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Análise DNAzyme-dependente de rRNA 2 '-O-methylation

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DOI:

10.3791/59700

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16 de setembro de 2019

 , 
1School of Biosciences, University of Birmingham

Neste artigo

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para o clivagem dnazyme-dependente do RNA. Isto permite a análise rápida e local-dependente do RNA 2 '-O-methylation. Esta aproximação pode ser usada para a avaliação preliminar ou principal da atividade do snoRNA.

Resumo

A caixa de guia C/D RNAs nucleolar pequenas (snoRNAs) cataleia 2 '-O-methylation do RNA nuclear ribosomal e pequeno. Entretanto, um grande número de snoRNA em eucariotas mais elevados pode promiscuo reconhecer outras espécies do RNA e 2 '-O-methylate alvos múltiplos. Aqui, nós fornecemos o guia passo-a-passo para a análise rápida e não-caro do site-specific 2 '-O-methylation usando um método bem estabelecido empregando o ADN curto oligonucleotídeos chamado dnazymes. Estes fragmentos do ADN contêm as seqüências catalíticas que Cleave o RNA em posições específicas do consenso, assim como os braços variáveis da homologia que direcionam DNAzyme a seus alvos do RNA. A atividade de dnazyme é inibida por 2-' o-methylation do nucleotide adjacente ao local do clivagem no RNA. Assim, os DNAzymes, limitados somente pelo consenso da seqüência clivada, são ferramentas perfeitas para a análise rápida do RNA 2 '-O-methylation mediado por snoRNA. Nós analisamos o snoRNA snR13-e O 2 '-O-methylation snR47-guiado do RNA ribosomal 25S em Saccharomyces cerevisiae para demonstrar a simplicidade da técnica e para fornecer um protocolo detalhado para o ensaio DNAzyme-dependente.

Introdução

As modificações do RNA jogam papéis importantes na regulação da expressão gênica. RNA 2 '-O-metilação e pseudouridilation, que são guiados por caixa C/D e caixa H/Aca pequenas nucleolar RNAs (snoRNAs), respectivamente, protegem o RNA da degradação e estabilizam suas estruturas de ordem superior1,2,3 . Os alvos do SnoRNA foram identificados principalmente em RNAs ribosomal (rRNA) e em RNAs nucleares pequenas (snRNAs). Entretanto, em eukaryotes mais elevados, há potencial centenas de snoRNA sem funções atribuídas e alguns deles podem reconhecer RNAs Múltiplo1,4,5,6,7. Portanto, métodos que permitam a identificação e análise de modificações guiadas por snoRNA são ferramentas importantes para desvendar mecanismos que regem os processos celulares.

Uma caixa C/D snoRNA-guiada putativo 2 '-O-methylation site pode ser identificado bioinformaticamente e confirmado experimentalmente por muitas técnicas, incluindo RNase H-dirigido clivagem, ou local-específico e genoma-Wide métodos, que empregam transcrição reversa na abordagem de concentração de nucleotídeos baixos (dNTPs)8,9,10,11. Estas técnicas são muito sensíveis, mas também trabalhoso e caro, portanto, pode não ser adequado para o teste inicial ou rápido. Um dos métodos mais simples e de baixo custo para identificar sites de 2 '-O-metilação é a clivagem de RNA dependente de DNAzyme12. Os DNAzymes são moléculas de DNA curtas, únicas e catalisadas, capazes de clivagem endonucleolítica de RNA em posições específicas. Eles consistem em uma seqüência de núcleos conservadas e catalisadora ativa e 5 ' e 3 ' braços de ligação compostos de sequências variáveis projetadas para hibridizar por Watson-Crick base-emparelhamento para o alvo de RNA (Figura 1). Assim, os braços 5 ' e 3 ' entregam a seqüência catalítica ao local específico do RNA. A clivagem dependente de dnazyme é inibida por 2 '-o-methylation do nucleotide posicionado diretamente a montante do local de clivagem12,13. Isto faz dnazymes ferramentas muito práticas para a análise de locais putativo ou conhecidos do RNA 2 '-O-methylation.

Dois tipos de DNAzymes são usados para análises de modificações do RNA12. A sequência ativa de 10-23 DNAzyme (Figura 1a) consiste em 15 nucleotídeos (5 ' RGGCTAGCTACAACGA3 ') que formam um laço em torno do dinucleotídeo de Purina-PIRIMIDINA (Ry) de RNA direcionado e catalisam a clivagem entre esses dois nucleotídeos. O RNA Purina (R) não é base-emparelhado com o dnazyme e os 2 '-o-methylation presentes no dnazyme inibe a clivagem. Os braços de ligação de 10-23 dnazymes são geralmente 10-15 nucleotídeos longo. A segunda classe DNAzyme, 8-17 DNAzymes (Figura 1b) contém 14-nucleotídeo seqüência catalítica (5 ' TCCGAGCCGGACGA3 '). Nucleotides C2, c3 e g4 par com c9 g10 e g11 formando uma estrutura de loop de haste curta. 8-17 dnazymes Cleave RNA a montante de qualquer guanina que é imperfeitamente emparelhado com o primeiro timina da seqüência ativa dnazyme. O nucleotide do RNA a montante do guanina não é base-emparelhado com o dnazyme e seu 2 '-o-methylation prejudica o clivagem. 8-17 dnazymes exigem mais braços homologia de cerca de 20 nucleotídeos para direcionar dnazyme para sua seqüência específica.

Aqui, nós fornecemos um protocolo passo-a-passo para a análise de 2 '-O-methylation de rRNA em Saccharomyces cerevisiae usando 10-23 e 8-17 dnazyme-dependente aproximações12,13 (Figura 1C). Este protocolo pode facilmente ser adaptado para outros organismos e espécies do RNA e empregado para as análises rápidas, preliminares ou principais do RNA 2 '-O-methylation local-específico.

Protocolo

1. cepas, mídia e receitas de buffer

  1. Prepare o fermento (S. cerevisiae) mídia como detalhado aqui: YP (1% w/v extrato de levedura, 2% w/v bacteriológico peptona), e glicose e galactose estoques em 20% w/v.
  2. Prepare o acetato de sódio (NaAc)-tampão EDTA (AE) conforme detalhado aqui: 50 mM NaAc pH 5,3 e 10 mM EDTA.
  3. Prepare 10-23 buffer de incubação DNAzyme 4x como detalhado aqui: 24 mM TRIS pH 8,0, 60 mM NaCl e 10-23 DNAzyme 4x buffer de reação: 200 mM TRIS pH 8,0 e 600 mM NaCl.
  4. Prepare 8-17 DNAzyme 2x reação tampão como detalhado aqui: 200 mM KCl, 800 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7,0, 15 mM MgCl2e 15 mm MNCL2.
  5. Prepare 10x MOPS buffer conforme detalhado aqui: 200 mM MOPS, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA; pH 7,0 e 1.5 x amostra Denaturing buffer: 50% v/v formamide, 20% v/v formaldeído, 1.5 x MOPS buffer.
  6. Obter cepas de S. cerevisiae , BY4741 (mata His3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0); GAL1:: SNR13 (como BY4741 mas GAL1:: SNR13: KANmX); GAL1:: SNR47 (como BY4741 mas GAL1:: SNR47: HIS3mX). Qualquer outra cepa de levedura pode ser usada para esta análise.

2. DNAzyme design

  1. Encontre a seqüência do RNA do local do metilação do interesse ou do putativo usando uma base de dados apropriada. Para alvos do snoRNA de S. cerevisiae , use a base de dados do snoRNA do fermento: http://People.Biochem.UMass.edu/fournierlab/snornadb/masterTable.php14
  2. Para encontrar o local do metilação do interesse, por exemplo, local snR13-dependent, seleto "snR13" e anote a posição do nucleotide modificado (por exemplo, snR13-guiado a2281 em 25s rRNA).
  3. Encontre sequências upstream e downstream do nucleotídeo modificado usando o banco de dados apropriado. Para S. cerevisiae, use o banco de dados do genoma Saccharomyces: https://www.yeastgenome.org/
  4. Procure o nome do gene alvo por exemplo, RDN25 (codificação 25S rRNA).
  5. Na guia "sequência", selecione 10-15 nucleotídeos upstream (5 ' ARM) e downstream (3 ' ARM) do local de metilação ao usar um ensaio de dnazyme 10-23 e 20 nucleotídeos upstream (5 ' ARM) e downstream (3 ' ARM) do local de metilação para um dnazyme 8-17.
  6. Criar sequências complementares de 5 ' e 3 ' braços.
  7. Flanco 10-23 ou 8-17 seqüência catalítica DNAzyme com sequências complementares de 5 ' e 3 ' braços.
  8. Ordem DNAzyme como um oligonucleotide normal do ADN do fornecedor.

3. S. cerevisiae condições de crescimento

Nota: Foram utilizados derivados de estirpe S. cerevisiae BY4741, nos quais a expressão de um snoRNA SNR13 ou SNR47 é conduzida do promotor GAL1 induzível. A fim induzir ou inibir sua síntese, cresça pilhas no meio que contem o galactose (transcriçãoGAL1-dependent sobre) ou a glicose (transcriçãoGAL1-dependente fora). Como um controle, use o tipo selvagem estirpe (BY4741) crescido no galactose ou na glicose.

  1. Cresça cepas de levedura em um meio apropriado e condições. Para analisar GAL1:: SNR13 e GAL1:: SNR47 cepas, bem como a estirpe de tipo selvagem isogênico, crescem células em 50 ml de mídia YP com glicose a 2% (YPD) ou galactose (ypgal) a 30 ° c para a fase exponencial média.
  2. Células centrífugas a 1.000 x g, por 3 min a 4 ° c.
  3. Descarte o sobrenadante e mantenha as pelotas.
  4. Congele pelotas da pilha no nitrogênio líquido e armazene-os em-80 ° c.
    Atenção: O nitrogênio líquido pode causar queimaduras criogênicas graves. Sempre use roupas protetoras e precauções de segurança do exercício.
    Nota: As pelotas da pilha podem ser armazenadas em-80 ° c até 1 mês. O protocolo pode ser pausado aqui, se necessário.

4. isolamento do RNA15

Nota: Use o método mais apropriado para isolar o RNA. Para o fermento S. cerevisiae, a extração do RNA do quente-fenol pode ser usada.

  1. Adicionar 1 mL de água gelada, ressuscita as pelotas e transferir células ressuscipended para 1,5 mL de microtubos.
  2. Centrifugue a 20.000 x g por 10 s a 4 ° c e retire o sobrenadante.
  3. Adicionar 400 μL de tampão AE e suspender as células.
    Nota: Os passos 4.4-4.15 são realizados à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.
  4. Adicionar 40 μL de SDS a 10% e 400 μL de fenol ácido (pH 4,5).
    Atenção: O fenol é tóxico e deve ser manuseado uma capa de fumaça. Sempre use um jaleco, luvas protetoras e óculos ao trabalhar com fenol. Descarte os resíduos de acordo com os regulamentos institucionais.
  5. Misture bem por vortexing para 20 s.
  6. Incubar a 65 ° c durante 10 min. A cada 2 min, gentilmente abrir e fechar o tubo para liberar a pressão e virar o tubo 2-3 vezes para misturar as fases.
  7. Transfira os tubos para-80 ° c e incubar durante 10 min.
  8. Descongelar os tubos no banco e centrifugar a 20.000 x g, durante 5 min à temperatura ambiente.
  9. Transfira a fase superior para um novo tubo contendo 400 μL de fenol ácido: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1). Não interrompa a interfase.
    Atenção: Clorofórmio é tóxico e deve ser manuseado uma capa de fumaça. Sempre use um jaleco, luvas protetoras e óculos ao trabalhar com clorofórmio. Descarte os resíduos de acordo com as regulamentações institucionais.
  10. Misture bem por vortexing para 30 s e Centrifugue a 20.000 x g por 10 min à temperatura ambiente.
  11. Transfira a fase superior (~ 400 μL) para um novo tubo contendo 400 μL de clorofórmio.
  12. Misture bem por vortexing para 30 s e Centrifugue a 20.000 x g por 5 min à temperatura ambiente.
  13. Transfira a fase superior (~ 300-350 μL) para um novo tubo contendo 1 mL de EtOH e 40 μL de acetato de amónio 7,5 M (NH4AC). Misture lançando o tubo algumas vezes.
  14. Incubar a-80 ° c durante 2 h ou durante a noite a-20 ° c.
    Nota: O procedimento pode ser pausado aqui.
  15. Centrifugador em 20.000 x g, para 10 minutos em 4 ° c. Uma pequena pelota de RNA branca se tornará visível na parte inferior do tubo.
  16. Retire o EtOH introduzindo pipetagem para evitar perturbar o pellet.
  17. Adicionar 1 mL de 70% de EtOH e centrifugar a 20.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
  18. Remover 70% EtOH por pipetagem.
  19. Centrifugue a 20.000 x g por 15 s e retire o EtOH remanescente com 2-20 μL de pipeta.
  20. Deixe o tubo aberto no banco por 5 min para secar a pelota do RNA.
    Nota: A pelota do RNA muda sua cor do branco para transparente quando seco.
  21. Ressuscitem a pelota do RNA em 30 μL de RNase/DNase-livre H2o, transfira o tubo imediatamente no gelo e meça a concentração do RNA no microespectrofotômetro.
  22. Congelar as amostras a-20 ° c.
    Nota: O RNA pode ser armazenado em-20 ° c até 1 mês e em-80 ° c até 1 ano. O procedimento pode ser pausado aqui ou prosseguiu diretamente para a próxima etapa.

5. DNAzyme digestão

  1. 10-23 digestão de DNAzyme
    1. Em tubos de 1,5 mL Prepare uma mistura de incubação combinando 5 μg de RNA, 200 pmol de 10-23 DNAzyme (2 μL de solução de estoque de 100 mM) e 2,5 μL de tampão de incubação de 4x 10-23 em um volume total de 10 μL. Mantenha os tubos no gelo.
    2. Transfira os tubos para um bloco de calor seco fixado em 95 ° c e incubar durante 3 min.
    3. Transfira os tubos imediatamente no gelo e incubar por 5 min.
    4. Gire brevemente e coloque os tubos de volta no gelo.
    5. Adicionar 20 U de inibidor de RNase (por exemplo, 0,5 μL de inibidor de RiboLock RNase).
    6. Coloque os tubos em um bloco de calor seco definido para 25 ° c e incubar por 10 min.
    7. Enquanto isso, prepare uma mistura de reação em um tubo de 1,5 μL combinando 5 μL de tampão de reação 4x 10-23 com 4 μL de 300 mM MgCl2 e 1 μl H2o. Coloque o tubo em um bloco seco definido como 37 ° c.
    8. Transfira a mistura de incubação para um bloco de calor seco definido para 37 ° c e adicione 10 μL de mistura de reacção pré-aquecida.
    9. Incubar a reacção a 37 ° c durante 1 h.
    10. Transfira os tubos no gelo e avance para o passo 5.3.1.
  2. 8-17 digestão de DNAzyme
    1. Prepare um microtubo de 1,5 mL com 5 μg de RNA num volume total de 6 μL. Mantenha o tubo no gelo.
    2. Prepare um microtubo de 1,5 mL com 400 pmol de 8-17 DNAzyme (4 μL de uma bolsa de 100 mM). Mantenha o tubo no gelo.
    3. Transfira os tubos para um bloco de calor seco definido para 95 ° c e incubar durante 2 min.
    4. Mova a amostra de RNA no gelo.
    5. Gire o tubo com DNAzyme por 5 s e incubar a 25 ° c por 10 min.
    6. Ao mesmo tempo, prepare um tubo de 1,5 mL com 10 μL de 2x 8-17 amortecedor de reacção e incubar a 25 ° c.
    7. Prepare uma mistura de reacção adicionando 10 μL de tampão de reacção 2x pré-aquecido ao tubo com DNAzyme.
    8. Transfira 14 μL da mistura de reacção para o tubo com RNA e adicione 20 U de inibidor de RNase.
    9. Incubar a reacção a 25 ° c durante 2 h.
    10. Transfira o tubo no gelo e prossiga para a purificação do RNA (passo 5.3.1).
  3. Purificação do RNA
    1. Adicionar 350 μL de água e 400 μL de clorofórmio ao tubo de reacção, misturar bem por vortexing por 30 s e centrifugar a 20.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
    2. Transfira a fase superior (~ 300-350 μL) para um novo tubo contendo 1 mL de EtOH, 40 μL de 7,5 M NH4AC e 1 μL de glicogênio (10 μg/μL). Misture lançando o tubo algumas vezes.
    3. Incubar a-80 ° c durante 2 h ou durante a noite a-20 ° c.
      Nota: O procedimento pode ser pausado aqui.
    4. Repita os passos de 4,15 para 4,21.
    5. Ressuscitem a pelota do RNA em 10 μL de RNase/DNase-livre H2o e transfira os tubos imediatamente no gelo.
    6. Congelar as amostras a-20 ° c.
      Nota: O RNA pode ser armazenado em-20 ° c até um mês e em-80 ° c até 1 ano. O procedimento pode ser pausado aqui ou proceder à eletroforese de RNA.

6. electroforese do RNA

  1. Pulverize o equipamento da electroforese (tanque, bandeja, pente) com SDS de 1%, deixe por 15 minutos e enxague com abundância de ddH2O.
  2. Dissolver 1,5 g de agarose em 127,5 mL de ddH2o aquecendo-o no microondas.
  3. Adicione 15 mL de MOPS 10x e 7,5 mL de formaldeído 37% à solução de agarose (o volume total é de 150 mL).
    Atenção: O formaldehyde é tóxico e deve ser segurado uma capa das emanações. Sempre use um jaleco, luvas protetoras e óculos ao trabalhar com formaldeído. Descarte os resíduos de acordo com as regulamentações institucionais.
  4. Adicione uma quantidade apropriada de uma mancha do gel da escolha à solução do agarose (por exemplo, 15 μL da mancha segura do gel do ADN de SYBR). Misture bem e despeje o agarose para a bandeja.
  5. Insira um pente no gel imediatamente.
  6. Deixe-o por 45 min a capa das emanações. Cubra a bandeja com folha de alumínio ao usar uma mancha de gel sensível à luz.
  7. Prepare 600 mL de tampão de 1x MOPS.
  8. Preparação da amostra de RNA
    1. Num tubo de 1,5 mL, combine 10 μL da amostra de RNA digerida e purificada, 5 μL de tampão de desnaturação de amostra e 0,5 μL de corante de carregamento de 6x.
      Atenção: A formamida é tóxica e deve ser manuseada uma capa de fumaça. Sempre use um jaleco, luvas protetoras e óculos ao trabalhar com formamida. Descarte os resíduos de acordo com as regulamentações institucionais.
    2. Incubar amostras de RNA a 70 ° c durante 5 min. Transfira as amostras no gelo. Incubar por 5 min.
    3. Gire brevemente antes de carregar o gel.
  9. Põr o gel no tanque da electroforese e encha-o com o amortecedor de 1x MOPS. Carregue todo o volume de cada amostra (15 μL) no gel. Funcione em 80 V até que o azul do bromofenol alcangue 2/3 do comprimento do gel.
  10. Imagem o gel usando um Imager apropriado para detectar a mancha escolhida do gel (por exemplo, transilluminator UV).

Resultados

A utilidade da clivagem dependente de DNAzyme na análise de modificações do rRNA foi mostrada recentemente no contexto da maturação13de snoRNAs. O ensaio DNAzyme-dependente foi utilizado para demonstrar que a falta de 5 '-End pre-snoRNA processamento afeta 2 '-O-metilação níveis de 25S e 18S rRNA em s. cerevisiae13.

Aqui, utilizamos um sistema de transcrição de snoRNA induzível para demonstrar a eficácia e a simplicidade da técnica. A caixa C/D snR13 guia a metilação em duas posições no rRNA 25S, incluindo a adenina 2281 (Figura 2a). Este nucleotide é seguido pelo uracil, que constitui o dinucleotídeo do consenso (Ry) ligante por um dnazyme 10-23. A caixa C/D snR47 também orienta a metilação de dois nucleotídeos em rRNA 25S (Figura 2b). A adenina na posição 2220 é seguida por um resíduo de guanina e este dinucleotídeo pode ser clivada por um DNAzyme 8-17. A fim induzir ou inibir a síntese de snR13 ou de snR47 snoRNA, nós inserimos o promotor GAL1 induzível a montante de genes de snR13 ou de snR47 e de pilhas cultivadas no meio que contem o galactose (GAL1-Dependent transcrição) ou glicose (GAL1-dependente transcrição off). Em seguida, o RNA isolado de GAL1:: SNR13 as pilhas foram incubadas com o dnazyme 10-23 projetado para Cleave 25s rRNA no local SNR13-dependent, entre nucleotídeos 2281 e 2282 (Figura 2C). O RNA da cepa GAL1:: SNR47 foi tratado com 8-17 DNAzyme visando o local SNR47-dependente entre os nucleotídeos 2220 e 2221 (Figura 2D). Como um controle, o RNA da estirpe do selvagem-tipo BY4741 que cresce no galactose ou na glicose foi incubado com ambos os DNAzymes. A electroforese do RNA DNAzyme-Tratado revelou que 25S rRNA extraído de GAL1:: SNR13 e GAL1:: as estirpes SNR47 que crescem na galactose (GAL) permaneceram intactas (Figura 3a,B; faixas 3). Ao contrário, o RNA isolado de GAL1:: SNR13 e GAL1:: SNR47 as células que crescem na glicose (GLC) foram digeridas pelos respectivos dnazymes (Figura 3a, B; pistas 4). Em ambos os casos, a faixa de 25s rRNA diminuiu e 5 ' e 3 ' cut-off clivagem produtos (a e B) foram observados. Isso indica que nas cepas GAL1:: SNR13 e GAL1:: SNR47 , O rRNA 25s foi 2 '-O-metilado em sítios SNR13 ou SNR47-guiados quando a galactose foi usada como fonte de carbono e estes snoRNA foram expressos. A falta do metilação do rRNA 25s quando a expressão de snR13 ou de snR47 foi desligada na glicose permitida para o clivagem dnazyme-dependente. Nenhuma digestão do RNA foi observada para o selvagem-tipo amostras (Figura 3a,B; pistas 1 e 2), porque a expressão de snR13 e de snR47 é galactose/glicose-independente nesta tensão. Conseqüentemente, o rRNA foi misturado normalmente e assim resistente à atividade de dnazymes.

No geral, nosso experimento mostra que a atividade de clivagem de 10-23 (Figura 3a) e 8-17 (Figura 3B) dnazymes correlacionou-se com a ausência de caixa C/D snR13 ou snR47, indicando claramente que esses snoRNA são responsáveis por 25s rRNA 2 '-O-methylation em locais particulares.

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Figura 1: DNAzymes e seus substratos de RNA. (A) 10-23 DNAzymes Cleave um dinucleotide do RNA do purine-pyrimidine (Ry). R no RNA não é emparelhado com DNAzyme, enquanto Y é complementar à base de R no DNAzyme. A metilação da purina (R) no RNA suprime a clivagem dependente de DNAzyme. (B) 8-17 dnazymes Cleave RNA a montante da guanina que é imperfeitamente emparelhado com o primeiro timina na seqüência catalítica de dnazyme. O nucleotídeo que precede a guanina não é emparelhado e sua metilação protege da clivagem dependente de DNAzyme. O RNA é mostrado no cinza (aparte do local do metilação), dnazyme é mostrado no roxo. N = qualquer nucleotídeo, R = Purina: adenina ou guanina, Y = pirimidina: citosina ou uracil; CH3-denota metilação de RNA. O emparelhamento base dentro das sequências ativas do DNAzyme é marcado por linhas pontilhadas. Um raio azul marca o local da segmentação. (C) um fluxograma mostrando as etapas de uma análise dependente de DNAzyme. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: dnazymes segmentação snR13-e snR47-dependente metilação sites em 25s rRNA. (A, B) Capturas de tela do navegador mostrando snR13 dependentes (a) e snR47-dependentes (B) locais de metilação em 25s rRNA (C) 25s rRNA seqüência circundante snR13-dependente site de metilação (a2281) e 10-23 dnazyme (mostrado em roxo) projetado para Cleave RNA entre A2281 e U2282. Um2281 não é emparelhado com o dnazyme enquanto U2282 forma um par com o primeiro nucleotídeo da seqüência ativa dnazyme (marcada por uma linha azul). Um raio azul marca a clivagem. (D) seqüência do rRNA 25s que circunda o local snR47-dependent do metilação (a2220) e o 8-17 dnazyme (mostrado no roxo) projetados para Cleave o RNA entre uns2220 e G2221. A2220 não é hibridizada com o dnazyme enquanto G2221 é imperfeitamente emparelhado com timina (denotado com uma linha tracejadas). Um raio azul marca o local da segmentação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: análise de 2 '-O-methylation local-específico do rRNA 25S usando o ensaio 10-23 e 8-17 DNAzyme-dependente. (A) análise do metilação snR13-dependent do rRNA 25s usando o dnazyme 10-23. (B) análise do metilação snR47-dependent do rRNA 25s usando o dnazyme 8-17. O RNA foi visualizado manchando em um gel desnaturação do agarose. Os produtos de clivagem A e B são marcados por setas vermelhas. WT = estirpe do tipo selvagem; GAL = galactose, GLC = glicose. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A digestão dependente de dnazyme pode ser usada como um método simples e rápido para analisar o RNA 2 '-O-methylation local-específico12,13. DNAzymes Cleave RNA se o nucleotídeo a montante do local de clivagem não é metilado. Em contraste com outras abordagens, incluindo a digestão dirigida por RNase H, degradação alcalina ou transcrição reversa em baixa concentração de nucleotídeos seguida de PCR quantitativo ou seqüenciamento8,10,11 ,16, a aproximação de dnazyme exige um oligonucleotide simples do ADN e uns reagentes básicos que estejam atuais em todo o laboratório molecular da biologia. Além disso, DNAzymes pode ser usado em uma maneira similar para analisar o pseudouridylation do RNA negociado pela caixa H/ACA snoRNA12, que os faz ferramentas versáteis em estudar alvos do snoRNA.

As abordagens dependentes de DNAzyme são limitadas apenas por sequências de consenso do site de clivagem17. 10-23 DNAzymes pode ser usado para analisar 2 '-O-metilação apenas na posição R do dinucleotídeo RY, enquanto 8-17 DNAzymes reconhecem a modificação do nucleotídeo localizado a montante da guanina. Como resultado, modificações como 2 '-o-metilação do primeiro nucleotídeo nos dinucleotídeos guanina-adenina (GA), adenina-adenina (AA), pirimidina-adenina (ya) e pirimidina-pirimidina (YY) não podem ser analisadas. Além disso, deve-se considerar a baixa eficiência da clivagem dependente de DNAzyme12 . Embora alguns DNAzymes cliquem RNA quase completamente (Figura 3B), muitos dnazymes apenas parcialmente digerem seus alvos (Figura 3B). A eficiência pode depender da seqüência em torno do site clivagem. Por exemplo, as regiões do RNA com trechos do mesmo nucleotide podem afetar o posicionamento correto da seqüência ativa de DNAzyme. Além disso, as regiões do RNA que formam a estrutura secundária forte podem re-hybridize e suprimir a ligação de DNAzyme à seqüência do alvo. Para superar essas questões, ciclos de aquecimento e resfriamento do 10-23 DNAzyme e seu substrato de RNA podem ser aplicados18.

Nós usamos a aproximação de DNAzyme para investigar 2 '-O-methylation do rRNA. Um pode igualmente usar esta técnica para analisar outras modificações do RNA, tais como N6methyladenosine19. O RNA ribossomal, devido a sua abundância, pode ser analisado pela electroforese e os produtos do clivagem podem ser visualizados a luz UV. Entretanto, isto não é aplicável para RNAs menos abundantes como RNAs da codificação do RNA polymerase II-generated (mRNA) e RNAs não-codificando (ncRNA). Estes RNAs não podem geralmente ser detectados diretamente pelo RNA que mancha em géis do Agarose ou do poliacrilamida. Em tais casos, a segmentação DNAzyme-dependente pode ser visualizada pela mancha do Norte, detectada indiretamente pelo PCR/PCR quantitativo ou ser analisada pelo PCR quantitativo com polymerases (por exemplo, ADN polymerase de KlenTaq) capaz de discriminar O RNA 2 ′-O-methylated de RNA unmethylated20,21.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a Maya Wilson e a Aneika leney pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um Sir Henry Dale Fellowship financiado conjuntamente pelo Wellcome Trust e da sociedade real (200473/Z/16/Z).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Produtos químicos
Ácido fenolSIGMAP4682
AgaroseVWRA2114
Acetato de amônioSIGMAA1542
Clorograma Fisher scientific10293850
Água livre de DNase/RNaseFischer Scientific10526945
DNAzymeIntegrated DNA TechnologyCustom oligo DNA
EDTASIGMAE9884
Etanol AbsolutoFisher científico10437341
FormaldeídoSigmaF8775
FormamidasigmaF9037
GalactoseSIGMAG0750
Corante de carregamento de gelThermo Fisher ScientificR0611
GlicoseSIGMAG7021
GlicogênioThermo Fisher ScientificR0561
HEPESSIGMAH3375
IsoamilSIGMAW205702
KClSIGMAP9333
MgCl2SIGMAM8266
MnCl2SIGMA244589
MOPSSIGMAM1254
NaClSIGMAS7653
Oxóide Peptona BacteriológicaThermo Fisher ScientificLP0037
Extrato de Levedura Oxóide em PóThermo Fisher ScientificLP0021
RiboLock RNase Inibidor (40 U/µ L)Thermo Fisher ScientificEO0382
SDSSIGMA74255
Acetato de sódio trihidratadoSIGMAS8625
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102
Base TrisSIGMATRIS-RO
strong>NomeEmpresa Número de CatálogoComentários
Equipamento
1.5 mL microtubosSarstedt
152VR5C01M -80° C freezerThermo Fisher Scientific
250 mL Frascos ErlenmeyerCole-Parmer
50 mL tubos cônicosSarstedt
Combicup VX200 vórticeAppleton Woods
DS-11 MicroespectrofotômetroDenovix
Câmara de eletroforese (bandeja de 20 cm)SIGMA
Medidor de pH FiveEasy F20Appleton Woods Sistema de
documentação de gelMicrocentrífuga Syngene
Heraeus Fresco 21 CentrífugaFisher Scientific
Megafuge 8R com rotador adequado para tubos cônicos de 50 mLFisher Scientific
Mini Fuge PlusStarlab
Misturador HC bloco térmicoStarlab
OLS26 Banho de água agitatórioGrant
PowerPac fornecedor de energiaBioRad
< Mini centrífuga

Referências

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