Um suporte de amostra tudo-em-um para a cristalografia macromolecular do raio X com espalhamento mínimo do fundo

O conhecimento da estrutura tridimensional das macromoléculas biológicas constitui uma importante pedra angular em todas as pesquisas biológicas, bioquímicas e biomédicas básicas. Isto estende mesmo a determinados aspectos translacional de tal pesquisa, como por exemplo a descoberta da droga. Entre todos os métodos para a obtenção dessas informações tridimensionais na resolução atômica a cristalografia de raios-X é a mais poderosa e a mais proeminente, como é evidenciado pelo fato de que 90% de todas as informações estruturais disponíveis são contribuídas por raios-X Cristalografia¹. O principal pré-requisito da cristalografia de raios-X, que é ao mesmo tempo a sua maior limitação, é que os cristais de difração de qualidade têm de ser produzidos e preparados para o experimento de difração. Esta etapa ainda constitui um dos principais gargalos do método.

Historicamente, os dados de difração dos cristais proteicos foram coletados à temperatura ambiente. Cristais individuais foram cuidadosamente transferidos para vidro ou capilares de quartzo antes da coleta de dados, o licor materno foi adicionado aos capilares para que os cristais não secariam e os capilares fossem selados^2,3, a ⁴. Desde a década de 1980, tornou-se cada vez mais evidente que, devido às propriedades ionizantes da radiação X e à iminente sensibilidade à radiação de cristais macromoleculares, a coleta de dados à temperatura ambiente apresenta severas limitações no método. Consequentemente, foram desenvolvidas abordagens para mitigar os efeitos dos danos causados por radiação, resfriando cristais macromoleculares até 100 mil e recolhendo dados de difração a uma temperatura tão baixa^5,6. Para trabalhar em baixas temperaturas, a montagem das amostras nos capilares tornou-se impraticável devido à baixa taxa de transferência de calor. Apesar disso, há esforços contínuos para também usar capilares, em particular de experimentos de cristalização de contrdifusão, para o trabalho de difração de baixa temperatura^7,8, mas, independentemente disso, tornou-se o padrão aproximação na cristalografia macromolecular para montar cristais macromoleculars prendidos por uma película fina do licor da mãe dentro de um laço prendido fino^9,10. Mesmo que uma série de melhorias (por exemplo, a introdução de laços litográficos e estruturas semelhantes¹¹) foram feitas ao longo do tempo para esta montagem baseada em loop, os princípios básicos que foram desenvolvidos no início da década de 1990 ainda estão em uso hoje. Pode-se afirmar com segurança que a maioria das coletas de dados de difração em cristais macromoleculares hoje em dia ainda dependem dessa abordagem⁵.

Ao longo do tempo, houve alguns novos desenvolvimentos interessantes e modificações do método de montagem baseado em loop, mas essas abordagens até agora não foram amplamente adotadas na Comunidade. Uma é a chamada montagem loop-less dos cristais, que foi desenvolvida para conseguir um fundo mais baixo que dispersão^12,13,14. Outro é o uso de bainhas de grafeno para envolver as amostras cristalinas e protegê-los de secar. O grafeno é um material bem adaptado a esse respeito devido ao seu fundo de espalhamento de raios-X muito baixo¹⁵.

Mais recentemente, os desenvolvimentos no campo de montagens da amostra foram focados principalmente na padronização das montagens com o objetivo de aumentar a taxa de transferência da amostra¹⁶ ou em projetar montagens, que podem conter mais de uma amostra¹⁷, como por exemplo membranas modeladas em um frame do silicone, que sejam capazes de prender centenas de cristais pequenos na maior parte no campo do cristalografia desérie¹⁸,^19,20,21,22.

Todos os métodos de montagem da amostra discutidos até agora ainda exigem algum grau de intervenção manual, o que significa que há um perigo inerente de causar danos mecânicos à amostra. Conseqüentemente, as aproximações novas estão sendo procuradas pela engenharia o ambiente da amostra tais que os dados da difração dos cristais podem ser recolhidos dentro de seu ambiente do crescimento. Um tal método é denominado in situ ou placa-triagem^23,24 e já é implementado em um número de cristalografia macromolecular linhas luz em várias fontes de síncrotron em todo o mundo²⁵. No entanto, o uso deste método é limitado pelos parâmetros geométricos da placa de cristal e o espaço disponível em torno do ponto de amostragem do instrumento.

No entanto, outra abordagem é realizada no chamado sistema CrystalDirect²⁶. Aqui, as gotas inteiras da cristalização são colhidas automaticamente. As folhas em que os cristais foram crescidos são costume-corte usando um laser e usado diretamente como o suporte da amostra²⁷.

No trabalho descrito aqui, o objetivo era desenvolver um suporte de amostra, o que permitiria a um usuário mover a amostra cristalina de sua câmara de crescimento para o dispositivo de coleta de dados sem tocá-lo e o que permitiria ao usuário manipular a amostra facilmente. Uma vez que muitos pesquisadores no campo da cristalografia macromolecular ainda estão usando o formato de cristalização de 24 poços para otimizar o crescimento do cristal modificando as condições identificadas em grandes campanhas de triagem, o novo suporte de amostra foi projetado para ser compatível com este formato. A seguir, o desenho do novo suporte da amostra será descrito e o manuseio e o desempenho do suporte da amostra para coleta de dados in situ e embebição de ligantes serão demonstrados. Finalmente, a adequação deste novo suporte de amostra, bem como suas limitações para as várias etapas de trabalho serão discutidas.

Atenção: para todos os trabalhos subsequentes, é muito importante que a folha de poliimida de cor amarela não deva ser tocada com dedos desprotegidos, devido a possíveis contaminações ao suporte da amostra. Além disso, o uso de pinça protegida é altamente recomendado.

1. o suporte da amostra

1. Use um dos três tipos de suporte da amostra.
   Nota: três versões diferentes do novo suporte de amostra desenvolvido são mostradas na Figura 1. Todos contêm uma estrutura plástica preta da sustentação, uma folha hermética de COC na parte externa e uma folha estruturada microporosa do polyimide no interior. O tipo 1 (Figura 1a) contém um anel plástico externo fixo, enquanto que para os tipos 2 e 3 (Figura 1b,1C) o anel externo pode ser quebrado mecanicamente nos respectivos pontos de ruptura designados para utilização em sistemas automatizados de transferência de amostras (ver vermelho setas na Figura 1b). O projeto dos suportes da amostra permite a instalação de gotas múltiplas da cristalização na folha amarela do polyimide. Não compromete o monitoramento do experimento de cristalização, pois o material é altamente transparente para a luz visível. A folha grossa do polyimide de 21 μm igualmente caracteriza os poros de 5 μm, que permite a manipulação de cristal simples mergulhando mais tarde. Uma vez que a transmissão de raios-X está perto de 1,0 em todas as energias de coleta de dados de difração comumente usadas na cristalografia macromolecular, a contribuição da folha para o espalhamento de fundo em um experimento de difração é insignificante²⁸.

2. criação de gotas de cristalização

1. Crie uma superfície limpa e livre de poeira usando um pano úmido sem fiapos. Tome um suporte da amostra de sua caixa e coloc delicadamente o, a folha amarela que enfrenta acima, na superfície limpada para evitar dano ou a punctura não desejada da folha do COC da parte traseira.
2. Configure as gotas de cristalização com um volume máximo recomendado de 2 μL na folha amarela, como seria feito em lâminas de cobertura comumente usadas. Coloque as gotas suavemente para evitar qualquer ruptura ou piercing da folha usando uma pipeta. Em um suporte de amostra do tipo 1 (Figura 2a) podem ser colocados até três gotas, enquanto que em suportes de amostra do tipo 2 e 3 2 gotas são o máximo recomendado (Figura 2C).
3. Vire o suporte da amostra e coloque-o sobre uma cavidade pré-lubrificada de uma placa de estilo Linbro de 24 poços. Use as ajudas de posicionamento (veja as setas vermelhas na Figura 1a) do suporte da amostra para guiá-la a sua posição óptima.
4. Assegure a posição correcta do suporte da amostra, a fim de evitar a evaporação indesejada (Figura 2a).

3. observando o crescimento do cristal

1. Colocando a placa de cristalização um microscópio de luz de transmissão, com ou sem polarizadores, monitore o crescimento do cristal sem qualquer perturbação do experimento (Figura 4).
2. Ao usar os suportes menores da amostra de 18 milímetros do tipo 3 (Figura 1C), que foram projetados para o uso em placas da pegada de SBS, use um robô da imagem latente capaz de segurar placas do SBS-Footprint para monitorar o crescimento de cristal em uma maneira mais automatizada.

4. manipulação de cristal

Nota: recomenda-se executar todas as etapas subseqüentes um microscópio de luz de transmissão.

1. Cryo-proteção
   1. Perfure delicadamente a folha exterior de COC usando uma cânula fina. Certifique-se que a folha amarela interna permanece intocada. A punção deve ser direita ao lado da gota a ser manipulada (Figura 3a,3C).
   2. Use um pavio de papel fino e inseri-lo no buraco cutucou. Empurre com cuidado o feltro de lubrificação para a frente até que toque a folha amarela do polyimide. Mantenha o pavio em contato com a folha perfurada. O pavio vai sugar toda a solução em excesso. O tempo necessário para a remoção líquida completa depende da viscosidade das soluções e da composição do licor materno (Figura 3B).
   3. Depois que todo o líquido é sugado afastado, retraia delicadamente o feltro de lubrificação de papel. Lembre-se da posição da gota, uma vez que pode não ser visível após a remoção do licor mãe.
   4. Tome uma pipeta padrão para aplicar um pequeno volume de solução crio-Protectant, Max. 3 μL, utilizando uma ponta extrudada (por exemplo, uma ponta de carga de gel) através do mesmo orifício. Uma vez que o líquido é dispensado, retrair a ponta. A porosidade da folha amarela permite a difusão através da folha. O tempo para atingir a crioproteção de seus cristais depende muito da solução empregada e de seus componentes.
   5. Para reseal a folha de COC self-healing, coloc delicadamente um dedo protegido no furo por aproximadamente 1 s e deslize-o através da punctura. A pressão ligeira em combinação com a temperatura elevada promoverá o Resealing das puncturas, que não são demasiado grandes.
2. Ligand imersão
   
   Nota: o excesso de licor materno pode ser retirado antes do ligante embebido. Para isso, siga as etapas descritas em 4.1.1 a 4.1.3.
   1. Dissolva o ligante no licor da mãe na concentração desejada em um tubo da reação.
   2. Gire a solução por 10 minutos em 12.000 x g a fim remover as partículas insolúveis. Use uma centrífuga de temperatura controlada, se necessário.
   3. Coloque suavemente um volume de máx. 3 μL de solução contendo ligantes na lacuna entre a folha COC e o filme de poliimida usando uma ponta de Pipet longa e extrudada. Retrair a ponta.
   4. Para reseal a folha de COC autocura, coloc delicadamente um dedo protegido no furo por aproximadamente 1 s e deslize-o através da punctura (Veja também 4.1.5).
   5. Incubar o experimento por algum tempo, a fim de permitir a difusão através da membrana. O tempo de imersão depende muito da viscosidade da solução de difusão e seus componentes²⁹.
   6. Repita os passos 4.2.1 para 4.2.5 várias vezes para posteriormente mergulhar ligantes diferentes.

5. recolha de dados de difração in situ à temperatura ambiente

Nota: para minimizar o espalhamento de solventes, remova a solução em excesso antes da coleta de dados.

1. Assegure um ambiente beamline controlado da umidade estável com condições pré-estabelecidas³⁰.
2. Levante delicadamente a folha transparente de COC no ponto designado usando o fórceps e descasque-a fora como uma removeria a tampa de um copo do yogurt ( Figura 6B).
3. Levante delicadamente o suporte da amostra de sua cavidade e introduza-o imediatamente em uma base magnética pre-preparada do suporte da amostra. Nenhuma colagem é necessária para esta etapa (Figura 6B).
4. Aplique a pressão delicada para assegurar o posicionamento correto do suporte da amostra dentro da base.
5. Monte o suporte da amostra em um goniômetro de beamline e assegure o posicionamento correto do suporte. Dependendo da geometria do goniômetro, o suporte da amostra pode ser girado até 160 ° sem causar qualquer sombreamento durante o experimento de difração.
6. Use um pavio de papel e toque suavemente a folha de poliimida amarela da parte de trás para remover o excesso de licor de mãe. Por favor, note que, nessa fase, o ligante embebido ou crioproteção pode ser realizado tão bem. O exemplo agora está pronto para centralizar e difração de coleta de dados.
7. Ao usar um suporte de amostra com anel externo removível, aplique pressão suave segurando o anel externo e quebre-o nos pontos de ruptura designados (Figura 6C). O exemplo agora está pronto para centralizar e difração de coleta de dados.

6. coleta de dados de difração in situ em temperatura criogênica

Nota: recomenda-se remover o licor de mãe residual da amostra realizando os passos 4.1.1. para 4.1.3. antes de prosseguir com as próximas etapas para minimizar o espalhamento de solvente. A maioria das amostras pode ser transferida para nitrogênio líquido sem proteção prévia de Cryo³¹. Se for necessária crioproteção, consulte os passos 4.1.1. a 4.1.5.

1. Levante suavemente a folha COC no ponto designado utilizando uma pinça e retire-a (ver passo 5.1.2) (Figura 6a).
2. Leve o suporte da amostra para fora da cavidade e monte-o em uma base magnética do suporte da amostra. A pressão delicada pode ser aplicada a fim assegurar o encaixe correto e apertado (veja a etapa 5.1.5, Figura 6B).
   Nota: os pontos de ruptura designados simetricamente arranjados permitem a remoção simples do anel externo do suporte da amostra aplicando a pressão delicada (veja a etapa 5.1.8., Figura 6C). Agora, o suporte da amostra está pronto e pode ser mergulhou no nitrogênio líquido. A geometria dos tipos de suportes de amostras 2 e 3 (Figura 1b,1C) permite a sua transferência em frascos de amostra de coluna padrão, que podem ser utilizados para a montagem da amostra assistida por robô (Figura 6D).

O tipo 1 do suporte da amostra foi projetado de modo que caiba em um poço de uma placa do estilo de 24 bem Linbro. Cada suporte de amostra individual contém auxiliares de posicionamento em ambos os lados da borda externa, a fim de garantir o posicionamento ideal na borda do poço (Figura 1a, Figura 2a). Até três gotas de cristalização individuais de volume máximo de 2 μL podem ser colocadas na folha de poliimida amarela (Figura 2b). Para os suportes de amostra dos tipos 2 e 3, recomenda-se definir um máximo de duas gotas de volume máximo de 2 μL cada. 24 suportes da amostra podem ser cabidos na placa de 1 24-well Linbro (Figura 3D).

Uma experiência da cristalização em uma placa de Linbro de 24 poços usando o tipo 1 do suporte da amostra foi ajustada acima. 1 μL de solução de lisozima ovo-branca de galinha (15 mg/mL) foi misturado com 1 μL de licor materno compreendendo 50 mM de pH NaAc 4,7, 500 mM de NaCl e 25% (p/v) PEG-6000 na folha de poliimida amarela no suporte da amostra (tabela 1). A queda foi equilibrada em 293 K contra 500 μL de mãe-licor e cristais do tamanho 40-50 μm foram observados após 5 horas (Figura 4). O crescimento do cristal pode ser observado por meio de um microscópio de luz de transmissão (Figura 4) com ou sem polarizador. As películas elevadas da transparência asseguram a melhor observação e monitoração de condições crescentes de cristal usando ambos, um microscópio leve convencional ou um sistema de imagem latente de cristal automatizado. A observação de crescimento de cristal usando a UV-luz não foi testada.

Após a remoção do licor materno ao redor dos cristais, um suporte de amostra com cristais de lisozima branco-ovo de galinha foi retirado da placa de cristalização e colocado em uma corrente de ar controlada por umidade no beamline HZB-MX 14,332. Os dados de difração foram coletados à temperatura ambiente em incrementos de 1 ° usando um feixe de 150 μm a 13,8 energia de keV com 4 x 1010 fótons/s e um tempo de exposição de 5 s por imagem. Uma imagem de difração típica é mostrada na Figura 5. Nenhum espalhamento de fundo elevado na imagem de difração pode ser detectado. Mais detalhes experimentais, bem como estatísticas de processamento de dados associados estão listados na tabela 2.

Figura 1 : Visualização esquemática dos novos suportes de amostra. Os suportes da amostra consistem em um apoio plástico preto, que seja coberto no lado exterior com uma folha de copolímero cíclico amorfo do olefinas (COC). Esta folha (colorida em azul) é altamente transparente e auto-cura. Igualmente assegura a tensão do gás do experimento. A folha interna (colorida em amarelo) é feita de poliimida bio-inerte, que é altamente transparente para raios-X. Nesta folha, as gotas de cristalização podem ser colocadas. A borda externa do suporte da amostra contém dois auxiliares de posicionamento indicados pela seta vermelha (painel a), que permite a colocação exata do suporte da amostra na cavidade pré-lubrificada individual da placa de cristalização. (A) suporte de amostra (tipo 1) com 22 mm de diâmetro com um anel de suporte externo fixo. (B) suporte de amostra (tipo 2) com 22 mm de diâmetro com anel de suporte externo removível. (C) suporte de amostra (tipo 3) com 18 mm de diâmetro com anel de suporte externo removível. Os dois últimos foram desenvolvidos para usá-los em uma forma de alta produtividade com robôs de montagem de amostra automatizada usando padrão SPINE. Os pontos de ruptura designados são destacados pelas setas vermelhas no painel B. A seta preta no painel C indica o marcador de posicionamento. Os pinos salientes no perímetro externo da folha amarela são necessários para alinhar a folha de poliimida durante o processo de produção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : O suporte da amostra pode ser usado em uma placa de Linbro de 24 poços da mesma forma que os deslizamentos de cobertura de microscópio comumente usados. Sela a cavidade hermética. As ajudas de posicionamento asseguram o posicionamento correto do suporte da amostra na cavidade (setas vermelhas no painel a). Até três gotas individuais podem ser colocadas em um suporte de amostra tipo 1 (painel B), enquanto o número máximo recomendado de gotas colocadas em um suporte de amostra tipo 2 ou 3 é dois. O volume máximo recomendado para cada gota é de 2 μL. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : 24 suportes da amostra do tipo 1 cabem em uma placa de 24 poços. Os suportes de amostra podem ser colocados em duas orientações na placa de 24 poços, conforme indicado (painel D). Uma cânula é usada para perfurar a folha traseira de COC a fim remover o licor adicional de uma gota da cristalização (painéis a e C) usando um pavio de papel introduzido delicadamente no mesmo furo (painel B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Imagem dos cristais de lisozima ovo-brancos da galinha observados através de um microscópio da transmissão equipado com um polarizador. Cristais individuais são facilmente discriminados a partir de solução de proteína precipitada. Os cristais nesta imagem têm um tamanho médio de 40 μm x 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 5 : Uma imagem típica da difração do raio X de um cristal do lisozima crescido no suporte da amostra. Antes da exposição a raios-X, todo o licor de mãe em excesso foi removido ao redor do cristal. Os dados de difração foram coletados à temperatura ambiente no BL 14.3 no anel de armazenamento de elétrons BESSY II32 usando um ambiente de amostra com umidade controlada com 97,5% de umidade relativa. Nenhum fundo elevado devido aos suportes da amostra pode ser observado. As linhas tracejadas na imagem indicam os anéis de resolução. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : O suporte da amostra é preparado para a coleta de dados de difração. Primeiro, o filme COC é levantado suavemente usando uma pinça e depois descascado (painel a). Posteriormente, o suporte da amostra é retirado da cavidade e inserido no orifício central de uma base magnética até ser indicado pelo marcador (painel B). Segurando a parte central, a pressão suave é aplicada ao anel externo para liberar a parte central usando os pontos de ruptura designados simetricamente organizados (painel C). Após a remoção, o suporte da amostra pode ser mergulhou no nitrogênio líquido e transferido em frascos padrão da espinha. Coloc, por exemplo, nos discos podem ser transportados aos locais do síncrotron onde os robôs automatizados da amostra-montagem os reconhecem como amostras regulares (painel D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Tabela 1: detalhes experimentais do experimento de cristalização descrito.

Tabela 2: coleta de dados de difração e estatísticas de processamento.

Os pedidos de patente relativos ao titular da amostra reportada foram arquivados pela Helmholtz-Zentrum Berlin com os seguintes números DE registo e datas DE registo com o escritório DE patentes e marcas alemãs: DE 10 2018 129 125,6, data DE registo 20 DE novembro ^th, 2018; DE 10 2018 125 129,7, data de registro 11de outubro, 2018; DE 10 2017 129 761,8, data de registro 13de dezembro, 2017. Um pedido internacional subseqüente da patente através da rota do PCT, usando a prioridade de DE 10 2017 129 761,8 foi arquivado, PCT/DE2018/101007. Um registro de um modelo de utilidade com o número DE 20 2018 106 955,1 foi arquivado em 6de dezembro, 2018. O suporte da amostra foi disponibilizado comercialmente os nomes comerciais XtalTool e XtalTool/HT por Jena Bioscience, Jena, Alemanha.