Aplicação de interferometria Biolayer (BLI) para o estudo de interações proteína-proteína em transcrição

Resumo

As interações de fatores de transcrição (TFs) com a RNA polimerase são geralmente estudadas usando ensaios de pulldown. Nós aplicamos uma tecnologia da interferometria de Biolayer (BLI) para caracterizar a interação de GrgA com o polymerase do RNA do chlamydial. Comparado aos ensaios de pulldown, o BLI detecta associação e dissociação em tempo real, oferece maior sensibilidade e é altamente quantitativo.

Resumo

Um fator de transcrição (TF) é uma proteína que regula a expressão gênica interagindo com o RNA polimerase, outro TF, e/ou DNA do modelo. O GrgA é um ativador de transcrição inovador encontrado especificamente no patógeno bacteriano intracelular obrigatório clamídia. Os ensaios de pulldown da proteína que usam grânulos da afinidade revelaram que GrgA liga dois fatores do σ, a saber σ⁶⁶ e σ²⁸, que reconhecem jogos diferentes dos promotores para os genes cujos os produtos são exigidos diferencialmente em estágios desenvolventes. Nós usamos BLI para confirmar e caracterizar mais as interações. BLI demonstra várias vantagens sobre pulldown: 1) revela associação em tempo real e dissociação entre parceiros vinculativos, 2) gera parâmetros cinéticos quantitativos e 3) ele pode detectar ligações que os ensaios de pulldown muitas vezes não conseguem detectar. Estas características permitiram-nos deduzir os papéis fisiológicos de GrgA na regulação da expressão gênica na clamídia, e possíveis mecanismos detalhados de interação. Nós imaginamos que esta tecnologia relativamente acessível pode ser extremamente útil para estudar a transcrição e outros processos biológicos.

Introdução

A transcrição, que produz moléculas de RNA usando DNA como modelo, é o primeiro passo da expressão gênica. A síntese de RNA bacteriano começa após a ligação da holoenzima RNA polimerase (RNAP) a um promotor-alvo^1,2. O holoenzyme de RNAP (RNAPholo) é compreendido de um núcleo catalítico do multi-subunit (RNAPcore) e de um fator σ, que seja exigido para reconhecer a seqüência do promotor. Ativadores de transcrição e repressores, coletivamente denominados TFs, regulam a expressão gênica através dos componentes de ligação do RNAPcore, σ fatores e/ou DNA. Dependendo do organismo, uma parcela significativa do seu genoma pode ser dedicada a TFs que regulam a transcrição em resposta às necessidades fisiológicas e sugestões ambientais³.

A clamídia é uma bactéria intracelular obrigatória responsável por uma variedade de doenças em humanos e animais^4,5,6,7,8. Por exemplo, Chlamydia trachomatis é indiscutivelmente o número um patógeno sexualmente transmitido em humanos em todo o mundo, e uma das principais causas de cegueira em alguns países subdesenvolvidos^4,5. A clamídia tem um ciclo de desenvolvimento único caracterizado por duas formas celulares alternadas denominadas de corpo elementar (EB) e corpo RETICULADO (RB)⁹. Considerando que, os EBs são capazes de sobreviver em um ambiente extracelular, eles são incapazes de proliferação. EBs entrar células hospedeiras através de endocitose e diferenciar em maior RBs em um vacuol no citoplasma hospedeiro dentro de horas após a inoculação. Não mais infeccioso, RBs proliferam através de fissão binária. Ao redor 20 h, começam diferenciar-se de volta ao EBs, que saem das pilhas do anfitrião ao redor 30-70 h.

A progressão do ciclo de desenvolvimento de clamídia é regulada pela transcrição. Visto que uma supermaioria dos quase 1.000 genes chlamydial é expressada durante o midcycle durante que RBs está replicando ativamente, somente um número pequeno de genes é transcrito imediatamente depois que a entrada de EBs nas pilhas do anfitrião para iniciar a conversão de EBs em RBs, e outro pequeno conjunto de genes são transcritos ou cada vez mais transcritos para permitir a diferenciação de RBs em EBs^10,11.

O genoma da clamídia codifica três fatores σ, ou seja, σ⁶⁶, σ²⁸ e σ⁵⁴. σ⁶⁶, que é equivalente ao housekeeping σ⁷⁰ de e . coli e outras bactérias, é responsável para reconhecer promotores de genes adiantados e meados de-ciclo assim como alguns genes atrasados, visto que σ²⁸ e σ⁵⁴ são exigidos para a transcrição de certos genes tardios. Vários genes são conhecidos por transportar um promotor σ⁶⁶-dependente e um promotor σ²⁸-dependente¹².

Apesar de um ciclo de desenvolvimento complicado, apenas um pequeno número de TFs foi encontrado em Chlamydiae¹³. Grga (anotado previamente como uma proteína hipotética CT504 em c. trachomatis sorovar D e em CTL0766 em c. trachomatis L2) é um TF Chlamydia-específico reconhecido inicialmente como um activador de σ⁶⁶-dependente genes¹⁴. Os ensaios de pulldown da afinidade demonstraram que GrgA ativa sua transcrição ligando σ⁶⁶ e ADN. Curiosamente, foi mais tarde encontrado com que GrgA também coprecipitates com σ²⁸, e ativa a transcrição de σ²⁸promotores dependentes in vitro¹⁵. Para investigar se GrgA tem afinidades similares ou diferentes para σ⁶⁶ e σ²⁸, nós recorramos a usar o bli. Os ensaios de BLI mostraram que o GrgA interage com σ⁶⁶ em uma afinidade 30-fold mais elevada do que com σ²⁸, sugerindo que Grga possa jogar papéis diferenciais em σ⁶⁶-dependente transcrição e σ²⁸-transcrição dependente ^{quinze anos}.

A BLI detecta o padrão de interferência da luz branca que reflete a partir de uma camada de proteína imobilizada na ponta de um biosensor e a compara à de uma camada de referência interna¹⁶. Através da análise destes dois padrões de interferência, a BLI pode fornecer informações valiosas e em tempo real sobre a quantidade de proteínas ligadas à ponta do biosensor. A proteína que é imobilizada à ponta do biosensor é referida como o ligand, e é imobilizada geralmente com a ajuda de um anticorpo comum ou de um Tag do epítopo (por exemplo, um poli-his-ou a biotina-etiqueta) que tem uma afinidade para uma partícula associada (tal como NTA ou Streptavidin) na ponta do biosensor. O emperramento de uma proteína secundária, referida como o analyte, com o ligante na ponta do biosensor cria mudanças na opacidade do biosensor e conseqüentemente conduz às mudanças em testes padrões da interferência. Quando repetida em diferentes concentrações do analito, a BLI pode fornecer não apenas informações qualitativas, mas também quantitativas, sobre a afinidade entre o ligantes e o analito¹⁶.

Ao melhor de nosso conhecimento, fomos os primeiros a empregar a BLI para caracterizar as interações proteína-proteína na transcrição¹⁵. Nesta publicação, demonstramos que um fragmento Grga, que foi anteriormente mostrado para ser exigido para σ²⁸-Binding, realmente Medeia a ligação. Este manuscrito centra-se nas etapas dos ensaios de BLI, e na geração de gráficos de BLI e em parâmetros da cinética obrigatória. Métodos para a produção (e purificação) de ligantes e analitos não são cobertos aqui.

Protocolo

1. preparação de proteínas

1. Use um saco da diálise (com um tamanho apropriado do corte) para Dialize cada proteína a ser usada para ensaios de bli (que incluem o ligante his-etiquetado e o analyte) de encontro a 1.000 volumes do amortecedor de bli (25 milímetros de Tris-HCl, de 150 milímetros NaCl, de 0,1 milímetros de EDTA, de 10 milímetros MgCl₂ , 0,1 mM DTT, pH 8,0, pré-refrigerados a 4 ° c) a 4 ° c por 4 h.
   Nota: os ensaios de BLI requerem que o ligante esteja presente em concentrações que saturem os sítios de ligação do biosensor e que o analito seja altamente purificado para que se conhecam as concentrações molares do analito que reagem com o ligante. Metodologias para a expressão e purificação de suas proteínas marcadas e Strep não são cobertas aqui, mas podem ser encontradas em publicações anteriores^14,15. Embora este sistema não exija o ligante estar na forma altamente purified, é essencial Dialize mesmo os ligantes não purificada ao amortecedor de bli a fim minimizar deslocamentos nos testes padrões da interferência da branco-luz causados por todas as mudanças do amortecedor durante o ensaio.
2. Mude para o tampão BLI fresco e continue a diálise por mais 4 h.

2. hidratação do biosensor e set-up do ensaio

1. Aproximadamente 10 minutos antes do início de um ensaio, pipetar 200 μL do tampão BLI num tubo de PCR.
2. Retire um NI-NTA-biosensor da embalagem original segurando a porção larga do biosensor usando uma mão enluvado.
3. Coloc o biosensor sobre o PCR-tubo tal que somente a ponta de vidro do biosensor é submersa no amortecedor de BLI.
4. Mantenha a ponta do biossensor submersa por pelo menos 10 min para garantir a hidratação total.
   1. Verifique se a ponta de vidro do NI-NTA-biosensor não toca em nada além do buffer de BLI durante a etapa acima.
      Nota: Este protocolo usa um NI-NTA-biosensor conjuntamente com um ligand his-etiquetado. Se necessário, um SA-streptavidin-biosensor pode ser usado conjuntamente com um ligante biotinylated preferivelmente se: (i) o ligante e o analito carreg um seu Tag ou (II) nenhuns deles faz.
5. Ligue a máquina BLItz.
6. Certifique-se de que a máquina está conectada ao computador por meio de uma porta de saída de dados USB na parte traseira da máquina.
7. No computador, abra o software associado (por exemplo, BLItz pro) e clique em cinética avançada no lado esquerdo da tela.
8. No software, digite todas as informações apropriadas sobre o experimento (incluindo o nome do experimento, descrição, ID de amostra e concentração proteica) em cada título respectivo.
9. Clique no tipo de biosensor e escolha NI-NTA no menu suspenso.
   1. o título das configurações de execução , verifique que o Shaker está ajustado para permitir.
   2. No título da lista de tipos de etapas , verifique se há 5 itens listados: linha de base inicial, carregamento, linha de base, associação e dissociação.
      Observação: a duração de cada etapa pode ser alterada de padrão, conforme necessário. Para obter resultados ideais, use um mínimo de 30 s para linha de base inicial e linha de base; e 120 s para associação e dissociação. A duração da etapa de carregamento (variando de 120 a 240 s) dependerá da concentração do ligante e da afinidade da etiqueta his-epitope no ligante ao NI-NTA-biosensor.
10. Retire o NI-NTA-biosensor hidratado do tubo do PCR e afixe-o à montagem do biosensor na máquina deslizando a parcela larga do biosensor na montagem.
    Nota: não deixe o biosensor secar durante o experimento.
11. Coloque um tubo de microcentrífuga preto de 0,5 mL no suporte do tubo da máquina e pipetar 400 μL do tampão BLI nele.
12. Verifique se o controle deslizante da máquina está posicionado de forma que o suporte do tubo esteja situado na frente da seta preta na máquina.
13. Feche a tampa da máquina de tal forma que a ponta do biosensor se torne submersa no tampão no tubo de microcentrífuga.
14. Clique em Avançar no software para começar a gravar a linha de base inicial.

3. carregamento do ligante no biosensor

1. Depois que a etapa de linha de base inicial terminar a gravação, abra a tampa da máquina.
2. Mova o controle deslizante para a direita de tal forma que o suporte da gota (em vez do suporte do tubo) esteja situado na frente da seta preta.
3. Pipete 4 μL de um ligador dialítico com a tag (da etapa 1,1) para o suporte de queda e feche a tampa da máquina.
   Nota: a concentração óptima do ligante a ser usado pode variar para cada proteína. Uma concentração entre 1,0 a 2,0 mg/mL é geralmente adequada para saturar o NTA na ponta do biosensor em 240 s.
4. No software, clique em Avançar para começar a carregar.

4. lavar afastado ligante adicional

1. Depois que a etapa de carregamento terminar a gravação, abra a tampa da máquina.
2. Mova o controle deslizante para a esquerda, de forma que o suporte do tubo esteja novamente situado na frente da seta preta.
3. Feche a tampa da máquina e assegure-se de que a ponta do biosensor esteja submersa no amortecedor BLI do tubo no suporte do tubo.
4. Clique em Next novamente no software para começar a gravar a linha de base.

5. Associação de analito ao ligante

1. Depois que a etapa linha de base terminar a gravação, abra a tampa da máquina.
2. Retire o suporte da gota e limpe-o introduzindo toda a proteína e enxaguando-a com água dobro-deionized (ddH₂O) para um total de 5 vezes.
   1. Use uma limpeza do tecido para limpar a superfície do suporte da gota após a lavagem.
3. Volte a colocar o suporte da gota na máquina.
4. Mova o controle deslizante na máquina para a direita de tal forma que o suporte da gota é novamente situado na frente da seta preta.
5. Pipetar 4 μL de um analito dialítico (da etapa 1,1) para o suporte da gota e fechar a tampa da máquina.
6. No software, clique em Avançar para iniciar associação.

6. dissociação do analito do ligante

1. Depois que a etapa de associação terminar a gravação, abra a tampa da máquina.
2. Mova o controle deslizante na máquina para a direita de tal forma que o suporte do tubo é novamente situado na frente da seta preta.
3. No software, clique em Avançar para iniciar a dissociação.
4. Depois que a etapa de dissociação terminar a gravação, abra a tampa da máquina.
5. Retire o suporte da gota e o suporte do tubo.
6. Enxágüe ambos com ddH₂o completamente para lavar afastado toda a proteína.
7. Retire o biosensor e descarte-o com segurança.

7. repetição de interações com diferentes concentrações

1. Repita as etapas 2-7 para o mesmo par ligand-analito usando concentrações diferentes do analito.
   Nota: a concentração do analito pode necessitar de ser ajustada em várias corridas antes de obter resultados óptimos. Em nossa experiência, uma relação de 1:5:10 de concentrações do analito, começando com 75 nanômetro, é geralmente adequada.

8. analisando os dados utilizando o software

1. Depois que todas as execuções tiverem terminado, salve os dados no software clicando em arquivo e, em seguida, salvar experimento como no lado esquerdo da tela.
2. No título executar dados, selecione correção e ajuste de etapa (1:1) e clique em analisar para gerar dados cinéticos.
3. Para extrair os dados quantitativos em uma planilha e gerar gráficos, clique em exportar para CSV e salve os dados gravados como um arquivo. csv. Abra o arquivo. CSV usando o software de planilha.
   1. Para mostrar de forma mais eficaz a cinética de associação e dissociação, remova todos os pontos de plotagem antes da etapa de linha de base e normalizar todos os pontos de plotagem subsequentes do valor final da linha de base.

Resultados

Através dos ensaios de BLI, nós estabelecemos previamente que a ligação de GrgA a σ²⁸ é dependente de uma região média do ácido aminado 28 (resíduos 138-165) de Grga¹⁵. Conformemente, comparado com N-terminally his-etiquetou o comprimento cheio GrgA (NH-GrgA), um constructo do apagamento de GrgA que falta esta região (NH-GrgAΔ 138-165) teve uma taxa de associação diminuída e uma taxa de dissociação aumentada, conduzindo a uma perda 3 milhões-fold de global afinidade (tabela 1

Discussão

As interações proteína-proteína são cruciais para a regulação da transcrição e outros processos biológicos. Eles são mais comumente estudados através de ensaios de pulldown. Embora os ensaios de pulldown sejam relativamente fáceis de executar, eles são pouco quantitativos e podem não detectar interações fracas, mas biologicamente significativas. Em comparação, detectando associação e dissociação em tempo real entre um ligantes e um analito, o BLI fornece constantes de taxa de associação e dissociação, bem como, afinidade...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Máquina BLItz	ForteBio	45-5000
Tubo de diálise membrana de celulose	MilliporeSigma	D9652
Dip and Read Bandeja de biossensor Ni-NTA	ForteBio	18-5101	Biossensores Ni-NTA prontos para uso para proteínas marcadas com poli-His Porta-gotas
	ForteBio	45-5004
Tubos de PCR (0,2 mL)	Thomas Scientific
Tubos de microcentrífuga (pretos)	Thermo Fisher Scientific	03-391-166
Kimwipes	Thermo Fisher Scientific	06-666A
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
EDTA	MilliporeSigma	E6758
MgCl2	MilliporeSigma	M8266
NaCl	MilliporeSigma	S9888
Tris-HCl	GoldBio	T095100