Injetando ovos de Gryllus bimaculatus

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para injetar ovos do grilo, uma técnica que sirva como um método fundamental em muitas experiências no grilo, incluindo, mas não limitado a, a interferência do RNA e a manipulação genomic.

Resumo

Alterando a função gênica em um organismo em desenvolvimento é central para diferentes tipos de experimentos. Embora as ferramentas genéticas tremendamente poderosas tenham sido desenvolvidas em sistemas modelo tradicionais, é difícil manipular genes ou RNA mensageiro (mRNA) na maioria dos outros organismos. Ao mesmo tempo, abordagens evolutivas e comparativas dependem de uma exploração da função gênica em muitas espécies diferentes, necessitando do desenvolvimento e adaptação de técnicas para manipular a expressão fora do momento geneticamente tratável Espécie. Este protocolo descreve um método para injetar reagentes em ovos do grilo para ensaiar os efeitos de uma manipulação dada no desenvolvimento embrionário ou larval. Instruções sobre como coletar e injetar ovos com agulhas chanfradas são descritas. Esta técnica relativamente simples é flexível e potencialmente adaptável a outros insetos. Pode-se reunir e injetar dezenas de ovos em um único experimento, e as taxas de sobrevivência para injeções de buffer-only melhorar com a prática e pode ser tão alto quanto 80%. Esta técnica apoiará vários tipos de abordagens experimentais, incluindo a injecção de agentes farmacológicos, o mRNA tampado in vitro para expressar genes de interesse, RNA duplo-encalhado (dsRNA) para alcançar a interferência do RNA, o uso de aglomerados regularmente repetições palindrômicas curtas interespaçadas (CRISPR) em concerto com reagentes de proteína 9 (Cas9) associados à CRISPR para modificação genômica e elementos transponíveis para gerar linhas transgênicas transitórias ou estáveis.

Introdução

A capacidade de modificar o genoma ou influenciar a expressão gênica em organismos é a base para o projeto de muitos tipos de experimentos que testam a causalidade funcional. Também é fundamental para o trabalho comparativo e evolutivamente relevante que técnicas de modificação genômica e não-genômica estejam disponíveis em organismos fora dos sistemas de modelo animal de laboratório genético tradicional (por exemplo, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans). Se é o desejo de compreender a diversidade organizosa¹ ou a adesão ao princípio de Krogh, que para cada questão bioló....

Protocolo

1. configuração de hardware e preparação de materiais

Nota: Consulte a tabela 1 e a tabela de materiais para preparação de soluções, reagentes e detalhes do equipamento.

1. Configurar um microscópio de dissecação para ver os ovos e guiar a agulha de injeção. (Figura 1a mostra um microscópio de dissecação equipado com fluorescência.) A capacidade de fluorescência é vantajosa, mas não necessária.
2. Posicione um micromanipulador de 3 eixos para manobrar a agulha de injeção no lugar (Figura 1a).
3. Configurar um m....

Resultados

Os grilos prontamente colocam ovos no material úmido, e fornecendo material adequado, como areia úmida ou sujeira, induz-os a colocar um grande número de ovos. Isto é especialmente eficaz se os grilos são primeiro privados de material de postura de ovos para 8 – 10 h. os ovos colocados em areia limpa podem ser facilmente separados, recolhidos (Figura 1b) e colocados em poços de ovos concebidos medida para injeção (Figura 1C). Um .......

Discussão

Os dois desafios principais com esta técnica são as edições relacionadas do tamanho e do survivability óptimos da agulha. Embora as agulhas menores melhorem o survivability, as agulhas com lúmens mais estreitos têm um maior grau de forças capilares no trabalho, que o faz mais provável que o gema se mova na agulha que causa o entupir. Na melhor das casos, os bloqueios podem ser limpos simplesmente injetando outro ovo ou limpando a agulha como descrito acima. Um pode igualmente tentar aumentar a pressão do contrapeso no mi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio de dissecação fluorescente	Leica	M165 FC	Estereomicroscópio com fluorescência
Fonte de luz externa para fluorescência	Leica	EL 6000
Microinjetor	Narishige	IM-300-Os	acessórios podem incluir suporte de agulhas de injeção, mangueira de entrada (com um conector de mangueira), cabo de alimentação CA, pedal, junta de borracha de silicone -
cubo	de filtro mCherryO	M205FA / M165FC	para mCherry ou corante vermelho semelhante funcionará
Micromanipulador	World Precision Instruments, Inc.	M3301R	Usado com Suporte Magnético (Narishige, Tipo GJ-8)
Suporte magnético	Narishige	MMO-202ND
Suporte de Pipeta (Porta-agulha)	Tubulação Narishige	HD-21
para conectar a fonte de ar ao microinjetor
Carimbo de poço de ovo	impresso em 3D	personalizado	impresso em 3D em um Lulzbot Taz 5 usando termoplástico
Microondas	várias
incubadoras ou salas com temperatura controlada	várias		temperaturas de 23,5-26 ° C são necessários.
Comida de críquete	vários		alimentos para gatos ou flocos de peixe são alimentos apropriados.
Água de grilo	vairous		A água pode ser mantida em frascos e apresentada aos grilos através de bolas de algodão
Abrigo de críquete	arious		Os materiais de abrigo podem incluir toalhas de papel amassadas ou caixas de ovos
Tubos capilares de vidro	World Precision Instruments, Inc.	Item nº 1B100F-4	Kwik-Fil™ Capilares de vidro borossilicato, 100 mm de comprimento, 0,58 mm de diâmetro interno, 1,0 mm de diâmetro externo, com filamento
Extrator de micropipeta	Flaming/Brown	Modelo P-97	Distribuído pela Sutter Instrument Co.
Beveller/Micro moedor	Narishige	Modelo EG-45/EG-400	EG-400 inclui uma cabeça de microscópio
Placas de Petri	CellTreat	Código do produto 229693	90 mm de diâmetro
Play Sand	Sandtastik Products Ltd.	B003U6QLVS	Areia branca Agarose
	Bioanalytical	AB000972	Agarose GPG/LE ultrapure
Filtro de ovos: Malha de sarja extra fina Filtros cônicos de aço inoxidável	de suprimentos de cozinha dos EUA	SS-C123	O tamanho dos poros deve estar entre 0,5 - 1,0 mm
Penicilina Estreptomicina	Gibco da Life Technologies	Ref 15070-063	Caneta Strep
Pinças de plástico	Sipel Electronic SA	P3C-STD	Preto Dissipativo Estático, 118 mm
Filtros de seringa, 25 mm de diâmetro, 0,45 µ m	Nalgene	725-2545	Use com seringa de 1 mL
Seringa de 1 mL, com Ponta Deslizante de Tuberculina	Becton Dickinson	309602	Use com filtro de seringa para filtrar Tampão de Injeção, seringas de ponta Luer-Lok também funcionariam
Tanque de ar (opcional)	Midwest Products	Air Works®	Tanque de ar portátil
Corante de rodamina	Thermofisher	D-1817	dextrano, tetrametilrodamina 10.000MW,
pontas de carregamento de 20 mL	Eppendorf	Nº de pedido 5242 956.003	epT.I.P.S. 20 μ L Microloader
Microscópio composto	Zeiss	Axioskope 2 plus
20x objetiva	Ziess	Plan-Apochromat 20x/0.75 M27
Camera	Leica	DMC 5400
Leica Application Suite  software	Leica	LAS	Versão 4.6.2 usado aqui