Aqui, nós apresentamos diversos métodos simples para avaliar a viabilidade e a morte em spheroids da pilha de cancro 3D, que imitam os gradientes physico-químicos de tumores in vivo muito melhor do que a cultura 2D. O modelo esferóide, portanto, permite a avaliação da eficácia do câncer de drogas com melhor tradução para as condições in vivo.
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Artigo de método
Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os esferoides tridimensionais de pilhas de cancro são ferramentas importantes para telas da droga do cancro e para ganhar a introspecção mecanicista na biologia da pilha de cancro. O poder desta preparação encontra-se em sua habilidade de imitar muitos aspectos das condições in vivo dos tumores ao ser rápido, barato, e versátil bastante permitir a seleção relativamente high-throughput. As condições da cultura esferóide podem recapitular os gradientes físico-químicos em um tumor, incluindo a crescente acidez extracelular, o aumento do lactato e a diminuição da disponibilidade de glicose e oxigênio, da periferia esferóide ao seu núcleo. Também, as propriedades mecânicas e as interações Cell-Cell de tumores in vivo são em parte imitada por este modelo. As propriedades específicas e, consequentemente, as condições ideais de crescimento, de esferóides 3D, diferem amplamente entre diferentes tipos de células cancerosas. Além disso, a avaliação da viabilidade celular e morte em esferóides 3D requer métodos que diferem em parte daqueles empregados para culturas 2D. Aqui nós descrevemos diversos protocolos para preparar esferoides 3D de pilhas de cancro, e para usar tais culturas para avaliar a viabilidade e a morte da pilha no contexto de avaliar a eficácia de drogas anticâncer.
Introdução
O uso de modelos de esferóide multicelular na biologia do câncer é de várias décadas1,2, mas ganhou um impulso substancial nos últimos anos. Em grande parte, isso reflete o aumento da consciência de quão fortemente o fenótipo das células cancerosas é dependente do seu microambiente e condições de crescimento específicas. O microambiente em tumores sólidos é fundamentalmente diferente do que nos tecidos normais correspondentes. Isso inclui condições físico-químicas como pH, tensão de oxigênio, bem como pressão intersticial, gradientes de concentração de fatores solúveis, como nutrientes, resíduos e compostos de....
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Protocolo
1. geração de spheroids
- Preparando suspensões de células para formação de esferóides
Nota: as linhas celulares diferentes têm propriedades de adesão muito diferentes e o protocolo de formação de esferóide mais adequado deve ser estabelecido em cada caso. Nós encontramos que as pilhas de MCF-7 e de bxpc-3 são apropriadas para a formação esferóide espontânea, quando MDA-MB-231, skbr-3, Panc-1 e miapaca exigirem a adição de membrana reconstituída do porão para dar forma com sucesso a spheroids. Somente as pilhas de MDA-MB-231 e de BxPC-3 foram empregadas para o protocolo de gota de suspensão, porém outras linhas de pilha são certamente aplic....
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Resultados
Os ensaios de crescimento esferóide com base no protocolo de formação esferóide, ilustrados esquematicamente na Figura 1A e na Figura 1B, foram utilizados como ponto de partida para análise dos efeitos de tratamentos medicamentoso anticancerígenos em um tumor 3D imitando o ajuste. A facilidade com que os esferoides são formados é a linha celular específica, e algumas linhas celulares necessitam de suplementação com RBM, a fim de.......
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Discussão
O uso de esferoides da pilha do cancro 3D provou uma ferramenta valiosa e versátil não somente para a seleção anticâncer da droga, mas igualmente para ganhar a introspecção mecanicista na regulação da morte e da viabilidade da pilha de cancro as circunstâncias que imitam aquelas no tumor microambiente. Isto é particularmente crucial porque a acessibilidade, a captação celular, e os efeitos intracelular de drogas quimioterapêuticas são impactados profundamente pelas condições físico-químicas no tumor, incluindo o pH, a te.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflito de interesses.
Agradecimentos
Agradecemos a Katrine Franklin Mark e Annette Bartels pela excelente assistência técnica e pela Asbjørn Nøhr-Nielsen para realizar os experimentos na figura 1D. Este trabalho foi financiado pela Fundação Einar willumsen, pela Fundação Novo Nordisk e pela Fondation Juchum (tudo para SFP).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-(4-amidiminofenil)-1H-indol-6-carboxamidina (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | Para coloração de núcleos |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Componente no tratamento quimioterápico |
| 5-(N-etil-isopropil) amilorida (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inibidor do anticorpo NHE1 |
| contra PARP e sinalização celular cPARP | #9542 | Usado em western blotting | |
| Anticorpo contra sinalização celular Ki-67 | 9449 | Usado para IHC | |
| Anticorpo contra a | sinalização celular | #2524 | Usado para IHC |
| Anticorpo contra β-actina | Sigma | A5441 | Usado em western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Usado para preparação de gel de agarose |
| Escada de proteína de referência | Invitrogen | #10747-012 | Usado para SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Usado para determinação de proteínas a partir de lisados |
| Bü câmara rker | Marienfeld | 610311 | Para contagem de células |
| Microscópio de epifluorescência BX63 | Olympus | Usado para imagens fluorescentes | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Usado para o ensaio de viabilidade celular |
| Cisplatina | Sigma-Aldrich | #P4394 | Componente no tratamento quimioterápico |
| Microplaca Corning Spheroid, 96 poços, Preto com fundo redondo transparente, Fixação ultra-baixa, Com tampa, Estéril | Corning | #4520 | Usado para o crescimento de esferoides com medições de luminescência como ponto final |
| Corning 96 bem, fundo redondo claro, Microplaca de fixação ultrabaixa, Com tampa, Estéril | Corning | #7007 | Suficiente para o crescimento esferóide sem medições de luminescência como ponto final |
| Criterion TGX Géis Pré-fabricados | Bio-Rad | 5671025 | Utilizado para SDS-PAGE |
| Doxorrubicina | Abcam | #120629 | Componente no tratamento quimioterápico |
| FLUOStar Optima Leitor de microplacas | BMG Labtech | Usado para gravação de luminescência | |
| Formaldeído | VWR Chemicals | #9713.1000 | Usado para fixação celular |
| Geltrex LDEV-Free Fator de Crescimento Reduzido Basement Membrane | Matrix Gibco | #A1413202 | Mantenha em 4 ° C para evitar a solidificação. Referido como rBM no protocolo. |
| Soro FBS Sigma#F9665 inativado por calor | para meio de crescimento | ||
| ImageJ | NIH | Análise de imagem científica | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Usado para armazenamento de esferoides incorporados |
| Mini comprimidos de coquetel inibidores de protease | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Usado para preparação de tampão de lise |
| Microscópio MZ16 | Leica | Usado para imagens microscópicas de luz | |
| NuPAGE LDS 4x Buffer de Amostra | Invitrogen | #NP0007 | Usado para western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Usado para western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Usado para coloração de banda de proteína |
| Prism 6.0 | Graphpad | Gráfico científico e software estatístico | |
| Iodeto de propídio (solução de 1mg/ml em água) | Invitrogen | P3566 | Sensível à luz |
| Reservatórios estéreis, multicanal | SPL lifesciences | 21002 | Usado para semear células para formação de esferoides |
| Superfrost Ultra-Plus Slide de adesão | Menzel-Glä ser | #J3800AMNZ | Lâmina de vidro do microscópio usada para encaixar |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Usado como tratamento quimioterápico |
| Trans-blot Turbo 0,2 e micro; m membranas de nitrocelulose | Bio-Rad | #170-4159 | Usado para western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Usado para solução SDS-PAGE |
| Tripsina-EDTA | Sigma | #T4174 | Enzima de dissociação celular |
Referências
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen....
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Reimpressões e permissões
