6,5; 50 mM MgCl2]; 223 μL de água sem nuclease; 5 μL de inibidor de RNase; 2 μL de DNase; 7 μL de enzima PNK; 3 μl de 0,1 M dithiothreitol) a cada amostra , incubar durante 20 min a 37 ° c, agitando a 1.200 rpm.
  3. Colete as contas com um suporte magnético e descarte o sobrenadante. Lave os grânulos uma vez com 500 μL de tampão de lavagem a frio. Em seguida, lave os grânulos uma vez com 500 μL de tampão de sal alto frio. Repita estas lavagens mais uma vez nesta ordem.
  4. Lave os grânulos uma vez com 500 μL do tampão da lavagem fria e então duas vezes com 300 μL do tampão frio da ligadura 1x (nenhum dithiothreitol, 50 milímetro Tris-HCl, pH 7,5; 10 milímetros MgCl2).

6. ligadura do adaptador do RNA às extremidades do RNA 3

  1. Descarte o sobrenadante e remova o líquido residual com pontas finas da pipeta. Adicionar 25 μL de 3 ' mistura mestra de ligadura a cada amostra. Misture cuidadosamente com pipetagem. Este passo é propenso a produzir bolhas.
    Nota: A mistura mestra de ligadura contém 3 μL de tampão de ligadura de 10x [500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM MgCl2]; 9 μL de água sem nuclease; 0,4 μL de inibidor de RNase; 0,3 μL de 0,1 M ATP; 0,8 μL de dimetil sulfóxido (DMSO); 9 μL de 50% de polietileno glicol (PEG) 8000; 2,5 μL de ligase de RNA [30 U/μL].
  2. Adicionar 2,5 μL de RNA adaptador X1A (tabela 1) e 2,5 ΜL de RNA adaptador X1B (tabela 1) para cada amostra. Misture cuidadosamente com pipetagem ou flicking, e incubar por 75 min a 25 ° c, flicking para misturar a cada 10 min.
  3. Lave os grânulos uma vez com 500 μL de tampão de lavagem a frio (retomar a amostra de IgG aqui).
  4. Lave os grânulos uma vez com 500 μL de tampão de sal alto frio e, em seguida, com 500 μL tampão de lavagem a frio. Repita estas lavagens mais uma vez.
  5. Grânulos magneticamente separados, e remova o líquido residual com pontas finas da pipeta.
  6. Ressuspender os grânulos em 100 μL de tampão de lavagem a frio (Pause a amostra de IgG aqui e guarde no gelo no tampão de lavagem). Mova 20 μL para tubos novos como amostras de RWB. Separe magneticamente os restantes 80 μL como amostras de RRI. Retire o sobrenadante das amostras RRI e ressuspender as esferas em 20 μL de tampão de lavagem.
  7. Adicionar 37,5 μL de tampão de amostra do dodecil sulfate do lítio 4x (LDS) e 15 μl do agente de diminuição da amostra 10x à amostra de IgG. Adicionar 7,5 μL de tampão de amostra de 4x LDS e 3 μL de agente redutor de amostra 10x às amostras (restantes). (Não misture com pipetagem). Incubar durante 10 min a 70 ° c, agitando a 1.200 rpm. Esfrie no gelo por 1 minuto, e centrifugue em 1.000 x g por 1 minuto em 4 ° c.

7. SDS-página e transferência de membrana

  1. Carregar géis.
    1. Para o gel de RRI (gel da proteína do BIS-Tris de 4-12%, 10 poços, 1,5 milímetros) coloc os tubos em um ímã e a proteína separada eluato dos grânulos. Carregar 30 μL de amostra por poço. As amostras são espaçadas pelo marcador de tamanho de proteína pré-manchado.
    2. Para o gel de RWB (gel da proteína do BIS-Tris de 4-12%, 10 poços, 1,5 milímetros) coloc os tubos em um ímã e a proteína separada eluato dos grânulos. Carregar 15 μL de amostra por poço. Guarde as restantes amostras a-20 ° c como backups.
  2. Adicionar 500 μL de antioxidante a 500 mL de tampão de funcionamento de SDS 1x. Funcione em 200 V no tampão running do SDS 1x para o minuto 50 ou até que a parte dianteira da tintura esteja na parte inferior.
    Nota: Antioxidante contém N, N-dimetilformamida, bissulfito de sódio, que migra com proteínas reduzidas para evitar a reoxidação de aminoácidos sensíveis, como metionina e triptofano.
  3. Transferir complexos de proteína-RNA do gel para uma membrana de nitrocelulose a 10 V para 70 min em tampão 1xtransfer com 10% de metanol (Vol/Vol). Enxagúe a membrana RRI em PBS frio, enrole-a em plástico e armazene a-80 ° c.
  4. Bloqueie a membrana RWB em 5% de leite em TBST à temperatura ambiente durante 1 h. Enxague a membrana em TBST. Incubar com o anticorpo preliminar em TBST em 4 ° c durante a noite. Lave duas vezes com TBST por 5 min. Incubar com anticorpo secundário (1:5000 HRP cabra anti-Rabbit IgG) em TBST à temperatura ambiente durante 1 h. Lave três vezes com TBST por 5 min, 10 min e 15 min, respectivamente.
  5. Misturar volumes iguais de electroquimioluminescência (ECL) tampão A e tampão B, adicionar à membrana e incubar durante 1 min. Cubra a membrana com o envoltório plástico, e exponha-a a uma película de raio X na temperatura ambiente para o minuto 2-3. Em seguida, desenvolver o filme.
    Nota: O filme com superexposição mostrará claramente a forma das bordas da membrana, pela qual o filme pode ser alinhado de volta para a membrana RWB. Em seguida, alinhe as membranas RWB e RRI com base nas posições dos marcadores nele. Em camadas em ordem de baixo para cima são o filme, a membrana RWB e a membrana RRI em seqüência.

8. isolamento de RNA

  1. Corte a região da faixa da proteína a 75 kDa (aproximadamente 220 NT do RNA) acima dele, usando a membrana e a película de RWB como guias.
    Nota: Porque uma molécula proteína-protegida do RNA pode ter um comprimento máximo de 225 bases, com aproximadamente 340 da por a base, é razoável cortar a região aproximadamente 75 kDa acima da faixa de RBP para recuperar todos os complexos da proteína-RNA.
  2. Corte a parte extirpada da membrana em diversas fatias pequenas, e coloc as em um tubo de centrifugador fresco de 1,5 mL. Adicionar 200 μL de tampão de proteinase K (PK) (100 mM Tris-HCl pH 7,5; 50 mM NaCl; 10 mM EDTA) com 40 μL de PK para as peças da membrana. Misture e incubar durante 20 min a 37 ° c, agitando a 1.200 rpm.
  3. Adicionar 200 μL de tampão de ureia PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4; 50 mM NaCl; 10 mM EDTA; 7 M ureia) a cada amostra. Incubar durante 20 min a 37 ° c, agitando a 1.200 rpm.
  4. Adicionar 400 μL de ácido fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1), misture bem e incubar durante 5 min a 37 ° c, agitando a 1.200 rpm.
  5. Coloc o tubo pesado do gel da fase do fechamento de 2 mL (PLG) no centrifugador e gire em 15.000 x g por 25 s.
  6. Transfira todo o conteúdo, exceto fatias de membrana para tubo pesado PLG. Incubar durante 5 min a 37 ° c, agitando a 1.200 rpm.
  7. Gire à temperatura ambiente e 15.000 x g por 15 min. Transfira a camada aquosa para um novo tubo cônico de 15 ml.
  8. Use as colunas de purificação e concentração de RNA para extrair RNA.
    1. Adicione 2 volumes (800 μL) do tampão de ligação do RNA a cada amostra (da etapa 8,7) e misture. Adicionar um volume igual (1200 μL) de 100% de etanol e mistura.
    2. Transferir 750 μL de amostra (da etapa 8.8.1) para as colunas de purificação e concentração de RNA em um tubo de coleta e centrifugação a 15.000 x g por 30 s. descarte o fluxo.
    3. Repita a etapa 8.8.2 até que todos os exemplos sejam passados através da coluna. Adicionar 400 μL de tampão de preparação de RNA à coluna e centrifugar a 15.000 x g durante 30 s. descarte o fluxo, aplique 700 μL de tampão de lavagem de RNA e centrifugue a coluna a 15.000 x g durante 30 s. descarte o fluxo.
    4. Adicionar 400 μL de tampão de lavagem de RNA à coluna e centrifugar a 15.000 x g durante 2 min. Transfira a coluna cuidadosamente para um novo tubo de 1,5 ml. Adicione 10 μL de água sem nuclease à matriz da coluna, deixe-se sentar por 2 min, e centrifugue em 15.000 x g por 30 s. Armazene amostras de eclip em-80 ° c até RT (etapa 11,1).

9. dephosphorylation de entrada RNA 3 ' extremidades

  1. Adicionar 15 μL de mistura mestra de dephosphorilação (2,5 μL de tampão de desfosforilação 10x [100 mm Tris-HCl, pH 8,0; 50 mm MgCl2; 1 M KCl; 0,2% Triton X-100; 1 mg/ml BSA]; 9,5 μL de água sem nuclease; 0,5 μL de inibidor de RNase; 2,5 μL de fosfatase alcalina) a 10 μL de amostras de entrada (a partir do passo 8.8.4). Incubar durante 15 min a 37 ° c, agitando a 1.200 rpm.
  2. Adicionar 75 μL de PNK Master Mix (20 μL de 5x PNK PH 6,5 tampão [350 mM Tris-HCl, pH 6,5; 50 mM MgCl2]; 44 μL de água sem nuclease; 1 μL de inibidor de RNase; 2 μL de DNase; 7 μL de enzima PNK; 1 μl de 0,1 M dithiothreitol) a amostras. Incubar durante 20 min a 37 ° c, agitando a 1.200 rpm.
  3. Limpeza do RNA de entrada
    1. Resuspend a extração de ácidos thenucleic magnética cristalina beadsin o frasco (Vortex para mais de 30 s). Adicione 20 μL de grânulos magnéticos de extração de ácidos nucleicos para cada amostra a novos tubos. Colete as contas com um suporte magnético e descarte o sobrenadante.
    2. Lave os grânulos uma vez com 1 mL de tampão de lise de purificação de RNA (tampão RLT). Coloque o tubo sobre um íman por 30 s e descarte o sobrenadante.
      Nota: A separação subseqüente de grânulos magnéticos da extração dos ácidos nucleicos seguiu esta etapa.
    3. Ressuspender os grânulos com 300 μL de tampão RLT e acrescentar à amostra. Adicionar 10 μL de 5 M de NaCl e 615 μL de 100% de álcool etílico (EtOH) e misturar por pipetagem. Gire à temperatura ambiente por 15 min. magneticamente separe os grânulos e remova o sobrenadante.
    4. Ressuspender os grânulos em 1 mL de EtOH de 75% e transferir para um novo tubo. Após 30 s, colete as contas com um suporte magnético e descarte o sobrenadante. Lave duas vezes com 75% EtOH, magneticamente separe os grânulos, e descarte o líquido residual com pontas finas da pipeta. Ar seco por 5 min (Evite a secagem excessiva).
    5. Resuspender os grânulos com 10 μL de água sem nuclease e incubatê-lo durante 5 min. magneticamente separar grânulos, e mover 5 μL de sobrenadante para um novo tubo (para 3 ' ligadura do adaptador abaixo). O RNA remanescente pode ser armazenado a-80 ° c como backups.

10. ligadura do adaptador do RNA à entrada RNA 3 ' extremidades

  1. Adicionar 1,5 μL de DMSO e 0,5 μL de adaptador RiL19 (tabela 1) a 5 ΜL de RNA de entrada (da etapa 9.3.5), incubar por 2 min a 65 ° c e colocar no gelo por mais de 1 min. adicionar 13,5 μL de 3 ' mistura mestra de ligadura a cada amostra , misture por pipetagem, e incubar para 75 min a 25 ° c, com flicking para misturar a cada 15 min.
    Nota: A ligadura Master Mix contém 2 μL de tampão de ligadura de 10x [500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM MgCl2; 10 mm dithiothreitol]; 1,5 μL de água sem nuclease; 0,2 μL de inibidor de RNase; 0,2 μL de 0,1 M ATP; 0,3 μL de DMSO; 8 μL de 50% PEG8000; 1,3 μL de ligase de RNA [30 U/μL].
  2. Limpeza do RNA de entrada ligado
    1. Separe magneticamente 20 μL de grânulos magnéticos de extração de ácidos nucleicos para cada amostra e remova o sobrenadante. Lave os grânulos uma vez com 1 mL de tampão RLT.
    2. Ressuspender os grânulos em 61,6 μL de tampão RLT e suspensão de transferência para cada amostra. Adicionar 61,6 μL de 100% EtOH. Use a pipeta para misturar por 15 min a cada 5 min. magneticamente grânulos separados, e remover sobrenadante.
    3. Repita a etapa 9.3.4.
    4. Resuspend grânulos com 10 μL de água nuclease-livre, e deixe-o sentar-se por 5 minutos. magneticamente separar os grânulos e transferir 10 μL do sobrenadante para um novo tubo.
      Nota: Este é um ponto de parada possível (as amostras de entrada podem ser armazenadas em-80 ° c até o dia seguinte).

11. transcrição reversa, ligadura do adaptador do ADN ao cDNA 3 ' extremidades

  1. Adicionar 0,5 μL de primer RT (tabela 1) a 10 ΜL de RNA de entrada (a partir do passo 10.2.4) e 10 ΜL de RNA clip (do passo 8.8.4), respectivamente, incubar durante 2 min em bloco PCR pré-aquecido a 65 ° c, colocar no gelo por mais de 1 min.
  2. Adicionar 10 μL de RT Master Mix (2 μL de tampão RT [500 mM Tris-HCl, pH 8,3; 750 mM KCl; 30 mM MgCl2]; 4 μL de água sem nuclease; 0,3 μL de inibidor de RNase; 2 μl de 0,1 m dithiothreitol; 0,2 μl de 0,1 m dATP; 0,2 μl de 0,1 m dctp; 0,2 μL de 0,1 M dGTP; 0,2 μL de 0,1 M dTTP; 0,9 μL de transcriptase reversa) a cada amostra, misture, incubar a 55 ° c por 45 min em um bloco PCR pré-aquecido.
  3. Misture 20 μL de produto de reacção RT com 3,5 μL de reagente de limpeza do produto PCR. Incubar durante 15 min a 37 ° c.
  4. Adicionar 1 μL de 0,5 M EDTA, misturar com pipetagem. Adicionar 3 μL de 1 M de NaOH, misturar por pipetagem e incubar durante 12 min a 70 ° c num bloco PCR para hidrolisar o modelo RNA.
  5. Adicionar 3 μL de 1 M HCl, pipeta-misture para neutralizar o tampão.
  6. Limpeza do cDNA
    1. Separe magneticamente 10 μL de grânulos magnéticos de extração de ácido nucleico para cada amostra, retire o sobrenadante. Lave uma vez com 500 μL de tampão RLT.
    2. Ressuspender os grânulos em 93 μL de tampão RLT e suspensão de transferência para a amostra. Adicionar 111,6 μL de 100% EtOH, incubar-lo por 5 min, e misture a pipeta a cada 2 min. colete as contas com um suporte magnético e descarte o sobrenadante. Ressuspender os grânulos com 1 mL de EtOH de 80% e passar para um novo tubo.
    3. Após 30 s, colete as contas com um suporte magnético e descarte o sobrenadante. Lave duas vezes com 80% EtOH. Separe magneticamente e descarte o líquido residual com ponta fina. Ar seco por 5 min (Evite a secagem excessiva). Resuspender os grânulos em 5 μL de Tris-HCl de 5 mM e incubatê-lo durante 5 min.
  7. Adicionar 0,8 μL de adaptador de DNA (tabela 1) e 1 ΜL de DMSO às esferas, incubar por 2 min a 75 ° c. Coloque no gelo por mais de 1 min.
  8. Preparar 12,8 μL de mistura mestra de ligadura (2 μL de tampão de ligadura de 10x [500 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mm dithiothreitol]; 1,1 μL de água sem nuclease; 0,2 μl de 0,1 M ATP; 9 μl de 50% PEG8000; 0,5 μL de LIGASE de RNA [30 U/μl]) , mexa a mistura, gire brevemente em uma centrífuga e adicione-a a cada amostra, mexa a amostra com a ponta da pipeta lentamente.
  9. Adicione outro 1 μL de ligase de RNA [30 U/μL] a cada amostra e mexa o dedo para misturar. Incubar durante 30 s a 25 ° c, agitando a 1.200 rpm. Incubar a 25 ° c durante a noite. Flick para misturar levemente 5 a 6 vezes, uma vez por hora.
  10. Limpeza de cDNA ligado
    1. Separe magneticamente 5 μL de grânulos magnéticos de extração de ácidos nucleicos para cada amostra e remova o sobrenadante.
    2. Lave uma vez com 500 μL de tampão RLT.
    3. Ressuspender grânulos em 60 μL de tampão RLT para grânulos e suspensão de transferência para cada amostra. Adicionar 60 μL de 100% EtOH, incubar-lo por 5 min e misture a pipeta a cada 2 min. magneticamente separado, descarte sobrenadante.
    4. Repita a etapa 9.3.4.
    5. Resuspend grânulos com 27 μL de Tris-HCl de 10 mM, incubar-lo por 5 min. magneticamente separado, e mova 25 μL de amostra para um novo tubo. Diluir o 1 μL de cDNA ligada com 9 μL de água sem nuclease num novo tubo. Guarde as restantes amostras a-20 ° c até ao passo 13,1.

12. quantificação do cDNA por PCR quantitativo em tempo real (qPCR)

  1. Adicionar 9 μL de mistura mestra de qPCR (5 μL de mistura mestre 2x; 3,6 μL de água sem nuclease; 0,4 μL de mistura de primer [10 μM PCR-F-D50X e 10 μM PCR-R-D70X]) a uma placa de qPCR de 96 poços. Adicionar 1 μL de 1:10 diluídos (em H2O) cDNA (a partir do passo 11.10.5), selar e misturar.
  2. Execute o programa de qPCR em um thermocycler: 2 minuto em 50 ° c; 2 min a 95 ° c; 3 s a 95 ° c seguidos de 30 s a 68 ° c para 40 ciclos; 15 s a 95 ° c seguido de 60 s a 68 ° c seguido de 15 s a 95 ° c durante 1 ciclo. Nota CT (limiar de ciclo) valor.

13. amplificação do PCR de cDNA

  1. Dispensar 35 μL de mistura mestra de PCR (25 μL de mistura mestra de PCR 2x; 5 μL de água sem nuclease; 5 μL de mistura de primer [20 μM PCR-F-D50X e 20 μM PCR-R-D70X]) em tiras de 8 poços. Para o grupo CLIP, adicionar 12,5 μL de amostra de CLIP + 2,5 μL de H2O; para o grupo de insumos, adicionar 10 μL de entradas + 5 μL de H2O. Misture bem e gire brevemente em centrífuga.
  2. Execute o programa PCR: 30 s a 98 ° c; 15 s a 98 ° c seguidos de 30 s a 68 ° c seguidos de 40 s a 72 ° c durante 6 ciclos; 15 s a 98 ° c seguido de 60 s a 72 ° c para N ciclos = (qPCR CT Values-3)-6; 60 s a 72 ° c; preensão de 4 ° c.
    Nota: É melhor executar 1 a 2 ciclos extra do PCR para os primeiros pares de grampos.

14. purificação de gel

  1. Carregue amostras em um gel de agarose de alta resolução de 3%. Deixando 1 poço vazio entre as amostras, e usar uma escada em ambos os lados do gel. Executar em 100 V para 75 min em 1x tampão Tris-borato-EDTA (TBE).
  2. iluminação de luz azul, corte de fatias de gel 175-350 BP usando lâminas de barbear frescas para cada amostra. Coloque-os em 15 mL de tubos cônicos.
    1. Pesar a fatia de gel, e elute o gel usando um kit de extração de gel.
    2. Adicionar 6x volumes de tampão dissolvendo gel para derreter o gel (100 mg gel = 600 μL de tampão de dissolução de gel). Dissolva o gel à temperatura ambiente. (Agitar para misturar a cada 15 min até que a fatia de gel esteja completamente dissolvida). Adicionar 1 volume de gel de 100% isopropanol e misture bem.
    3. Transferir 750 μL de amostra (da etapa 14.2.2) para a coluna em um tubo de coleta e centrifugar a 17.900 x g por 1 min. descarte o fluxo.
    4. Repita a etapa 14.2.3 até que todas as amostras tenham passado através da coluna, lave uma vez com 500 μL de tampão de dissolução do gel.
    5. Adicionar 750 μL de tampão de lavagem (do kit de extracção de gel) à coluna e centrifugar a 17.900 x g durante 1 min. descartar o caudal, girar a 17.900 x g durante 2 min. Coloque a coluna num novo tubo de 1,5 ml.
    6. Remova todo o tampão de lavagem restante da borda roxa plástica da coluna. Ar seco por 2 min. Adicionar 12,5 μL de água sem nuclease ao centro da membrana. Deixe a coluna ficar por 2 min em temperatura ambiente e gire em 17.900 x g por 1 min (para um rendimento melhorado, repita a etapa de eluição).

15. TOPO clone do produto PCR

  1. Prepare a mistura de reação de clonagem do TOPO (1 μL de produto de PCR do passo 14.2.6; 1 μL de mistura de clonagem; 3 μL de água estéril). Misture suavemente e incubar durante 5 min a 20-37 ° c. Esfrie no gelo.
  2. Thaw quimicamente competentes E. coli bactérias no gelo. Adicionar 5 μL do produto de clonagem TOPO a 100 μL de bactérias competentes29. Misture suavemente bem. Incubar no gelo por 30 min.
  3. Calor-choque para 60 s em 42 ° c. Em seguida, arrefecer no gelo durante 2 min. Adicionar 900 μL de caldo de lisogenia (LB), incubar a 37 ° c durante 1 h, agitando a 225 rpm. Girar a 1.000 x g por 1 min e, em seguida, remover 900 μL de sobrenadante. Resuspend o resto da solução.
  4. Placa de bactérias transformadas em 1,5% LB placas de agar contendo ampicilina (100 μg/mL), e incubar durante a noite a 37 ° c.
  5. Prepare pelo menos 20 tubos de centrífuga de 1,5 mL para cada constructo. Encha um conjunto com 500 μL de meio LB contendo 100 μg/mL de ampicilina. Use uma ponta de pipeta estéril para arranhar uma colônia bacteriana aleatoriamente e misture (por pipetagem) com 500 μL de meio LB. Incubar a 37 ° c durante 5 h, agitando a 225 rpm.
  6. Sequenciar o fragmento de pastilha usando o primer reverso M13: CAGGAAACAGCTATGAC por Sanger seqüenciamento30.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O procedimento eclip e os resultados são ilustrados na figura 1, figura 2, figura 3, Figura 4. Camundongos foram eutanasiados com dióxido de carbono e uma pequena incisão foi feita no abdome inferior por meio de tesoura cirúrgica (Figura 2a,...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Com a compreensão crescente do papel universal de rbps contextos biológicos e patológicos, os métodos do grampo foram utilizados extensamente para revelar a função molecular de rbps20,32,33, 34,35. O protocolo descrito aqui representa uma aplicação adaptada do método de eCLIP ao testis do rato.

Um desafio em executar eCLIP no testi...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Eric L Van Nostrand e a Gene W Yeo por uma orientação útil com o protocolo original. K.Z. foi apoiado pelo programa nacional da chave R & D de China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500), e Fundação Nacional da ciência natural de China (31771653). Ly foi apoiado pela National natural Science Foundation da China (81471502, 31871503) e programa inovador e empreendedor da província de Jiangsu.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anticorpos
Anti-camundongo MOV10  anticorpoProteintech, China10370-1-AP
Anticorpo anti-camundongo MOV10L1Zheng et al.20109polyclonal anti-soro UP2175fornecido pelo laboratório P. Jeremy Wang, Universidade da Pensilvânia
HRP Goat Anti-Rabbit IgG ABclonalAS014
Rabbit IgGBeyotime, ChinaA7016
Equipamento
CentrífugaEppendorf, Hamburgo, Alemanha5242R
Sonifier digitalBRANSON, EUABBV12081048A450 Watts; 50/60 Hz
DynaMag-2 MagnetInvitrogen, EUA12321D
Mini Módulo BlotInvitrogen,USAB1000
Mini Gel TankInvitrogen,USAA25977
Incubadora vibratóriaEppendorf, Hamburgo, AlemanhaConforto do Thermomixer 
Moedor de Tecidos, DouncePYREX, USA1234F35apenas  o pilão "solto" é usado neste protocolo
TProfessional standard 96 GradientBiometra, Alemanhanúmero de série: 2604323
Tube Revolver Cristal, EUAnúmero de série: 3406051
Reticulador de luz UVUVP, EUACL-1000
Materiais
Prato de Cultura tratado com TCCorning, EUA430167100 mm 
TubosCorning, EUA43079115 mL
AXYGEN, EUAMCT-150-C1,5 mL 
Reagentes 
Ácido fenol/clorofórmio/álcool isoamílico Solarbio, ChinaP101125:24:01
AffinityScript EnzimaAgilent, EUA600107
AntioxidanteInvitrogen, EUANP0005
DH5&alfa; bactérias competentesThermo Scientific, EUA18265017essas células econômicas rendem >1 x 106 transformantes/µ g DNA de controle por 50 µ L.
DMSOSigma-Aldrich, EUAD8418
DNA LadderInvitrogen, EUA10416014
dNTPSigma-Aldrich, EUADNTP100-1KT
Dynabeads Protein A Invitrogen, EUA10002D
ECL reagenteVazyme, ChinaE411-04
EDTAInvitrogen, EUAAM9260G
coquetel de inibidores de protease livre de EDTARoche, EUA04693132001adicionar fresco
Exo-SAP-ITAffymetrix, EUA78201Reagente de limpeza de produto PCR 
Enzima FastAPThermo Scientific, EUAEF0652
LDS Sample BufferThermo Scientific, EUANP0007
MetaPhor Agarose lonza, Suíça50180
MgCl2Invitrogen, EUAAM9530G
Extração de gel MiniEluteQIAGEN, Alemanha28604armazenamento de coluna a 4 ?; tampão QG=tampão de dissolução de gel; tampão PE= tampão de lavagem (para a etapa 14)
MyONE Grânulos de silanoThermo Scientific, EUA37002Dextração de ácidos nucléicos grânulos magnéticos
NaClInvitrogen, EUAAM9759
 
NP-40Amresco, EUAM158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein GelsInvitrogen, EUANP0336BOX4%– 12%,1,5 mm, 15 poços
NuPAGE MOPS SDS Kit de Tampão Invitrogen, EUANP0050
PBSGibco, EUA10010023
Gel de Fase Bloqueada (PLG) tubo pesado   TIANGEN, ChinaWM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master MixApplied Biosystems, EUAA25742
Proteinase KNEB, Nova Inglaterra P8107S
Q5 PCR master mix NEB, Nova Inglaterra Tampão M0492L
RLTQIAGEN, Alemanha79216Tampão de lise de purificação de RNA 
RNA Limpo & Concentrador-5 colunas ZYMO RESEARCH, EUAColunas de purificação e concentração de RNAR1016
RNase I Invitrogen, EUAAM2295
Inibidor de RNasePromega, EUAN251B
RQ1 DNasePromega, EUAM610A
Agente Redutor de AmostraInvitrogen, EUANP0009
Solução SDSInvitrogen, EUA1555302710%
de desoxicolato de sódioSigma-Aldrich, EUA30970proteger de
enzima PNKT4 NEB, Nova Inglaterra M0201L
T4 RNA ligase 1 alto concNEB, Nova Inglaterra M0437M
TA/Blunt-Zero Cloning MixVazyme, ChinaC601-01
TBEInvitrogen, EUAAM9863
Tris-HCI BufferInvitrogen, EUA15567027
Triton X-100Sangon Biotech, ChinaA600198 
Tween-20Sangon Biotech, ChinaA600560
UreiaSigma-Aldrich, EUAU5378
Filmes de raios-XCaresteam, Canadá6535876
Tubos de microtubos de leve

References

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