Usando larvas de zebrafish para estudar as conseqüências patológicas do curso hemorrágico

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para quantificar ferimento de cérebro, deficits do locomotor e neuroinflammation depois do sangramento no cérebro em larvas do zebrafish, no contexto da hemorragia intracerebral humana (ICH).

Abstract

Apesar de ser o subtipo o mais severo do curso com mortalidade global elevada, não há nenhum tratamento específico para pacientes com hemorragia intracerebral (ICH). Modelar o ICH pre-clinicamente provou difícil, e os modelos atuais do roedor pouco recapitulam a natureza espontânea do ICH humano. Portanto, há uma necessidade urgente de metodologias pré-clínicas alternativas para o estudo de mecanismos de doença na ICH e para a descoberta de potenciais fármacos.

O uso de zebrafish representa uma abordagem cada vez mais popular para a pesquisa translacional, principalmente devido a uma série de vantagens que possuem sobre os modelos de doença de mamíferos, incluindo taxas de reprodução prolíficas e transparência larval permitindo ao vivo Imaging. Outros grupos estabeleceram que as larvas do zebrafish podem expor o ICH espontâneo que segue o rompimento genético ou químico do desenvolvimento cerebrovascular. O objetivo desta metodologia é utilizar tais modelos para estudar as conseqüências patológicas da hemorragia cerebral, no contexto da pesquisa pré-clínica de ICH. Usando testes de imagem e motilidade ao vivo, danos cerebrais, neuroinflamação e função locomotora após ICH podem ser avaliados e quantificados.

Este estudo mostra que as conseqüências patológicas chaves da hemorragia do cérebro nos seres humanos são conservadas em larvas do zebrafish que destacam o organismo modelo como um valioso sistema in vivo para a investigação pré-clínica de ICH. O objetivo desta metodologia é possibilitar que a comunidade de AVC pré-clínico empregue o modelo larval de zebrafish como um sistema de modelo complementar alternativo aos roedores.

Introduction

A hemorragia intracerebral (ICH) é o subtipo o mais severo de curso associado com a ruptura espontânea da embarcação cerebral e o sangramento no parênquima que conduz aos danos cerebrais, à inabilidade física e frequentemente à morte¹. Apesar da taxa elevada da mortalidade e da morbosidade associada com o ICH², a compreensão da etiologia subjacente e da patologia do borne-hemorragia é ainda falta. Como tal, não há tratamentos específicos para prevenir a ICH ou melhorar os resultados do paciente. A maioria de nossa compreensão da biologia da doença veio dos modelos pre-Clinical do roedor de Ich³, porém os estudos a-Date nestes modelos não traduzem nenhum terapêutico bem sucedido à clínica^4,5. Esta falha pode ser devida em parte, a algumas limitações destes modelos pré-clínicos, incluindo a incapacidade de facilmente recapitular a natureza espontânea da doença humana e a exigência de cirurgia invasiva para gerar os modelos em mamíferos⁶. Adicionalmente, os roedores colocam problemas práticos com respeito a observar o início rápido de respostas celulares a ICH no tecido intacto. Dada a falta de tradução de modelos de roedores, o desenvolvimento de modelos alternativos de ICH espontâneo é imperativo para superar esses problemas práticos e ajudar a identificar novos alvos de drogas.

Os mecanismos moleculares do desenvolvimento vascular são bem conservados entre os vertebrados, incluindo o zebrafish (Danio rerio)⁷. Como tal, a adoção desse modelo de organismo está se tornando uma estratégia mecanicista cada vez mais útil para o estudo da doença cerebrovascular⁸. Vários modelos de zebrafish foram gerados, que recapitulam os fenótipos associados às condições relacionadas ao AVC^9,10,11,12. O uso de larvas de zebrafish para investigar a patogénese da doença oferece vantagens práticas e científicas sobre modelos mamíferos⁸. Isso inclui altas taxas de reprodução, rápido desenvolvimento e transparência larval que permite a imagem intravital sem as restrições invasivas associadas com roedores. Acoplar estas vantagens com a escala larga de linhas transgênicas do repórter disponíveis dentro da Comunidade da pesquisa do zebrafish atinge uma aproximação in vivo poderosa para estudar a biologia da doença, ainda não utilizada para estudar o patológico consequências da ICH.

A resposta de ferimento ao sangue no cérebro é bifásica¹³; o insulto preliminar causa a morte neuronal e a necrose da pilha, que inicia então uma onda secundária do dano que é induzida pela ativação imune inata. A segunda fase de lesão cerebral, em particular o componente neuroinflamatório, é considerada um alvo realista para o tratamento medicamentoso futuro¹³. Hemorragias espontâneas e cerebrais-específicas têm sido descritas em larvas de zebrafish anteriormente^{14,15,16,17,18,19}. Dois tais modelos são o uso do Atorvastatin (ATV) em 24 h borne-fecundação (HPF) para inibir a biossíntese¹⁴do caminho e do colesterol de hmgcr, e um mutante do Bubblehead (BBH) que expresse uma mutação bloqueia no gene arhgef7 , βpix, e subseqüentemente inibe a remodelação do actina para junções endovascular apertadas¹⁸. Estes modelos exibem a ruptura cerebral-específica espontânea da embarcação de sangue no início da circulação (~ 33 HPF). Recentemente, nós caracterizamos estes modelos mais para revelar que os aspectos chaves da resposta do ferimento de cérebro estão conservados entre seres humanos e larvas do zebrafish²⁰. Este estudo demonstra a metodologia necessária para obter e Visualizar hemorragias cerebrais espontâneas em larvas de zebrafish e como quantificar a lesão cerebral, e fenótipos locomotor e neuroinflamatório que se relacionam com a condição humana. Estes dados e técnicas apoiam o uso desta espécie modelo como um sistema complementar valioso para a pesquisa pre-Clinical de ICH.

Protocol

Zebrafish foi levantado e mantido na unidade de serviços biológicos da Universidade de Manchester circunstâncias padrão como descrito previamente²¹. O pecuária adulto do zebrafish foi aprovado pelo bem-estar animal da Universidade de Manchester e pela placa ética da revisão. Todos os experimentos foram realizados de acordo com os regulamentos do Home Office do Reino Unido (PPL: P132EB6D7).

Nota: as linhas transgênicas utilizadas neste estudo incluem a linhagem específica de macrófago MPEG1:mcherry (construído em casa como descrito anteriormente²²), MPOneutrofínico-específico: GFP²³,eritroide-específico GATA1: dsred²⁴ e Ubiq:secanexinv-mvenus, um repórter para morte celular (re-derivado na casa²⁵)em Wild-Type, nacre (mitfa^W2/W2) e Mutant (BBH^M292) backgrounds. A Figura 1 mostra a linha do tempo experimental.

Figura 1 : Gráfico do cronograma experimental para caracterizar lesões cerebrais, locomotoras e resultados neuroinflamatórios. ICH, hemorragia intracerebral; BBH, Bubblehead. A figura foi reproduzida a partir de Crilly et al.²⁰ com permissão uma licença Creative Commons. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

1. dia 0: produção e coleta de ovos

1. Colete embriões fertilizados de desova natural em caixas genealógicos produzidas a partir de 1 homem e 1-2 zebrafish adulto feminino.
   Nota: para o protocolo do Atorvastatin qualquer wildtype/animais transgenic pode ser usado entretanto as taxas da hemorragia diferem ligeiramente entre tensões.
2. Incubar 100 embriões a 28 ° c em meio de embrião padrão E3 por prato de Petri e estágio de acordo com as diretrizes padrão²⁶.
3. Em ~ 6 horas após a fertilização (HPF) remover embriões mortos e não fertilizados do prato usando uma pipeta Pasteur.

2. dia 1: tratamento com atorvastatina a 24 HPF

1. Embriões dechorionados para tratamento com atorvastatina utilizando pinça de dissecção ultra fina afiada²⁷. Os números exigidos para a experimentação podem ser ajustados conformemente.
2. Adicione 30 mL de meio de embrião E3 a dois pratos de Petri limpos. Use um prato para 100 embriões.
   Nota: se as placas são projetadas para a cultura da pilha, o zebrafish dechorionated neste estágio adiantado fure frequentemente à parte inferior. Para evitar isso, lave as placas cuidadosamente em água limpa antes de usar.
3. Remover 60 μL de água embrionária da placa de tratamento e adicionar 60 μL de 0,5 mM de atorvastatina (ATV). Em uma concentração de estoque de 0,5 mM, a diluição acima resultará em uma concentração final de 1 μM, o que resultará em ~ 20% das larvas sem hemorragia (ICH-) e ~ 80% das larvas com hemorragia (ICH +). Use a outra placa para controles não tratados
   Observação: a atorvastatina é solubilizada em água destilada (3 mg em 10 mL) para fazer uma solução de estoque de 0,5 mM. Incubar durante a noite em temperatura ambiente no escuro com agitação como solubilização leva algum tempo. A solubilização completa pode demorar até 1 semana. Não use DMSO. A solução é aliquotada e armazenada a-20 ° c. Não congelar degelo.
4. Usando uma pipeta de Pasteur, transfira 100 embriões em tão pouca água como possível às placas do tratamento.
5. Incubar as placas a 28 ° c.
   Nota: ICH ocorrerá entre 33 e 48 HPF. Atorvastatin não precisa ser removido como incubação mais de 24 h não causa quaisquer problemas de desenvolvimento.

3. dia 2: separando as populações ICH-e ICH + em 50 HPF

1. Separe os peixes ICH + da ICH-populações e transfira para novos pratos para facilitar.
   1. Se estiver usando o modelo ATV em uma concentração de 1 μM, 75-100% das larvas exibirão hemorragia (ICH +) neste momento.
      Nota: a resposta das larvas difere entre as cepas, se as larvas não estão sangrando nas frequências desejadas, use um lote fresco de atorvastatina ou uma concentração mais alta. Se as larvas não exibiram a hemorragia por 48 HPF então consideram-nas ICH-.
   2. Se estiver usando o modelo BBH, todos os mutantes homozygous exibirão a hemorragia por 48 HPF. Se usando um incross heterozygous, o Ich-os irmãos heterozygous e do tipo selvagem podem ser usados como animais do controle para experiências.
2. Se necessário, anestesialize as larvas adicionando 0, 2% MS222 à mídia E3. Usando uma pipeta de Pasteur, classifique as larvas para a presença de sangue na cabeça na mídia nova da E3. Consulte a Figura 2.
   Nota: sangue na cabeça pode aparecer na frente, meados ou rombencéfalo ou em combinação, e o volume de sangramento pode variar entre os animais. Nos mutantes BBH, ICH é freqüentemente associada com edema grave reconhecível por cabeças maiores, um espaço mais amplo entre os olhos e um sangramento mais difuso. No entanto, nem todas as larvas de ICH + BBH exibem edema.

Figura 2 : Fenótipos de hemorragia cerebral Ich +. Exemplos de fenótipos de ICH larval mantidos em um fundo transgênico de GATA1: DsRed repórter observado com um estereomicroscópio brightfield (painéis superiores) e fluorescência (painel inferior) em ~ 48 h pós-fertilização. Não foram observadas hemorragias nas larvas de ICH (painéis esquerdos). Uma acumulação distinta de glóbulos vermelhos no prosencéfalo e no rombencéfalo (setas) foi observada em larvas de Ich + (painéis direito). As barras de escala representam 250 μm. a figura foi reproduzida de Crilly et al.²⁰ com permissão uma licença Creative Commons. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

4. dia 3: morte celular e análise leucocitária em 72 HPF

1. Telhe as larvas usando um microscópio de fluorescência para assegurar a expressão da proteína fluorescente.
   Nota: neste estudo, as larvas transgênicas Ubiq: secanexinv-mvenus foram usadas para relatar a morte de células cerebrais e o MPOtransgênico duplo: GFP; MPEG1: mcherry ou Ubiq: Secanexinv-mvenus; MPEG1: mcherry usado para a análise da leucócito.
2. Encha a câmara de montagem da folha de luz com a mídia E3 contendo 0, 2% MS222.
3. Anestesiam as larvas usando 0, 2% MS222. Transfira larvas para montagem (n = 1-6) para uma superfície de placa de Petri seca em uma única gota. Retire o máximo de líquido possível.
   Nota: o agarose de baixo derretimento de 1,5% é preparado usando 0,15 g de agarose de baixo derretimento dissolvido em 10 mL de meio E3 sem azul de metileno em um microondas e mantido a 45 ° c até o uso.
4. Adicione uma gota de 1,5% de agarose de baixo derretimento (mantido como líquido em um bloco de calor de 45 ° c) para as larvas e usando um capilar de montagem de 800 μm, e desenhe as larvas acima da cabeça primeiro. Se o posicionamento não é exato as larvas podem ser expulsas do agarose e montadas outra vez. Deixe o capilar esfriar antes de inserir na câmara de folha de luz.
   Nota: Alternativamente, um microscópio confocal poderia ser usado para este procedimento. Para isso, as larvas devem ser montadas lateralmente em agarose em um prato de fundo de vidro.
5. Adquira imagens z-Stack da cabeça entre as lentes oculares (~ 300 μm) e o processo até a imagem de projeção de intensidade máxima.
   1. Analise a região cerebral a partir de imagens coletadas para o número total de células fluorescentes e fluorescência de intensidade total²⁰.
6. Crie um vídeo de lapso de tempo de compósitos de projeção múltipla acima de 18-24 h para rastrear a mobilidade leucocitária e a interação com células moribundas.
   Nota: se a imagem latente viva a longo prazo é executada, somente uma larva é montada no capilar.
7. Quando a imagem latente é terminada expelir as larvas do capilar da montagem em uma overdose letal de 4% MS222 a eutanizar.

5. dia 3: seleção de larvas para o ensaio de motilidade em 72 HPF

1. Anestesiam larvas nos pratos de Petri com 0, 2% MS222.
2. Selecione aleatoriamente n = 24 larvas para o ensaio de motilidade e transfira para a mídia nova da E3 e permita que os animais se recuperem do anestésico.
   Nota: o anestésico neste ponto remove o viés de seleção para nadadores lentos que são fáceis de capturar.

6. dia 3-5: locomoção de Assaying em 72, 96 e 120 HPF

1. Transferência de larvas selecionadas em 72 HPF em meio E3 sem azul de metileno.
   Nota: para ensaio em 3 DPF permitir que as larvas tempo suficiente para se recuperar do anestésico (> 1 h).
2. Placa uma larva em 1 mL por poço de uma placa de 24 poços usando uma pipeta.
   Nota: corte a extremidade da ponta da pipeta para evitar danificar as larvas. O tamanho da placa pode ser mudado de acordo com o projeto experimental.
3. Coloque as placas na câmara da câmara e o movimento do ensaio durante 10 min usando uma rotina de luz branca para aumentar a natação espontânea.
   Observação: comportamento de natação foi rastreado usando uma câmara de câmera e software de rastreamento (consulte a tabela de materiais).
4. Repita o experimento com as mesmas larvas em 96 e 120 HPF. Mova as larvas da carcaça individual na placa de ensaio para um prato de Petri e incubar a 28 ° c entre os ensaios.
5. Na conclusão do ensaio, eutanizar larvas em uma overdose letal de 4% MS222.

Results

Avaliação da morte de células cerebrais utilizando Ubiqtransgênico: secanexinv-mvenus resulta em agrupamentos definitivos claros de células moribundas em larvas de Ich + em ambos os modelos de ATV e BBH que estão ausentes em todas as larvas de Ich-(Figura 3). Clusters recede antes 96 HPF. Através da análise de imagem, o sangramento está associado a um aumento significativo de duas vezes na intensidade total do sinal de fluorescência no cérebro, indicando morte celular marcada.

Uma resposta neuroinflamatória é identificada em larvas de Ich + pelo número aumentado significativamente de pilhas do macrófago do positivo MPEG1 no cérebro. O número total de células de neutrófilos do MPO positivo também aumentou no entanto, isso não atinge significância estatística (Figura 4). A morfologia dos macrófagos MPEG1 positivos também pode ser observada na alteração das larvas de ICH +, uma vez que as células adotam uma forma ativa, arredondada e amoeboida. Essas células arredondadas ativadas também podem ser monitoradas ao longo do tempo para mostrar uma resposta fagocitítica aumentada do Ubiq:secanexinv-mvenus expressando células moribundas em larvas de Ich + (Figura 5). os macrófagos positivos de MPEG1 que exibem processos ramificados foram categorizados como inativos.

A hemorragia cerebral está associada a uma diminuição significativa da motilidade em 72 e 96 HPF em comparação com os controles de ICH-irmão em ambos os modelos BBH e ATV (Figura 6). Motilidade em 120 HPF recupera para níveis de linha de base próximos. Há muitas vezes diferenças na motilidade basal entre as garras de ovo e cepas e assim a comparação deve ser feita para ICH-controles de cada vez.

Figura 3 : A hemorragia intracerebral (ICH) em larvas do zebrafish conduz a um ferimento de cérebro quantificáveis. (A) imagens representativas do fenótipo de lesão cerebral em larvas de Ich + (painéis direito), em comparação com Ich-irmãos (painéis esquerdos), em 72 HPF. As imagens de brightfield (painéis inferiores, barra de escala = 250 μm) demonstram a presença de hemorragias cerebrais (setas) em larvas de ICH +. A microscopia fluorescente foi realizada para visualizar a morte celular na linha de repórter Ubiq:secanexinv-mvenus (painéis superiores, barra de escala = 100 μm). Os conjuntos de pilhas de morte foram observados em regiões peri-hematomal. As imagens foram cortadas em regiões apenas cerebrais e analisadas para a intensidade de fluorescência verde total em partículas redondas maiores que 30 pixels de diâmetro (linha branca) usando a macro no arquivo complementar 1. (B) quantificação do sinal de fluorescência nos cérebros de larvas não tratadas, ich-e Ich + obtidas através do modelo ATV (n = 12 por grupo; 3 repetições independentes) em 72 HPF. Diferenças significativas foram observadas na comparação de ICH + com irmãos não tratados (* * p = 0, 4) e com ICH-(* p = 0, 3). (C) quantificação do sinal de fluorescência como leitura para vinculação anexinv no cérebro de larvas de Ich-e Ich + obtidas através do modelo de Bubblehead (BBH) (n = 12 por grupo; 2 repetições independentes) em 72 HPF. Os gráficos mostram o SD da média. Observou-se diferença significativa na fluorescência de mVenus entre os irmãos ICH + e ICH-pareados com idade (* * p = 0, 2). A figura foi reproduzida a partir de Crilly et al.²⁰ com permissão uma licença Creative Commons. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : A hemorragia intracerebral (ICH) inicia uma resposta imune celular inata no cérebro larval do zebrafish. Números de leucócitos quantificados dentro das regiões cerebrais previamente descritas para MPO: GFP; MPEG1: dsRed dupla larvas transgênicas (n = 8 por grupo; 2 repetições independentes) em 72 HPF revela um aumento significativo nos macrófagos (* p = 0, 1), mas não neutrófilos (p = 0,5), em resposta a ICH. A figura foi reproduzida a partir de Crilly et al.²⁰ com permissão uma licença Creative Commons. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 5 : As pilhas de macrófagos ativadas mostram uma resposta fagocitária à lesão de cérebro. (A) o lapso temporal representativo²⁰ que mostra um macrófago ramificado do patrulhamento que migra para uma pilha positiva do anexinv (i-vi). Stills são obtidos a partir de uma série de imagens tiradas de todo o cérebro usando um objetivo 20x. A barra de escala representa 50 μm. O macrófago adquiriu uma morfologia amebóide (v) antes de fagocitose a pilha anexinv-positiva (vi, VII). Após a fagocitose, o macrófago retoma uma morfologia ramificada e migra para longe e a célula Anexinv-positiva não pode mais ser vista (VIII). Macrófago ramificado (#), célula positiva de anexinv (seta), macrófago amebóide (*) são indicados. (B) imagens representativas de células MPEG1-positivas no cérebro larval Ich-e Ich + exibindo morfologias amebóide e ramificadas. As barras de escala representam 50 μm. (C) uma proporção aumentada de amebóide (phagocytic) e a proporção diminuída de macrófagos ramificados (inativos) foi observada em cérebros de Ich + em comparação com Ich-irmãos. A figura foi reproduzida a partir de Crilly et al.²⁰ com permissão uma licença Creative Commons. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 6 : A lesão cerebral induzida por Ich resulta em um déficit locomotor quantificável em larvas de zebrafish. (A) exemplos representativos das faixas de natação em larvas de Ich-e Ich + bbh em 72, 96 e 120 HPF. (B) Ich + larvas exibiram uma diminuição significativa no tempo acumulado móvel gasto durante o período de gravação de 10 min em ambos os 72 e 96 HPF. A significância foi perdida no ponto de tempo de 120 HPF, potencialmente aludindo à recuperação de lesão cerebral (n = 24 larvas por grupo; 3 repetições independentes; * * * * p = 0, 6; * * p = 0, 3; NS: p = 0, 8). (C) quantificação do tempo cumulativo gasto em movimento em larvas não tratadas e de Ich-e Ich + tratados com ATV em 120 HPF. As larvas de ICH + exibiram uma diminuição significativa no tempo acumulado móvel gasto durante o período de gravação de 10 min. Três repetições técnicas (n = 24 larvas por grupo) foram utilizadas para calcular a DP da média (* * * p = 0, 4, * * p = 0, 3). A figura foi reproduzida a partir de Crilly et al.²⁰ com permissão uma licença Creative Commons. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Arquivo complementar 1. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Este estudo mostra que o ICH em larvas de zebrafish induz uma resposta de lesão cerebral que recapitula aspectos-chave da condição humana que pode ser sistematicamente ensaiada e quantificada. O zebrafish oferece um modelo consistente e reprodutível de Ich espontâneo que auxiliará com futuros estudos de intervenção medicamentoso focados em direcionar a lesão cerebral induzida pelo sangue, em vez de prevenir a ruptura do vaso^17,18. Na verdade, dada a rápida natureza do início da doença semelhante à situação clínica, tal abordagem oferece perspectivas emocionantes para a tradução bem-sucedida no futuro.

Algumas limitações estão associadas ao uso de larvas de zebrafish, como o uso de um sistema em desenvolvimento e classificação taxonômica, no entanto, as vantagens práticas e científicas desse modelo devem ser consideradas para oferecer novos insights sobre a ICH. Nenhuma cirurgia é necessária para iniciar uma hemorragia ou para monitorar os processos celulares durante longos períodos de tempo após a lesão. Alta fecundidade de pares de zebrafish geram tamanhos de amostra facilmente acessíveis e grandes, e devido ao rápido desenvolvimento das larvas a linha do tempo experimental é significativamente reduzida em comparação com os estudos de roedores^29,30.

Atualmente estes modelos são aptos a usar-se para elucidar a resposta patológica e imunológica imediata ao ICH espontâneo no cérebro de animais intactos vivos. Potencialmente, este modelo pode ser adaptado para telas de medicamentos de média alta taxa de transferência para terapias ICH, se a promoção preventiva ou de recuperação. Como tal, as patologias pós-Ich apresentadas neste estudo representam uma plataforma alternativa e complementar para a pesquisa pré-clínica de ICH.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de 24 poços	Sigma-Aldrich	CLS3527
28 ° C incubadora	LMS	210
Atorvastatina	Sigma-Aldrich	PZ0001-5mg
Caixas de reprodução	Thoren Aquatics systems	10011
Câmara de observação Daniovision	Noldus	n/a
E3 medium 1x			4% Instant Ocean, 500 µ L azul de metileno em 1 L dH2O
Software EthoVision XT	Noldus	versão 11
Bloco de calor	Grant-Bio	PHMT-PSC18
Oceano instantâneo	Oceano instantâneo	SS15-10
Microscópio Lightsheet	Zeiss	Z.1
Lightsheet capilar de montagem do microscópio	Zeiss	402100-9320-000
Baixo derretimento agarose	Promega	V2111
Azul de Metileno	Sigma-Aldrich	319112-100ML
Microscópio	Microscópio de dissecção	Leica	MZ95
Microscópio	fluorescente	Leica	M165FC
MS222			4g tricaína em pó, 500 mL de dH2O, 10 mL de 1 M Tris (pH 9). Ajuste o pH para ~7
Pipetas P1000 Pontas	Gilson	F144059M
P1000	Starlab	S1122-1830
Pipetas Pasteur	Starlab	E1414-0300
Placas de Petri	Corning	101VR20
Pipetboy	Integra Biosciences	PIPETBOY
Stripette 25ml	Corning	CLS3527
Tricaína em pó	Sigma-Aldrich	A5040-25G
Tris Base	Fisher BioReagents	BP152-1
Pinça de dissecção ultrafina	Agar scientific	AGT502
Zen software	Zeiss	versão 2.3