Artigo de método

Hibridação in situ da fluorescência quantitativa (peixes) e immunofluorescence (se) de produtos específicos do gene em pilhas KSHV-infectadas

DOI:

10.3791/59697

⸱

27 de agosto de 2019

 , 
1Norfolk Academy, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Howard Hughes Medical Institute, Yale School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Nós descrevemos um protocolo que utiliza a hibridação in situ da fluorescência (peixes) para visualizar RNAs herpética múltiplas dentro das pilhas humanas liticamente contaminadas, na suspensão ou no aderente. Este protocolo inclui a quantificação da fluorescência produzindo uma relação Mimivírus e pode ser estendido para o visualização simultâneo do anfitrião e das proteínas virais com imunofluorescência (se).

Resumo

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A introspecção mechanistic chega do estudo cuidadoso e da quantificação de RNAs e de proteínas específicos. As posições relativas destas biomoléculas durante todo a pilha em épocas específicas podem ser capturadas com a hibridação in situ da fluorescência (peixes) e a imunofluorescência (se). Durante a infecção por herpesvírus lítico, o vírus seqüestra a célula hospedeira para expressar preferencialmente genes virais, causando alterações na morfologia celular e no comportamento das biomoléculas. As atividades líticas são centradas em fábricas nucleares, denominadas compartimentos de replicação viral, que são perceptível apenas com FISH e IF. Aqui nós descrevemos um protocolo adaptável de peixes do RNA e se as técnicas para Kaposi ' s sarcoma-associou o Herpesvirus (KSHV)-pilhas infectadas, aderente e na suspensão. O método inclui etapas para o desenvolvimento de oligonucleotides antisense específicos, peixes dobro do RNA, peixes do RNA com se, e cálculos quantitativos de intensidades da fluorescência. Este protocolo foi aplicado com sucesso aos tipos múltiplos da pilha, às pilhas não infectadas, às pilhas latentes, às pilhas Lytic, aos tempo-cursos, e às pilhas tratadas com os nervos inibidores para analisar as atividades armazenamento de RNAs e de proteínas específicas do anfitrião humano e KSHV.

Introdução

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Em sua fase lítica (ativa), os herpesvírus sequestram a célula hospedeira, causando alterações na morfologia celular e localização de moléculas biológicas, para produzir virions. A base das operações é o núcleo, onde o genoma viral do DNA duplo-encalhado é replicado e empacotado em um escudo da proteína, chamado um capsídeo1. Para começar, o vírus expressa suas próprias proteínas, seqüestro máquinas hospedeiras e impedindo a expressão de genes de acolhimento não essenciais, um processo denominado o efeito de desligamento do hospedeiro. A maioria desta atividade é localizada a 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-regiões nucleares livres chama....

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Protocolo

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1. projeto de oligonucleotídeos antisense in situ da fluorescência (peixes) para detectar um transcrito herpética específico

  1. Selecione 25 a 40 segmentos do NT da seqüência do RNA do interesse e converta-o para ser antisense. Uma estratégia bem sucedida dos peixes pode conter de um até dez ou mais oligonucleotides antisense diferentes. Ao selecionar sequências, considere o seguinte:
    1. Se o RNA do interesse contem uma região original da repetição, a seguir capitalizar nesta característica e projete um oligonucleotide antisense para alvejar a seqüência da repetição.
      Nota: tycowski e os colegas5 fornecem um exemplo desta estratég....

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Resultados

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Os métodos FISH e IF detalhados neste manuscrito são mostrados na Figura 1 , juntamente com a quantificação dos resultados por traços de linha de intensidade fluorescente. Os resultados aqui apresentados são semiquantitativos e oferecem insight sobre a localização, em vez de comparações entre intensidades de diferentes manchas fluorescentes, pois experimentos não incluem um cordão fluorescente na preparação da lâmina. A Figura 1 .......

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Discussão

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O protocolo descrito neste relatório pode ser adaptado aos tipos diferentes da pilha e inclui etapas para peixes dobro do RNA e peixes do RNA com o se que usa anticorpos preliminares monoclonais e polyclonal. Embora as corrediças preparadas sejam imaged tipicamente com um microscópio confocal, a imagem latente pode ser executada com um microscópio de STED (depleção de emissão estimulada) após modificações da concentração aumentada do anticorpo e de um meio de montagem diferente. Para análise aprimorada de células individ.......

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos a Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski e Johanna B. Withers para aconselhamento sobre análise de dados. Agradecemos também ao G. Hayward pelo anticorpo anti-SSB. Este trabalho foi apoiado por subsídios T32GM007223 e T32AI055403 dos institutos nacionais de saúde (TKV) e concessão de NIH (CA16038) (para JAS). JAS é um investigador do Howard Hughes Medical Institute. As figuras 1-3 e a tabela 1 foram reproduzidas com a permissão da sociedade americana para microbiologia uma licença Creative Commons Attribution da seguinte publicação: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi ' s sarcoma-Associated A acumulação de mRNA do Herpesvirus....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AlexaFluor594-5-dUTPLife TechnologiesC1100
anti-DIG FITC Jackson Lab Immunologicals200-092-156
Anti-Rabbit Secundário AlexaFluor594 Anticorpo MonoclonalInvitrogenA-11037
Anticorpo Anti-SSBN/AN/ARef. Chiou et al. 2002
BLASTnNIH NCBIN/ASoftware de Alinhamento de Sequência Livre
Sulfato de DextranoSigma AldrichD8906Grau de Biologia Molecular
Kit de Rejeito de Oligonucleotídeos DIGMASigma Roche#033535839102ª Geração
Lâminas de Oito CâmarasNunc Lab Tek II#154453O selo azul promove a tensão superficial, mas a separação por gel transparente também está disponível. 
Sondas GAPDHGrau de Biologia MolecularFormamida Sigma AldrichF9037
StellarisSMF-2019-1Compatível com protocolo, Quasar 670
ImageJ NIH, Bethesda, MDN/ASoftware de Análise de Imagem Gratuito, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]
OligoAnalyzerIDTN/AAnalisador de Oligonucleotídeos Gratuito 
pcDNA3InvitrogenA-150228
pmaxGFPAmaxaVDF-1012
Poly L-LysineSigma AldrichP8920
Terminal TransferaseSigma Roche#003333574001
Vanadyl Ribonucleoside Complexes NEBS1402S
VectashieldVector Laboratories, Inc. H-1000DAPI dentro da mídia de montagem espalha a luz e reduz o contraste. 
de Cabra de de

Referências

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  1. Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81(2011).
  2. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. Journal of Virology. 88

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Etiquetas

FISH de RNAFISH de RNA duploFISH de RNA com IFIntensidades de Fluoresc ncia QuantitativasMicroscopia ConfocalWestern BlotQPCR

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