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Biochemistry

अभिव्यक्ति, शुद्धि, क्रिस्टलीकरण, और फ्जाइम परख के Fumarylacetoaceate hydrolase डोमेन युक्त प्रोटीन

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59729
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1, 3, 3, 4, 1,2
1Research Institute for Biomedical Aging Research, University of Innsbruck Austria, 2Center for Molecular Biosciences Innsbruck (CMBI), University of Innsbruck Austria, 3Division of Genetic Epidemiology, Medical University of Innsbruck Austria, 4Faculty of Chemistry, Department of Organic Chemistry, University of Vienna Austria

Summary

fumarylacetoaceate hydrolase डोमेन युक्त प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि उदाहरण के साथ वर्णित है (ई. कोलाईमें अभिव्यक्ति , FPLC). शुद्ध प्रोटीन क्रिस्टलीकरण और एंटीबॉडी उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है और एंजाइम assays के लिए कार्यरत हैं. चयनित photometric परख oxaloaceate decarboxylase और acylpyruvate hydrolase के रूप में FAHD1 की बहु कार्यक्षमता प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं.

Abstract

फ्यूमैरिलेस्टोऐसीटेट हाइड्रोलेस (एफएएच) डोमेन युक्त प्रोटीन (एफएएचडी) यूकैरियोट में एफएएच सुपरफैमिली के सदस्यों की पहचान की जाती है। इस superfamily के एंजाइमों आम तौर पर बहु कार्यक्षमता प्रदर्शित, मुख्य रूप से hydrolase और decarboxylase तंत्र को शामिल. यह लेख एफएएचडी प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए लगातार तरीकों की एक श्रृंखला प्रस्तुत करता है, मुख्य रूप से एफएएचडी प्रोटीन 1 (एफएएचडी1) प्रजातियों के बीच ऑर्थोलॉग (मानव, माउस, सूत्रकृमि, पौधे, आदि)। कवर तरीकों ई कोलाई,आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी, आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी, तैयारी और विश्लेषणात्मक जेल निस्पंदन, क्रिस्टलीकरण, एक्स-रे विवर्तन, और photometric परख में प्रोटीन अभिव्यक्ति कर रहे हैं। शुद्धता के उच्च स्तर का केंद्रित प्रोटीन (gt; 98%) क्रिस्टलीकरण या एंटीबॉडी उत्पादन के लिए नियोजित किया जा सकता है. समान या निम्न गुणवत्ता के प्रोटीन एंजाइम assays में नियोजित किया जा सकता है या पता लगाने प्रणाली में प्रतिजन के रूप में इस्तेमाल किया (पश्चिमी ब्लॉट, एलिसा). इस कार्य की चर्चा में, FAHD1 की पहचान एंजाइमी तंत्र और अधिक विस्तार में अपने hydrolase और decarboxylase द्वि-कार्यक्षमता का वर्णन करने के लिए रेखांकित कर रहे हैं.

Introduction

फुमरीलेटोऐसीट हाइड्रोलेस (एफएएच)1,एंजाइमों के2 सुपरफैमिली एंजाइमों के एक समूह का वर्णन करते हैं जो अत्यधिक संरक्षित उत्प्रेरक एफएएच डोमेन3,4,5,6 का हिस्सा है , 7 , 8 , 9 , 10.अपने सामान्य उत्प्रेरक केंद्र के बावजूद, ये एंजाइम बहु-कार्यात्मक होते हैं, और अधिकांश प्रोकैरियोट में पाए जाते हैं, जहां उनका उपयोग जटिल कार्बन स्रोतों से प्राप्त यौगिकों को तोड़ने के लिए किया जाताहै 3. इस परिवार के केवल तीन सदस्यों की पहचान अब तक यूकैरियोट में की गई है: एफएएच2देने का नाम, साथ ही साथ एफएएच डोमेन युक्त प्रोटीन 1 (एफएएफडी1)11,12,13,14 ,15 और FAH डोमेन युक्त प्रोटीन 2 (FAHD2). FAHD1 की कमी बिगड़ा mitochondrial श्वसन13के साथ जुड़ा हुआ है 13,16 और सेलुलर जीर्णता phenotypeके एक प्रतिवर्ती प्रकार के साथ जुड़ा हुआ है कि मध्यवर्ती क्षमता से जुड़ा हुआ है इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली में कमियों. मानव FAHD1 और मॉडल सिस्टम में इसके orthologues (माउस, सूत्रकृमि, कैंसर सेल लाइनों, पौधों, आदि), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चयनित बिंदु उत्परिवर्तन वेरिएंट, संभावित हित के drugable लक्ष्य बन गए हैं. इस शोध के लिए, शुद्धता के उच्च स्तर पर रिकॉमबिनेंट प्रोटीन, साथ ही क्रिस्टल संरचनाओं और चयनात्मक एंटीबॉडी द्वारा निर्देशित उत्प्रेरक तंत्र पर जानकारी महत्वपूर्ण हैं।

इस पांडुलिपि ई. कोलाईमें FAHD प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए तरीकों का वर्णन, आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी, आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी, अमोनियम सल्फेट वर्षा, पूर्वोक्ति और विश्लेषणात्मक जेल निस्पंदन, क्रिस्टलीकरण, एक्स-रे विवर्तन, और फोटोमितीय परख. यहाँ वर्णित विधियों और प्रोटोकॉल का उद्देश्य बैक्टीरिया, संयंत्र जीव विज्ञान, साथ ही पशु और मानव अध्ययन के रूप में विभिन्न क्षेत्रों में काम कर रहे वैज्ञानिकों के लिए मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए है, FAH superfamily के सदस्यों की विशेषता, सहित असामान्य superfamily सदस्यों वे एक विशेष क्षेत्र में प्रासंगिक हो जाना चाहिए. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल अन्य prokaryotic या यूकैरियोटिक एफए superfamily सदस्यों की विशेषता के लिए लक्ष्य परियोजनाओं के लिए मूल्यवान समर्थन प्रदान कर सकते हैं.

यहाँ वर्णित तरीकों के पीछे तर्क तथ्य यह है कि खराब वर्णित प्रोटीन की विशेषता के लिए (विशेष रूप से, अज्ञात शारीरिक प्रासंगिकता के चयापचय एंजाइमों), शुद्ध पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ शुरू करने के लिए दृष्टिकोण की अनुमति देता है इस तरह के इन विट्रो सक्रिय एंजाइम की तैयारी, उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी, और चयनित एंजाइमों के लिए शक्तिशाली और विशिष्ट औषधीय अवरोधकों के रूप में अमूल्य, उच्च गुणवत्ता वाले अनुसंधान उपकरणों का विकास। वर्णित विधियों में तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक तरीकों (उदाहरण के लिए, रासायनिक प्रेरण के बिना प्रोटीन व्यक्त करने के लिए, या गर्मी उपचार desalting और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के बाद के बाद centrifugation द्वारा प्रोटीन शुद्धि प्रदर्शित करने के लिए), कहीं और पाया जा सकता है17. जबकि तरीकों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम की अभिव्यक्ति और FAH superfamily एंजाइमों की शुद्धि के लिए उपलब्ध है2,7,9,17,18, इस काम अभिव्यक्ति पर केंद्रित है और विशेष रूप से एएफडी प्रोटीन की शुद्धि।

इस पांडुलिपि के चर्चा अनुभाग में, एएचओडी1 प्रोटीन (हाइड्रोलेस, डेकार्बोक्सिलस)15 के लिए पहचाने गए उत्प्रेरक तंत्र को और अधिक विस्तार से वर्णित किया गया है, ताकि उत्प्रेरित प्रतिक्रियाओं के रासायनिक चरित्र को प्रदर्शित किया जा सके। पिछले कामकेआधार पर प्राप्त डेटा 7,15,18 (PDB: 6FOG, PDB:6FOH) के रूप में एंजाइम की एक तीसरी गतिविधि का संकेत है keto-enol isomerase.

Protocol

1. सक्षम ई. कोलाई में एएफडी प्रोटीन की अभिव्यक्ति

  1. एफ़एडी प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए वेक्टर के साथ ई कोलाई का परिवर्तन
    नोट: निम्नलिखित खंड में चर्चा की गई चरणों को चित्र 1क, खमें स्केच में संक्षेप किया गया है। एक ही प्रोटोकॉल बिंदु-म्यूटेंट वेरिएंट सहित किसी भी FAHD प्रोटीन के लिए लागू होता है। इस तरह के वेरिएंट साइट निर्देशित mutagenesis और पीसीआर तकनीक के माध्यम से प्राप्त किया जा सकताहै 19 (जैसे दो तरफा SOE पीसीआर20के रूप में) जंगली प्रकार cDNA से.
    Figure 1
    चित्र 1 : सक्षम ई. कोलाई के प्रवर्धन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के प्रेरण.
    (क) अनुभाग 1 में वर्णित सक्षम BL21(DE3) pLys S e. कोलाई बैक्टीरिया में pET सदिश का प्रवेश। (बी) हीट शॉक प्रोटोकॉल और पीईटी की चढ़ाना ने प्रोटोकॉल के चरण 1 में वर्णित ई. कोलाई बैक्टीरिया को बदल दिया। परिवर्तित बैक्टीरिया चयन के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एलबी आगर प्लेटों पर चढ़ाया जाता है। (ग) पीईटी का प्रवर्धन, खंड 1 में वर्णित ई. कोलाई जीवाणु परिवर्तित। कालोनियों एक एलबी agar प्लेट से उठाया और पौष्टिक माध्यम में परिलक्षित कर रहे हैं (एलबी या N$CYM) जब तक जीवाणु घनत्व 0.4 के अनुभवजन्य सीमा तक पहुँच गया. (घ) धारा 1 में वर्णित DE3-IPTG-PET प्रणाली के माध्यम से प्रोटीन अभिव्यक्ति को शामिल करना और चित्र 2में वर्णित। प्रोटीन उत्पादन रासायनिक IPTG के आवेदन द्वारा शुरू कर दिया है. अनुभाग 1 के अंत में, प्रोटीन युक्त जीवाणु गोली काटा जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
    1. सक्षम BL21(DE3) pLysS ई. कोलाई बैक्टीरिया और एक pET अभिव्यक्ति वेक्टर प्राप्त (सामग्री की तालिकादेखें). प्राथमिकता से एक pET वेक्टर चुनें जो निम्न शुद्धि चरणों को सरल बनाने के लिए सुविधा के लिए एकN-टर्मिनल हि-टैग या संबंधित कैप्चर टैग को भी एन्कोड करता है।
    2. पसंद के एएफडी प्रोटीन का सी डीएनए प्राप्त करें और इसे क्रमशः टी 7 प्रमोटर और टी 7 टर्मिनेटर साइटों के बीच पीईटी अभिव्यक्ति वेक्टर के सक्रिय क्लोनिंग साइट में डालें।
    3. सफल प्लाज्मिड प्रवर्धन और सत्यापन के बाद [एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता द्वारा अनुक्रमण के माध्यम से (T7 प्राइमर सुविधा के लिए pET प्रणाली के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है: T7 प्रमोटर, आगे प्राइमर: TAATACGACTACTATAGGG; T7 टर्मिनेटर, रिवर्स प्राइमर: GCTAGTTATTGCTCAGCGG)], 5-10 एनजी प्लाज्मिड को सक्षम BL21(DE3) pLys ई. कोलाई बैक्टीरिया के 100 डिग्री एल में डालदें। ऊपर और नीचे aspirate मत करो, लेकिन थोड़ा के साथ ट्यूब नल क्रम में सामग्री मिश्रण करने के लिए.
    4. 30 मिनट के लिए बर्फ पर बैक्टीरिया रखें, धीरे से हर कुछ मिनट ट्यूब दोहन.
    5. एक हीटिंग डिवाइस या पानी के स्नान को 42 डिग्री सेल्सियस (सटीक) को गर्म करें। उपकरण में बैक्टीरिया युक्त ट्यूब रखो और उन्हें 90 s (सटीक) के लिए रखें. उन्हें तुरंत बर्फ पर रखो (चित्र 1क)
    6. बर्फ पर 5-10 मिनट के बाद, एनसीजेडवाईएम माध्यम का 600 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (सामग्री की सारणीदेखें) और ट्यूब को एक बैक्टीरिया इनक्यूबेटर में डाल दीजिए। 1 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए दिशा के साथ मध्यम गति उन्मुख पर ट्यूब हिलाओ।
    7. प्लेट 200 डिग्री जीवाणु संस्कृति के एक 10 सेमी LB-agar प्लेट पर (सामग्री की तालिकादेखें), पसंद के चयन एंटीबायोटिक दवाओं युक्त [उदाहरण के लिए, BL21(DE3) pLys प्रतिरोध के लिए एक विशिष्ट (chloramphenicol), और प्रतिरोध के लिए एक पीईटी वेक्टर पर एनकोडेड (कानामीसिन या एम्पिसिलिन, चित्र 1B)].
    8. रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक जीवाणु इनक्यूबेटर में एलबी-एगर प्लेट पर बैक्टीरिया को संस्कृति दें।
  2. IPTG प्रेरण द्वारा FAHD प्रोटीन की अभिव्यक्ति
    नोट: निम्नलिखित खंड में चर्चा किए गए पहले चरण को चित्र 1C, Dमें एक स्केच के रूप में सारांशित किया गया है। जीवाणु DE3 कैसेट और पीईटी वेक्टर प्रणाली के संयोजन के माध्यम से T7 अभिव्यक्ति प्रणाली चित्र 2में संक्षेप में प्रस्तुत की गई है।
    Figure 2
    चित्र 2 : DE3 कैसेट /
    (क) पीईटी सदिश के स्केच किए गए जीनोम ने बीएल 21(DE3) प्लास ई. कोलाई जीवाणुओं को रूपांतरित किया। देशी जीवाणु जीनोम एक DE3 कैसेट किया जाता है (पैनल बी देखें), साथ ही साथ एक लाख जीन है कि लगातार लाख दमनकारी इकाइयों को व्यक्त करता है. गैर-नेटिव पीईटी वेक्टर में टी 7 पॉलिमरेज प्रवर्तक और टर्मिनेटर अनुक्रम के बीच डाले गए प्रोटीन जीन को किया जाता है। पैनल बी (बी) देशी जीवाणु जीनोम के DE3 कैसेट एक ई कोलाई आरएनए पॉलिमरेज operon के संदर्भ में T7 polymerase के लिए जानकारी encodes. हालांकि, यह प्रोटीन इसलिए व्यक्त नहीं किया जाता है क्योंकि लाख दमनकारी इकाई आरएनए पॉलिमरेज प्रोटीन को बाइंडिंग से रोकती है। अतः कोई टी7 पॉलिमरेज व्यक्त नहीं किया जाता है और कोई बहिर्जात प्रोटीन व्यक्त नहीं किया जाता. (ग) रासायनिक आई पीटी जी (सामग्री तालिका) का अनुप्रयोग लाख दमनकारी इकाइयों की संरचना को विकृत करता है और उन्हें डीईए3 कैसेट के लिए बाध्य होने से रोकता है। नतीजतन, आरएनए पॉलिमरेज अब कैसेट से बांध सकता है, जिसके लिए T7 पॉलिमरेज व्यक्त किया जाता है, जैसा कि अंततः exogenous प्रोटीन होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
    1. सफल कॉलोनी गठन के बाद, एक एकल कॉलोनी लेने (किसी भी उपग्रह कालोनियों के बिना) और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ N$CYM या LB माध्यम के 5 एमएल में इसे फैलाने, पहले के रूप में चयनित (कदम 1.1.7). जीवाणु इनक्यूबेटर में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति (चित्र 1C) .
    2. सफल जीवाणु विकास के बाद, प्रोटीन मात्रा की मांग के आधार पर 250 एमएल, 500 एमएल, या मध्यम के 1 एल बैचों में बैक्टीरिया बढ़ाना।
      1. मात्रा के लिए उपयुक्त, चरण 1.1.7 में किए गए अनुसार चयनित एंटीबायोटिक दवाओं को लागू करें और घने जीवाणु पूर्व-संस्कृति (यानी, 2.5-5.0 एमएल से 250 एमएल की मात्रा, आदि) के बारे में 1%-2% जोड़ें। चरण 1.2.5 (1 एमएल या अधिक) में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक नमूना ले लो और 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) की जाँच करें। 2-3 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणु इनक्यूबेटर में संस्कृति जीवाणु (चित्र 1ब्) ।
    3. 2-3 ज के बाद, फोटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एक नमूना ड्रा करें। यदि 600 एनएम पर ओड 0.4 तक पहुंच गया है, तो 1 मीटर तक 200 डिग्री सेल्सियस लागू करें isopropyl-जेड-डी-थायोगालैक्टोपाइरानोसिड (IPTG, सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: वास्तविक मूल्य प्रत्येक FAHD प्रोटीन या बिंदु उत्परिवर्तन संस्करण है, जहां 1 एमएम IPTG अधिकतम है कि लागू किया जाना चाहिए के लिए अनुभवजन्य है. यह प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है (चित्र 1D, चित्र 2C) .
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणु इनक्यूबेटर में 3-5 घंटे के बाद, प्रोटीन अभिव्यक्ति समाप्त हो जाती है।
      नोट: तापमान नियंत्रण पर टिप्पणी के लिए चर्चा अनुभाग देखें. प्रेरण के बाद मिलाते हुए की 5 एच से अधिक समय की सिफारिश नहीं की जाती है। चरण 1.2.5 (1 एमएल या अधिक) में उपयोग के लिए एक नमूना लें और 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) की जांच करें।
      1. 5 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रण के माध्यम से जीवाणु गोली फसलें। सुपरनेंट को त्याग दें और लंबे समय तक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर गोली को फ्रीज करें या संक्षिप्त भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें (चित्र 1डी) ।
    5. दो पुनः प्राप्त photometric नमूने के माध्यम से प्रेरण की जाँच करें, जो लेबल हैं "-I" (प्रेरण से पहले) और "+I" (प्रेरण के बाद). अपकेंद्रण और जीवाणु गोली के resuspension के बाद, कुल प्रोटीन की एक ही राशि लोड करके एसडीएस-पेज द्वारा दो नमूनों का विश्लेषण.
      नोट: "+मैं" नमूना चुना प्रोटीन के आणविक वजन के साथ जुड़े एक मजबूत बैंड प्रदर्शित करना चाहिए, जबकि "मैं" नमूना इस बैंड शामिल नहीं होना चाहिए. एक कम प्रेरण स्तर प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक आम समस्या है, फिर भी व्यक्त प्रोटीन का स्तर अक्सर निम्नलिखित चरणों के लिए पर्याप्त है. एक उच्च प्रेरण स्तर एक लाभ है, लेकिन अनिवार्य नहीं है।

2. जीवाणु छर्रों और मलबे के निस्पंदन के Lysis

  1. इस पर निर्भर करता है कि क्या चुना प्रोटीन उसकी-टैग या अनटैग्ड है, नि-एनटीए चल बफर का चयन करें (उनकी-टैग, सामग्री की तालिकादेखें ) या बर्फ-ठंडा HIC बफर चल रहा है (अनटैग्ड).।
  2. मूल जीवाणु निलंबन के प्रत्येक 250 एमएल के लिए, जीवाणु गोली (5 एमएल 250 एमएल के लिए, 500 एमएल के लिए 10 एमएल, आदि) के लिए चयनित बफर के 5 एमएल लागू करें। लागू बफर के 5 एमएल प्रति 10 एल $-mercaptoethanol (जेड-एमई) जोड़ें। एक 10 एमएल पाश्चर पाइपका उपयोग करने के लिए यंत्रवत् खरोंच और pipeting द्वारा निलंबन में गोली मजबूर (हवा बुलबुला गठन से बचने जबकि pipeting). अंततः एक 50 एमएल ट्यूब में निलंबन के सभी हस्तांतरण.
  3. विशेष रूप से sonicate (6x मध्यम बल पर 15 s के लिए) निलंबन.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर उच्च गति (10,000 x ग्राम) पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। बर्फ पर फ़िल्टर इकाइयों (उदा., 0.45 डिग्री, 0.22 डिग्री मी) के साथ सुपरनेंट को लगातार फ़िल्टर करें।
    नोट: पिछले centrifugation कदम पर निर्भर करता है, एक छोटे फिल्टर pores आकार के माध्यम से सीधे निस्पंदन थकाऊ हो सकता है और आम तौर पर एक बड़ा छिद्र आकार के माध्यम से पूर्व निस्पंदन की आवश्यकता है। DNAse बेहतर परिणाम के लिए जोड़ा जा सकता है.
  5. बर्फ पर नमूना स्टोर और या तो अनुभाग 3 या 4 के साथ तुरंत आगे बढ़ना, कि क्या प्रोटीन अपनेटैग या untagged है पर निर्भर करता है.

3. नी-एनटीए एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके उनकेटैग किए गए एफ़एडी प्रोटीन का शुद्धिकरण

नोट: Ni2 + आयनों nitrilotriacetic एसिड के माध्यम से बाध्य कर रहे हैं (NTA) एक agarose राल कि आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी में प्रयोग किया जाता है के लिए (अस्थिर धातु आयन वर्णलेखविज्ञान, IMAC, चित्रा 3A). पाली-हिस्टिडीन एमिनो एसिड टैग इस नी-चेलेट के लिए दृढ़ता से बाँध, और उनके टैग प्रोटीन शेष प्रोटीन के बहुमत से अलग किया जा सकता है. Ni-NTA स्तंभों की वर्णित तैयारी के लिए एक विकल्प prepacked Ni-NTA कॉलम और एक FPLC प्रणाली का उपयोग कर रहा है.

Figure 3
चित्र 3 : वर्णलेख के सामान्य प्रकार के स्केच किए गए चित्र।
(ए) एक नी-एनटीए कॉलम का राल। एनटीए के पास द्विसंयोजक निकल आयन हैं जिनका उपयोग स्थिर धातु आयन एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी (आईएमए) के संदर्भ में किया जाता है। पाली-हिस्टिडाइन टैग इस आकृति के लिए अधिमानतः बांधते हैं और इमिडाज़ोल द्वारा eluted किया जा सकता है। (बी) एक फिनाइल आधारित हाइड्रोफोबिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी (एचआईसी-फ़ेनिल) में सिलिका कणों की विशिष्ट कोटिंग। हाइड्रोफोबिक प्रोटीन कोटिंग सामग्री के साथ बातचीत और उनके प्रवास में देरी कर रहे हैं, जबकि दूसरों को नहीं कर रहे हैं. (सी) आयनिक अन्योन्यक्रिया क्रोमैटोग्राफी में सिलिका कणों की विशिष्ट कोटिंग। Polarized और आरोप लगाया प्रोटीन कोटिंग सामग्री के साथ बातचीत और उनके प्रवास में देरी कर रहे हैं, जबकि दूसरों को नहीं कर रहे हैं. (डी) आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) में सिलिका जेल का राल। सिलिका सामग्री में परिभाषित pores के आधार पर, प्रोटीन उनके आकार से अलग किया जा सकता है (एक पहले सन्निकटन में उनके आणविक द्रव्यमान के लिए इसी). छोटे प्रोटीन छिद्रयुक्त स्तंभ सामग्री को व्याप्त करते हैं और मंद हो जाते हैं, जबकि बड़े प्रोटीन छिद्रयुक्त कणों के चारों ओर तेजी से स्थानांतरित होते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. चरण 2.5 से आगे बढ़ें (यानी, प्रोटीन नि-एनटीए में बफर चल रहा है और बर्फ पर 0ण्22 डिग्री मीटर फिल्टर इकाइयों द्वारा फ़िल्टर किया गया है)।
  2. खाली कॉलम को धोने और इसे एक स्थिर सेवक को संलग्न करके एक खाली प्लास्टिक या कांच कॉलम तैयार करें। प्रोटीन निलंबन की मात्रा के आधार पर स्तंभ का आकार चुनें.
  3. प्रोटीन निलंबन के प्रत्येक 10 एमएल के लिए, कॉलम में Ni-NTA agarose घोल के 500 $L लागू करें (उपयोग से पहले भारी हिलाना). एक पिपेट का उपयोग कर स्तंभ के नीचे फिल्टर पर धीरे धीरे घोल और dropwise लागू करें। कॉलम को व्यवस्थित होने दें, जिसमें कुछ सेकंड लगते हैं।
  4. कॉलम पूरी तरह से Ni-NTA बफर चल रहा है, agarose राल को बाधित करने के लिए नहीं सुनिश्चित करने के साथ भरें। बफर गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से चलाने के लिए करते हैं। प्रक्रिया तरल पर अंगूठे का दबाव लागू करने से त्वरित किया जा सकता है (एक ढक्कन या दस्ताने और अंगूठे के दबाव का उपयोग कर), लेकिन ध्यान रखना agarose राल विकृत नहीं है.
  5. प्रोटीन निलंबन लागू करें. पहले की तरह, नमूना गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से चलाने के लिए करते हैं। अंगूठे के दबाव का उपयोग कर इस कदम में तेजी लाने की सिफारिश नहीं है, के रूप में स्तंभ के लिए प्रोटीन की बाध्यकारी अगर प्रवाह दर कम है बढ़ाया है. प्रवाह-थ्रू को किसी नली में एकत्र कीजिए (सामग्रीसारणी)।
  6. नमूना के माध्यम से पारित कर दिया गया है के बाद, पूरे स्तंभ फिर से Ni-NTA बफ़र चल रहा है के साथ भरें। आगारोस राल को बाधित न करने का ध्यान रखें। नमूना गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से चलाने के लिए करते हैं, लेकिन पिछले कदम के विपरीत, अंगूठे के दबाव के माध्यम से प्रक्रिया को तेज करने की सिफारिश की है, क्योंकि unspecific बातचीत के संभावित संदूषण इस तरह से बाधित किया जा सकता है. एक ट्यूब में धोने समाधान ले लीजिए. इस चरण को दोहराएँ.
  7. कॉलम के नीचे एक यूवी-पारदर्शी cuvette रखें और Ni-NTA elution बफर के 1 एमएल लागू होते हैं। राल के लिए किसी भी अंगूठे का दबाव लागू करने के बिना नमूना ले लीजिए.
  8. 280 एनएम बनाम एक खाली नमूना (यानी, Ni-NTA elution बफर) पर नमूना के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) की जाँच करें। इष्टतम रूप से, नमूना 2.5 से अधिक की एक OD प्रदर्शित करता है। 0.5 से नीचे एक ओडी का अर्थ है कि नमूने में प्रोटीन की कोई महत्वपूर्ण मात्रा नहीं है।
    नोट: के रूप में चर्चा अनुभाग में उल्लिखित, नमक और elution बफर के imidazole सांद्रता व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक FAHD प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा करने के लिए हो सकता है.
  9. दोहराएँ कदम 3.1.7 और 3.1.8 जब तक OD 0.5 से नीचे गिर जाता है. बर्फ पर एक ट्यूब में उच्च ओडी के साथ सभी नमूनों पूल.
  10. चरण 3.1.4 के साथ फिर से प्रारंभ करें, चरण 3.1.5 के इस पुनरावृत्ति के लिए नए इनपुट के रूप में चरण 3.1.5 से प्रवाह-थ्रू का उपयोग करके. चरण 3.1.6 में संग्रहीत पहला नमूना 0.5 से नीचे एक OD प्रदर्शित करता है जब तक इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
    नोट: जैसा कि चर्चा अनुभाग के समस्या निवारण भाग में बताया गया है, उसके टैग किए गए प्रोटीन अपर्याप्त रूप से Ni2+-Resin से बाइंड कर सकते हैं। ऐसे मामलों में, इस कदम या वैकल्पिक तरीकों की पुनरावृत्ति (जैसे, आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी) की आवश्यकता होती है।
  11. SDS-पेज विश्लेषण के लिए सभी मध्यवर्ती भागों के नमूने ले लो.
  12. Ni-NTA elution बफर में FAHD प्रोटीन ठंड और thawing पर वेग होगा. इसलिए, एक अलग बफर के खिलाफ प्रोटीन dialyze (बर्फ पर रात भर, डायलिसिस बफर के प्रति 100 एमएल डीटीटी के 1 $L का उपयोग). इस चरण के बाद आयन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी के प्रकार के आधार पर कम नमक बफर का उपयोग करें। 14 केडीए (सामग्री की तालिका) के एक विशिष्ट आणविक वजन कट-ऑफ के साथ सामान्य सेलूलोज़ ट्यूबिंगकाउपयोग करें।
  13. रात भर डायलिसिस के बाद, वैकल्पिक रूप से अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूगेशन फिल्टर इकाइयों का उपयोग कर प्रोटीन ध्यान केंद्रित। प्रदर्शन एसडीएस-पेज विश्लेषण (12.5% चल जेल, 4% स्टैकिंग जेल) प्रोटीन की संभावित हानि के लिए जाँच करने के लिए, अपर्याप्त elution, और सामान्य रूप में प्रोटीन शुद्धता. यदि सब ठीक है, तो अनुभाग 5 पर जाएँ.

4. हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी (एचआईसी) के माध्यम से अनटैग्ड एएचडी प्रोटीन का शुद्धिकरण

नोट: FPLC के लिए एक HIC कॉलम में एक सिलिका जेल की कोटिंग सतह पर Phenyl समूहों (चित्र 3 B) हाइड्रोफोबिक चरित्र के अनुसार प्रोटीन की जुदाई सक्षम करें। वर्णित कदम एचआईसी-फ़ेनिल कॉलम के 5 एमएल से सुसज्जित एक FPLC सिस्टम के साथ किया जाना चाहिए। कॉलम विभिन्न प्रोटीन के लिए पुन: उपयोग किया जा करने के लिए 1 एम NaOH के साथ धोया जा सकता है। हालांकि, एक बार FAHD प्रोटीन के एक प्रकार के लिए इस्तेमाल कॉलम केवल प्रोटीन के इस प्रकार के लिए पुन: उपयोग किया जाना चाहिए.

  1. अमोनियम सल्फेट (एएस) वर्षा
    1. चरण 2.5 से आगे बढ़ें. प्रोटीन बर्फ ठंडा HIC चल बफर में है (सामग्री कीमेज).
    2. तैयार प्रोटीन घोल की मात्रा का सूक्ष्मलीटर (Vप्रारंभिक) ठीक से आकलन करें। धीरे-धीरे और ड्रॉप-वार बफर के रूप में समाधान चल रहे पूर्व ठंडा HIC जोड़ें, जब तक कि एक 35 मात्रा-% संतृप्ति तक पहुँच गया है: वीएएस जोड़ा गया ] वीप्रारंभिक * 0.538। धीरे से 30 मिनट के लिए समाधान हलचल. उच्च गति पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज ($10,000 x g) 4 डिग्री सेल्सियस पर.
    3. बर्फ पर एक 0.22 डिग्री फिल्टर इकाई का उपयोग कर supernatant फ़िल्टर. वैकल्पिक रूप से, एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए एक नमूना लें: 1:4 को पतला करें और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत गर्मी करें या नमूना गांठ होगा। नमूना एक और दिन आगे बढ़ने के क्रम में इस बिंदु (-20 डिग्री सेल्सियस) पर जमे हुए किया जा सकता है।
  2. HIC स्तंभ का उपयोग करके FPLC
    1. FPLC प्रणाली सेटअप और 5 कॉलम संस्करणों के साथ एक 5 mL HIC-फ़ेनिल कॉलम (सीवी) 20% EtOH (एच2ओ में) के साथ बराबर है एच2हे के 5 CV द्वारा पीछा किया.
    2. HIC चल बफर (exact) के 260 एमएल के मिश्रण के रूप में बफर (exact) चल HIC के 140 एमएल के साथ. यह एक 35 वॉल्यूम-% के रूप में समाधान में परिणाम है। पीएच (7.0) की जाँच करें; यह बफ़र A. बफ़र B 250 mL है जो बफ़र चला रहा है. दोनों बफ़र्स ए और बी में 1 एमएम डीटीटी जोड़ें, फिर उन्हें बर्फ पर रखें।
    3. इस क्रम में बफ़र ए, बफर बी के 8 एमएल, और बफर ए के 8 एमएल के साथ कॉलम को बराबर कर दें। प्रोटोकॉल चरण 4.1 में तैयार नमूना लागू करें। बफर ए के साथ धो लें, जब तक 280 एनएम पर आधारभूत ऑप्टिकल अवशोषण 1000-500 MAU तक पहुँचता है।
    4. बफ़र्स ए और बी का मिश्रण लागू करें, ताकि एएस की सांद्रता 33 % (w/v) हो। 1 CV के साथ धो लें, जिसके परिणामस्वरूप क्रोमैटोग्राम में एक पठार हो जाता है। बफर बी (समय के साथ 100% बफर बी तक) की एक ढाल सेट करें: 3.8 मिनट में बफर बी के 1.5 एमएल (यानी, 1% B/mL ढलान के साथ 5.7% बफर बी)। जब 280 एनएम पर यूवी संकेत उगता है, अंश इकट्ठा करने और इसे तुरंत बर्फ पर जगह शुरू करते हैं।
    5. अंत में, स्तंभ को बफ़र B से धो लें. SDS-पेज विश्लेषण के लिए सभी भागों के नमूने ले लो. तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर सभी नमूनों फ्रीज, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    6. एकत्र अंशों में FAHD प्रोटीन का पता लगाने के लिए एसडीएस-पेज (और पश्चिमी धब्बा) विश्लेषण प्रदर्शन। भिन्न है कि प्रोटीन होते हैं जमा और आगे शुद्धि करने के लिए लागू कर रहे हैं, के रूप में निम्नलिखित प्रोटोकॉल चरणों में उल्लिखित. H 2 O और 20% ETOH (एच2ओ में) के साथ कॉलम धो लें।

5. आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से एएचडी प्रोटीन की शुद्धि

नोट: आवेशित कार्यात्मक समूहों वाले अणु एफपीएलसी के लिए सिलिका कण स्तंभ से बंधे होते हैं (चित्र 3ं) । यह प्रोटीन के विभेदन को उनके आयनिक वर्ण, जैसे पृष्ठ आवेश के अनुसार सक्षम बनाता है। वर्णित कदम एक FPLC मशीन और संबद्ध पता है कि कैसे, क्रमशः के साथ किया जाना चाहिए. वर्णित विधि या तो धनात्मक या anionic विनिमय क्रोमैटोग्राफी के लिए एक ही है, लेकिन इस्तेमाल किया जा करने के लिए बफ़र्स थोड़ा अलग हैं.

  1. काचुना या anionic विनिमय क्रोमैटोग्राफी प्रणाली चुना. यह विकल्प अनुभवजन्य है और FAHD प्रोटीन के बीच भिन्न हो सकते हैं. इष्टतम रूप से, दोनों तरीकों लगातार इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. FPLC प्रणाली सेटअप और 20% EtOH के 5 CV के साथ कॉलम धोने (एच2ओ में), इसके बाद एच2ओ के 5 CV द्वारा इस क्रम में कम नमक बफर, उच्च नमक बफर, और फिर कम नमक बफर के 1 CV के साथ स्तंभ बराबर है।
  3. नमूना लागू करें (सही कम नमक बफर के खिलाफ चरण 3.1.11) से स्तंभ पर लागू करें. प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए. कम नमक बफर के साथ 1 CV के लिए कॉलम धो लें.
  4. एक ढाल elution सेटअप: 100% उच्च नमक बफर में 30 मिनट की एक प्रवाह दर पर 1 mL/min, या 60 मिनट की एक प्रवाह दर पर 0.5 mL/min. यह एक पहले से ही ज्ञात FPLC क्रोमैटोग्राम के आधार पर फिर से चुना जा सकता है, ताकि शुद्धि का अनुकूलन करने के लिए. सभी शिखर भिन्न ले लीजिए.
    नोट: उच्च नमक की स्थिति FAHD प्रोटीन के बीच भिन्न हो सकते हैं, के रूप में चर्चा अनुभाग में उल्लिखित.
  5. ग्रेडिएंट समाप्त होने के बाद, उच्च नमक बफर के साथ चलाएँ जब तक कि 1 CV (अंश एकत्र करें) की श्रेणी में कोई और चोटियों का पता नहीं चलता है।
  6. सभी एकत्र भिन्नों के नमूने ले लो और एसडीएस-पेज विश्लेषण प्रदर्शन (12.5% चल जेल, 4% स्टैकिंग जेल). तरल नाइट्रोजन में अलग-अलग नमूनों को फ्रीज करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  7. एसडीएस-पेज विश्लेषण पूरा होने के बाद, एफ़एपीएचडी प्रोटीन युक्त नमूनों को पूल करें और दूसरों को त्यागें। वैकल्पिक रूप से, अल्ट्रा-सेंचुरीशन फिल्टर इकाइयों का उपयोग करप्रोटीन को ध्यान में केंद्रित करें।
  8. कॉलम को साफ करने के लिए 0.5 एम NaOH (या अन्य डिटर्जेंट) में 25% एसडीएस का 1 एमएल लागू करें। H 2 O और 20% ETOH (एच2ओ में) के साथ कॉलम धो लें।
  9. वैकल्पिक रूप से, वैकल्पिक स्तंभ (कैनिक या एनिओनिक एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी) के साथ अनुभाग 5 दोहराएँ। इस विधि से प्राप्त प्रोटीन पर्याप्त रूप से बुनियादी गतिविधि assays प्रदर्शन करने के लिए शुद्ध है या क्रिस्टलोग्राफी के लिए स्क्रीनिंग परख में इस्तेमाल किया जा सकता है. उन्नत अनुप्रयोगों के लिए, अनुभाग 6 के साथ आगे बढ़ें.

6. आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) के माध्यम से एएचएडी प्रोटीन की शुद्धि

नोट: FPLC के लिए एक सिलिका जेल कॉलम में पोरस कणों आणविक आकार के अनुसार प्रोटीन के भेदभाव को सक्षम, जैसे हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या (चित्र 3 डी)। एसईसी कॉलम का उपयोग करते हुए, वर्णित चरणों को एक FPLC सिस्टम के साथ किया जाना है।

  1. एक एसईसी कॉलम चुनें, जो अभी भी मौजूद संदूषण के आणविक वजन पर निर्भर है, जैसा कि एसडीएस-पेज और चांदी के दाग के माध्यम से पता चला है। रेखांकित विधि दोनों स्तंभों के लिए उपयुक्त है। एच2ओ के 400 एमएल के साथ रात भर कॉलम को धोएं और एसईसी चल बफर के साथ बराबर करें। इस चरण को स्वचालित करने के लिए FPLC सिस्टम के लिए कोई प्रोग्राम लिखने के लिए अनुशंसा की जाती है।
  2. एसईसी के 300 एमएल बफर में 1 एमएम डीटीटी जोड़ें और इसे बर्फ पर डाल दें। यह चल रहे बफ़र है। इस बफ़र का 60 एमएल स्तंभ पर लागू करें.
  3. किसी भी सूक्ष्म वर्षा को दूर करने के लिए प्रोटीन नमूना (10,000 x ग्राम 10 मिनट के लिए) को सेंट्रीफ्यूज करें। स्तंभ पर महादलित लागू करें. यह आम तौर पर FPLC से पहले supernatant फिल्टर करने के लिए सिफारिश की है.
  4. सभी प्रोटीन eluted है जब तक स्तंभ के लिए चल रहे बफर लागू करें. उपयुक्त मात्रा (उदा., 2 एमएल) के अंशों में सभी चोटियों लीजिए। एसडीएस-पेज के लिए नमूने लें और तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके सभी भिन्नों को फ्रीज करें। जमे हुए भिन्नों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
  5. एसडीएस-पेज (और पश्चिमी दाग) विश्लेषण के बाद, एफएएचडी प्रोटीन युक्त सभी भिन्न एकत्र और पूल करें। चांदी धुंधला मामूली संदूषण है कि अभी भी मौजूद हो सकता है का पता लगाने के लिए सिफारिश की है.
  6. प्रोटीन ध्यान केंद्रित करने के लिए अल्ट्रा-सेंड्रिफ्यूजेशन फिल्टर इकाइयों का उपयोग करें। हालांकि FAHD प्रोटीन के लिए अनिवार्य नहीं है, सामान्य रूप में एक desalting कदम (जैसे, डायलिसिस द्वारा) एंजाइम assays और क्रिस्टलीकरण के लिए सिफारिश की है.
  7. 6-3-6.6 विभिन्न प्रवाह दरों और नमक सांद्रता (अनुभव) के साथ कई बार चरणों को दोहराएँ ताकि एएचएडी प्रोटीन की शुद्धता में वृद्धि हो सके। H2O और 20% ETOH (एच2ओ में) के साथ रात भर कॉलम धो लें।

7. बुनियादी FAHD गतिविधि सबस्टरेट oxaloacetate और एसिटाइलपाइरुटेट के साथ परख

नोट: FAHD प्रोटीन 1 (FAHD1) oxaloaceate decarboxylase (ODx) और acylpyruvate hydrolase (APH) गतिविधि प्रदर्शित करता है. यह चर्चा अनुभाग में अधिक विस्तार से बताया गया है। जलीय समाधान (यानी, enolization) में केटो-इनोल tautomerization द्वारा अस्थिरता के कारण, oxaloacetate समय के साथ अपने आप में क्षय (ऑटो-decarboxylation) cofactor एकाग्रता और पीएच के एक समारोह के रूप में. 7 के एक पीएच और 25 डिग्री सेल्सियस के तापमान के आसपास, इस प्रभाव नाटकीय नहीं है, लेकिन परख दोनों ऑटो decarboxylation और एंजाइम एकाग्रता के लिए खाते में रिक्त किया जाना चाहिए. पाइपिंग योजना को चित्र 4कमें रेखांकित किया गया है । सामान्य में, यह इस परख के लिए अच्छी तरह से calibrated pipettes का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है, क्योंकि यह मामूली pipeting त्रुटियों के लिए काफी संवेदनशील है.

Figure 4
चित्र 4 : एंजाइम परख के लिए स्केच पाइपिंग योजना।
(क) बुनियादी सब्सट्रेट आधारित एएचएड प्रोटीन एंजाइम परख के लिए एक स्केच पाइपटिंग योजना। खाली बस्तर: -S/ सबस्ट्रेट नमूना: +S/ एंजाइम रिक्त: -S/+E; एंजाइम नमूना: +S/+E (एस: सब्सट्रेट, ई: एंजाइम).। अधिक विवरण के लिए प्रोटोकॉल चरण 7 देखें. (बी) एएचडी प्रोटीन के माइकलिस-मेटेन गतिज का आकलन करने के लिए एक स्केच पाइपिंग योजना। खाली बस्तर: -S/ सबस्ट्रेट नमूना: +S/ एंजाइम रिक्त: -S/+E; एंजाइम नमूना: +S/+E (एस: सब्सट्रेट, ई: एंजाइम).। अधिक जानकारी के लिए प्रोटोकॉल के अनुभाग 8 देखें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. एक माइक्रोप्लेट रीडर शुरू करें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए बराबर। 12 कुओं को पढ़ने के लिए एक कार्यक्रम सेटअप करें (जैसा कि चित्र 4Aमें बताया गया है ) 255 एनएम पर। यह 5 एमएस समय देरी के साथ 25 एकाधिक readouts का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. 15x हर 2 मिनट (30 मिनट कुल) को मापने के लिए एक चक्र सेटअप करें।
  2. डिफ़ॉल्ट रूप से, एक एंजाइम परख बफर तैयार करें (सामग्री की सारणीदेखें) के साथ 1 mM MgCl2 pH 7.4 पर. संस्करण FAHD प्रोटीन विभिन्न cofactors या पीएच स्तर की आवश्यकता हो सकती है. ज2+ और दद2+ एफएहड13,11,12,21के लिए सहकारक माने जाते हैं .
  3. एंजाइम परख बफर (सामग्रीकीतालिका) के साथ एक 1 डिग्री ग्राम/जेडएल प्रोटीन समाधान बनाएं।
  4. परीक्षण किया जा करने के लिए एक सब्सट्रेट के 20 एमएल समाधान के 1 एमएल कीस्थापना (अब तक की पहचान की substrates FAHD प्रोटीन के कहीं और सूचीबद्ध हैं 3) एंजाइम परख बफर में.
  5. चित्र 4कमें प्रदर्शित पाइपिंग योजना के अनुसार, एंजाइम को रिक्त एवं नमूना कुएँ तैयार कीजिए: एंजाइम विलयन के 5 डिग्री (5 डिग्री) के साथ कुओं में पाइप90 र्ल् फ्एंजाइम परख बफर (सामग्री कीसारणी) की व्यवस्था करें।
  6. चित्र 4कमें प्रदर्शित पाइपिंग योजना के अनुसार, सब्सट्रेट रिक्त और नमूना कुओं को तैयार करें: पाइप 95 डिग्री सेल्सियस एंजाइम परख बफर के कुओं में।
  7. सही मापने से पहले, छह खाली कुओं में एंजाइम परख बफर के 5 डिग्री एल लागू होते हैं. नमूना कुओं के लिए 20 एम एम सब्सट्रेट समाधान के 5 डिग्री एल लागू करें। यह एक multichannel pipette का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
  8. धीरे सभी कुओं मिश्रण करने के लिए 50 डिग्री एल सेटिंग्स पर एक multichannel pipette का प्रयोग करें. रिक्त स्थान के साथ शुरू करो और नमूना कुओं के साथ आगे बढ़ना. किसी भी बुलबुले बनाने के लिए नहीं ध्यान रखना। एक microplate पाठक में थाली डालें और 255 एनएम पर प्रत्येक अच्छी तरह से उपाय (के रूप में चरण 7.1 में उल्लिखित).
  9. स्प्रेडशीट में विश्लेषण करें. एक स्प्रेडशीट में photometer से कच्चे डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ, और एक और पत्रक में सभी सेटिंग्स (यानी, सभी प्रलेखन) लिखें. चार तैयारियों में से प्रत्येक के तीन कुओं का औसत डेटा। नमूने से रिक्त घटाएँ। इसके अलावा मानक विचलन की गणना करें और रिक्त और नमूने के विचलनों का योग करें।
  10. प्लॉट इस डेटा (y: ऑप्टिकल घनत्व, एक्स: मिनट में समय). एक तेजी से कम वक्र प्रदर्शित किया जाना चाहिए. उपयोग में सब्सट्रेट के प्रकार पर निर्भर करता है, पहले 10 मिनट के भीतर एक प्रारंभिक वृद्धि देखा जा सकता है, जिसके बाद संकेत कम हो जाती है. यह सब्सट्रेट के केटो-इनोल तनातनी के लिए जिम्मेदार है, जैसा कि चर्चा अनुभाग में अधिक विस्तार से बताया गया है।
  11. ऑप्टिकल सिग्नल डेटा को प्लॉट के अधिकतम मान द्वारा समय के साथ विभाजित करें, ताकि डेटा को श्रेणी [0, 1] में स्केल किया जा सके (चित्र 5Aमें एक उदाहरण प्रदान किया गया है) । प्रारंभिक कमी से शुरू करते हुए वक्र की रेखीय श्रेणी की पहचान की और ऋणात्मक ढाल (1/मिनट) की गणना की।
  12. OD में कमी के समय पाठ्यक्रम अपनी प्रारंभिक एकाग्रता के माध्यम से सब्सट्रेट करने के लिए जुड़ा हुआ है: 100 nmol / मूल्यांकन प्रोटीन एकाग्रता c0 का उपयोग करना, विशिष्ट गतिविधि की गणना की जातीहै: 100 nmol/well * ढलान * 1/ ग0 को $g/अच्छी तरह से व्यक्त करते हुए, इस प्रकार परिकलित विशिष्ट गतिविधि को एकक nmol/min/g का उपयोग करके व्यक्त किया जाता है, जो $mol/min/mg के बराबर होती है।

8. एफ़एह प्रोटीन के माइकलिस-मेन्टन गतिज का आकलन

नोट: FAHD प्रोटीन के माइकलिस-Menten गतिज का आकलन थकाऊ है, के रूप में विशिष्ट प्रोटीन गतिविधि दोनों रिश्तेदार प्रोटीन-सब्सट्रेट एकाग्रता और शारीरिक मात्रा जिसमें प्रतिक्रिया हो रही है पर निर्भर है. विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए स्थिर राज्य गतिकी स्थापित किया जाना चाहिए। एक 96 अच्छी तरह से यूवी पारदर्शी प्लेट पर एक परीक्षण प्रोटोकॉल निम्नलिखित चरणों में उल्लिखित है. हर कदम के लिए बड़ी सावधानी से प्रदर्शन की जरूरत है, के रूप में मामूली त्रुटियों आमतौर पर प्रयोग खराब. यह नीचे वर्णित और अधिक जटिल परख का प्रयास करने से पहले धारा 7 में उल्लिखित परख मास्टर करने के लिए सिफारिश की है.

Figure 5
चित्र 5 : एंजाइम assays के अनुकरणीय परिणाम.
(ए) बुनियादी सब्सट्रेट आधारित FAHD प्रोटीन एंजाइम assays के लिए प्राप्त एक अनुकरणीय यूवी अवशोषण वक्र (मानक विचलन के साथ 0 से 1) की सीमा में सामान्यीकृत. ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) अनुपात [OD(t)/OD(0)] किसी भी समय t [OD(t)] प्रारंभिक OD के लिए सामान्यीकृत है [t ] 0; OD(0)$. अधिक जानकारी के लिए प्रोटोकॉल के अनुभाग 7 देखें. (बी) मानक विचलन के साथ मानव FAHD1 प्रोटीन की अनुकरणीय माइकलिस-मेन्टेन गतिज। अधिक जानकारी के लिए प्रोटोकॉल के अनुभाग 8 देखें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. एक माइक्रोप्लेट रीडर शुरू करें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए साम्य। 255 दउ पर 72 कुओं (जैसा कि चित्र 4खमें उल्लिखित ) पढ़ने के लिए एक कार्यक्रम सेट करें। यह एक 5 एमएस समय देरी के साथ 25 एकाधिक readouts का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. 15x प्रत्येक 2 मिनट (30 मिनट कुल) को मापने के लिए एक चक्र सेट करें।
  2. चरण 7.2 और 7.3 निष्पादित करें। फिर, एंजाइम परख बफर में 100 एमएल 100 एमएल सब्सट्रेट समाधान की स्थापना की।
  3. एंजाइम परख बफर में सब्सट्रेट समाधान के तनुकरण तैयार: 40 मीटर, 20 मीटर, 10 मीटर, 6 एमएम, 4 एमएम, 2 मीटर. परख pairwise के साथ किया जाता है ("समायोजित") एंजाइम / इसके लिए, एंजाइम परख बफर में एंजाइम समाधान के निम्नलिखित कमजोर पड़ने तैयार करें: 0.5 ग्राम/जेडएल, 0.4 ग्राम/जेडएल, 2.5 ग्राम/जेडएल, 2 डिग्री/जेडएल, 1.5 ग्राम/जेडएल, 1 ख्0ग्राम/
  4. चित्र 4ठ में दर्शाए गए सभी कूपों में 180 डिग्री सेल्सियस एंजाइम परख बफर लागू होता है। सब्सट्रेट (रिक्त और नमूना) के लिए सभी कुओं में एंजाइम परख बफर के 10 डिग्री सेल्सियस लागू करें। एंजाइम (रिक्त और नमूना) के लिए कुओं में तैयार प्रोटीन कमजोर पड़ने श्रृंखला के 10 डिग्री सेल्सियस लागू करें। सब्सट्रेट रिक्त और एंजाइम रिक्त के लिए कुओं के लिए सभी कुओं में एंजाइम परख बफर के 10 डिग्री सेल्सियस लागू करें.
  5. सही मापने से पहले, सब्सट्रेट नमूना और एंजाइम नमूना के लिए कुओं में तैयार सब्सट्रेट कमजोर पड़ने श्रृंखला के 10 डिग्री सेल्सियस लागू होते हैं।
  6. धीरे सभी कुओं मिश्रण करने के लिए 50 डिग्री एल सेटिंग्स पर एक multichannel pipette का प्रयोग करें, रिक्त स्थान के साथ शुरू, नमूना कुओं के लिए आगे बढ़ने. किसी भी बुलबुले बनाने के लिए नहीं ध्यान रखना।
  7. एक microplate पाठक में थाली डालें और 255 एनएम पर प्रत्येक अच्छी तरह से उपाय, के रूप में कदम 8.1 में उल्लिखित. स्प्रेडशीट में विश्लेषण करें. एक स्प्रेडशीट में photometer से कच्चे डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ, एक और पत्रक में सभी सेटिंग्स (यानी, सभी प्रलेखन) लिखें.
  8. चरण 7.11 में उल्लिखित के रूप में कमजोर पड़ने श्रृंखला में प्रति बिंदु व्यक्तिगत डेटा विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं। 7.14 करने के लिए। अंततः, सभी विशिष्ट गतिविधियों और प्रारंभिक सब्सट्रेट एकाग्रता के खिलाफ साजिश प्राप्त: 2 mM, 1 MM, 0.5 m, 0.3 m, 0.2 m, 0.1 m.
  9. अलग-अलग मानक विचलनों के साथ सभी डेटा बिंदु प्रदर्शित करें. गैर रेखीय वक्र फिटिंग के माध्यम से कंप्यूटर माइकलिस-Menten गतिज, या Lineweaver-बर्क विश्लेषण के माध्यम से. यह व्यक्तिगत अंक फिर से मापने के लिए आवश्यक हो सकता है, और कदम 8.5 और 8.6 में व्यक्तिगत प्रोटीन-संकेंद्रण / मानव FAHD1 के लिए माइकलिस-मेटेन आरेख चित्र 5Bमें प्रदान की गई है।

9. एएफडी प्रोटीन का क्रिस्टलीकरण

नोट: FAHD प्रोटीन का क्रिस्टलीकरण (मानव FAHD1 पहले वर्णित15) एक 24 अच्छी तरह से प्रारूप में फांसी ड्रॉप वाष्प प्रसार विधि द्वारा प्राप्त किया जा सकता है (चित्र 6A) . इस तकनीक का उपयोग करते हुए मानव FAHD1 के क्रिस्टलीकरण पर एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल15से नीचे प्रस्तुत किया गया है. चर्चा अनुभाग में अधिक विस्तृत विवरण प्रदान किया गया है.

Figure 6
चित्र 6 : FAHD प्रोटीन का क्रिस्टलीकरण.
(क) मानक 24 कूप या 96 अच्छी तरह से एसबीएस पदचिह्न में क्रिस्टलीकरण प्लेटें। अधिक जानकारी के लिए अनुभाग 9 देखें. (बी) एएचएडी प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण में मूल प्लेट सेटअप प्रक्रिया। यह आंकड़ा अनुमति23के साथ फिर से तैयार किया जाता है . अधिक जानकारी के लिए अनुभाग 9 देखें. (सी) मानव FAHD1 क्रिस्टल और इसी विवर्तन पैटर्न (छोटे आवेषण). क्रिस्टल ोंकाई के विवर्तन गुणवति के माप के रूप में आवेषण में निकटतम जालक अंतराल दर्शाया गया है। कम संख्या उच्च संकल्प और इस प्रकार अधिक जानकारीपूर्ण डेटा से संकेत मिलता है. अधिक विवरण के लिए प्रोटोकॉल के अनुभाग 9 देखें. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. सुनिश्चित करें कि प्रोटीन एसईसी चल बफर के खिलाफ dilyzed है. FAHD1 प्रोटीन उच्च सांद्रता पर उपलब्ध होना चाहिए (2-5 mg/mL). कम सांद्रता पर, प्रोटीन सहज नाभिक की कमी के कारण क्रिस्टलीकरण नहीं हो सकता है।
  2. क्रिस्टलीकरण के लिए जलाशय समाधान की 20 एमएल की तैयारी करें। तीन स्टॉक समाधान करें, एक विलायक के रूप में आसुत या deionized पानी का उपयोग कर: 1 एम ना-HEPES (न्यूनतम 25 एमएल, पीएच 7.5 करने के लिए समायोजित), 50% (w/v) polyethylene ग्लाइकोल 4000 (PEG4k) (न्यूनतम 65 एमएल), और 1 एम MgCl2 (10 एमएल).
  3. 4 x 6 (24 कुल) विभिन्न 15 एमएल ट्यूबों का एक ग्रिड सेटअप करें। उन्हें प्लेट पर संगत स्थितियों के अनुसार लेबल करें (उदा., पंक्ति (A, B, C, D) बनाम स्तंभ (1-6)जैसे "A1", "B5", "D6", आदि . . . पिपेट 1 एमएल प्रत्येक ट्यूब में 1 एम ना-HEPES.
  4. Pipette 1 एमएल 50% (w/v) PEG4k में पंक्ति ए ट्यूबों की, 2 एमएल पंक्ति बी में, पंक्ति सी में 3 एमएल, और पंक्ति D. Pipette में 4 एमएल 1 M MgCl2 के कॉलम 1 में ट्यूब के कॉलम 1 में, 250 $L कॉलम 2 में , स्तंभ 3 में 500 $L, स्तंभ 4 में 1.0 एमएल, कॉलम 5 में 1.5 एमएल और स्तंभ 6 में 2.0 एमएल.
  5. आसुत या deionized पानी, जहां ट्यूबों पर पैमाने पर पर्याप्त रूप से सही है के साथ एक 10 एमएल मात्रा तक सभी ट्यूबों को भरें।
  6. फ्रिज (या बर्फ से) से मानव FAHD1 प्रोटीन नमूना ($5 mg/mL) ले लो और कम से कम 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक मेज शीर्ष अपकेंद्रित्र के साथ अधिकतम गति से नीचे स्पिन। यदि ऑक्सालेट के साथ सह-क्रिस्टलीकरण वांछित है, तो एक स्टॉक समाधान से ऑक्सालेट जोड़ें ताकि प्रोटीन नमूने में 2 एम एम की अंतिम ऑक्सालेट सांद्रता हो। 1 एमएम डीटीटी लागू करें और बर्फ पर स्टोर करें।
  7. इस बीच, एक 24 अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेट खोल, आदर्श 18 डिग्री सेल्सियस पर एक तापमान नियंत्रित कमरे के अंदर. एक पतली गिलास या प्लास्टिक की छड़ी की मदद से 24 अच्छी तरह से थाली के हर अच्छी तरह से शीर्ष पर रिम पर तेल की एक पतली परत वितरित करें। क्रिस्टलीकरण प्लेट के प्रत्येक इसी अच्छी तरह से में तैयार क्रिस्टलीकरण कॉकटेल (A1 से D6) के 800 डिग्री एल जोड़ें।
  8. एक साफ सतह पर ताजा 22 मिमी coverslips रखें. गंदगी या धूल के साथ कवर पर्चियों को दूषित करने से बचें। यदि आवश्यक हो, तो संपीड़ित हवा या डस्टर स्प्रे का उपयोग करके कवर स्लिप से किसी भी मलबे को हटा दें।
  9. अपकेंद्रण पूरा होने के बाद, प्रोटीन का नमूना मिलाते हुए से बचें ताकि ट्यूब के नीचे काता-डाउन समुच्चय और मलबे फिर से तैरन न करें। निम्नलिखित चरणों में, समाधान की सतह के ठीक नीचे प्रोटीन नमूने से पिपेट ताकि नीचे से समुच्चय और जमा को हिलाने से बचें।
  10. प्रत्येक कुएं के लिए (चित्रा 6खदेखें ) पिपेट 1 $L प्रोटीन समाधान को आवरण स्लिप के केंद्र पर डालकर प्रोटीन की बूंद-बूंद के लिए संबंधित जलाशय कॉकटेल का 1 डिग्री सेल्सियस जोड़ना, बुलबुले से बचना। कवरस्लिप को उल्टा करें और इसे अच्छी तरह से शीर्ष पर रखें ताकि तेल कवरस्लिप एयर-टाइट के साथ अच्छी तरह से सील कर सके। दोहराएँ जब तक 24 अच्छी तरह से थाली पूरा हो गया है.
  11. प्लेट को 18 डिग्री सेल्सियस पर रखें और एक प्रगतिशील समय पर बूंदों को उचित सूक्ष्मदर्शी के साथ देखें। मानव FAHD1 क्रिस्टल आमतौर पर रात भर दिखाई देते हैं (चित्र 6Cदेखें )

Representative Results

एक तैयार क्लोनिंग वेक्टर के साथ शुरू और खरीदा BL21 (DE3) pLysS ई. कोलाई,प्लाज्मिड गर्मी के झटके या किसी भी उपयुक्त वैकल्पिक विधि के माध्यम से बैक्टीरिया में डाला जाता है (चित्र 1) . प्रवर्धन की एक छोटी अवधि के बाद, तब्दील बैक्टीरिया एलबी agar प्लेटों पर चढ़ाया जाता है, ताकि रात भर विकसित करने के लिए. इस बिंदु पर प्लेट्स अलग लग सकता है, संभावित त्रुटि स्रोतों की एक किस्म के आधार पर. प्लेट्स खाली हो सकता है (यानी, कोई कालोनियों), पूरी तरह से बैक्टीरिया से अधिक हो गई, या बीच में कुछ, क्रमशः. इष्टतम और गैर-अनुकूल रूपांतरण के बाद LB agar प्लेटों के दो उदाहरण चित्र 7कमें दर्शाए गए हैं। बहुत सारे जीवाणु कालोनियों या तो संकेत मिलता है कि बहुत सारे बैक्टीरिया चढ़ाया गया (शायद) या कि उपयोग में एंटीबायोटिक दवाओं की समय सीमा समाप्त हो सकता है (असंभव रूप से). बहुत कम जीवाणु कालोनियों का संकेत हो सकता है कि या तो पर्याप्त नहीं प्लाज्मिड परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया गया था (अधिक अगली बार उपयोग) या कि बहुत ज्यादा एंटीबायोटिक दवाओं बैक्टीरिया का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. किसी भी मामले में, अगर कालोनियों मौजूद हैं, वे ठीक होना चाहिए, के रूप में दो चयनात्मक एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग कर untransformed बैक्टीरिया के विकास के लिए एक जगह तुच्छ मौका का तात्पर्य है. सब पर कोई कालोनियों, तथापि, इंगित करता है कि या तो बैक्टीरिया उनके परिवर्तन क्षमता खो दिया है (क्योंकि लंबे समय से गलत भंडारण या भंडारण, दोहराव फ्रीज और thaw, आदि), गर्मी के झटके सफल नहीं था (कोई प्लाज्मिड तेज या जीवाणु बहुत अधिक गर्मी से मौत), क्लोनिंग वेक्टर भ्रष्ट है, या गलती से चयनात्मक एंटीबायोटिक दवाओं का एक गलत सेट इस्तेमाल किया गया था (प्लाज्मिड वेक्टर पर प्रतिरोध जीन की पुष्टि करें).

Figure 7
चित्र 7 : बैक्टीरिया परिवर्तन और IMAC के लिए प्रतिनिधि परिणाम.
(A) रूपांतरित BL21(DE3) ई. कोलाईके साथ प्रतिनिधि LB agar प्लेटें, निम्नलिखित प्रोटोकॉल चरण 1.1 द्वारा प्राप्त की. बाएं: अच्छी तरह से वितरित कालोनियों (सकारात्मक उदाहरण) के साथ एक थाली. सही: केवल एक एकल कॉलोनी (नकारात्मक उदाहरण) के साथ एक थाली. सफेद हलकों अच्छी कालोनियों के निशान. लाल वृत्त उन कालोनियों को चिह्नित करता है जो एक दूसरे के बहुत करीब बढ़ रहे हैं और जब तक अलग-थलग कालोनियां उपलब्ध हैं तब तक नहीं उठाया जाना चाहिए। (बी) प्रेरण नियंत्रण की एक श्रृंखला के एक 12.5% acrylamide एसडीएस-पेज विश्लेषण ("-" IPTG प्रेरण से पहले इंगित करता है; "+" गोली फसल से पहले, IPTG प्रेरण के बाद इंगित करता है, कुल प्रोटीन के बराबर मात्रा में समायोजित. यह चरण 1.2 में वर्णित है। (सी) उनकेटैग किए गए एफएएचडी 1 प्रोटीन के नी-एनटीए शोधन का एक अनुकरणीय 12.5% ऐक्रिलमाइड एसडीएस-पेज विश्लेषण। यह प्रोटोकॉल के अनुभाग 3 में वर्णित है। आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी उच्च शुद्धता के प्रोटीन पैदावार (gt; 70%, काले तीर), तथापि, कई छोटे संदूषण भी मनाया जाता है (लाल तीर). इन संदूषण गैर-एफएपीएचडी प्रोटीन से मिलकर बनता है जो कॉलम से बांधता है, और प्रोटीन से जो एफएपीएचडी प्रोटीन से बांधता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वैध कालोनियों का चयन किया और उठाया जाता है। पौष्टिक माध्यम में प्रवर्धन के बाद, प्रोटीन अभिव्यक्ति रासायनिक IPTG के आवेदन से शुरू होता है. मिलीग्राम मात्रा में व्यक्त प्रोटीन युक्त जीवाणु गोली काटा जाता है, और अभिव्यक्ति एसडीएस-पेज के माध्यम से सत्यापित की जाती है (उदाहरण के लिए चित्र 7खदेखें)। यह अन्यथा सरल प्रक्रिया के दौरान कुछ समस्याएँ हो सकती हैं। सबसे पहले, कुछ प्रोटीन शामिल शरीर फार्म, क्योंकि वे जाहिरा तौर पर किसी भी तरह मेजबान बैक्टीरिया के प्राकृतिक चयापचय के साथ हस्तक्षेप. यह मानव FAHD1 और FAHD2 के कुछ बिंदु उत्परिवर्तनों के लिए मनाया गया था. ऐसे मामलों में, कीट कोशिकाओं की तरह अन्य अभिव्यक्ति प्रणाली अधिक उपयुक्त हो सकता है और विचार किया जाना चाहिए. कीट कोशिकाओं से एक गोली कटाई के बाद, उदाहरण के लिए, प्रोटीन की शुद्धि इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक ही कदम इस प्रकार है. दूसरा, DE3-pET प्रणाली कभी कभी "लकी" (यानी, प्रोटीन पहले से ही कुछ हद तक IPTG प्रेरण से पहले व्यक्त किया है) पाया जाता है. इस के लिए संभावित कारण अच्छी तरह से समझ में नहीं है, लेकिन यह एक ठंडे कमरे इनक्यूबेटर में धीरे-धीरे रात भर प्रोटीन व्यक्त करने में मदद कर सकता है। तीसरा, कोई प्रोटीन व्यक्त किया जाता है. यह शायद सबसे खराब स्थिति है, क्योंकि यह संभावना एक भ्रष्ट प्लाज्मिड वेक्टर को इंगित करती है और इस प्रकार प्लाज्मिड अनुक्रम करने की सलाह दी जाती है।

यदि प्रोटीन को टैग करने के लिए उसकाटैग का उपयोग किया जाता है, तो नि-एनटीए एगारोस के साथ आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी एक आसान और सस्ते कब्जा करने की विधि है जो अधिकांश संदूषणों को नष्ट करती है (चित्र 7C) । इसी तरह की विधियाँ अन्य टैग सिस्टम (उदाहरण के लिए, STREP-II)के लिए मौजूद हैं। यदि कोई टैग का उपयोग नहीं किया गया था, अमोनियम सल्फेट वर्षा और लगातार हाइड्रोफोबिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी का एक संयोजन भी अन्य प्रोटीन के बहुमत से प्रोटीन को अलग कर सकते हैं (चित्र 8क)। तथापि, दो विधियों की तुलना करना (चित्र 7C बनाम चित्र 8क),नि-एनटीए विधियों की श्रेष्ठता एसडीएस-पेज विश्लेषण द्वारा प्रदर्शित की जा सकती है। इसलिए उनकेटैग किए गए प्रोटीन का उपयोग करने की सलाह दी जाती है।

Figure 8
चित्र 8 : FPLC प्रयोगों के लिए प्रतिनिधि परिणाम (एचआईसी, आयन विनिमय, एसईसी).
(क) अमोनियम सल्फेट (एएस) अनटैग्ड एफ़एडी1 प्रोटीन की वर्षा के बाद एचआईसी-फेनिल क्रोमैटोग्राफी का एक विशिष्ट क्रोमैटोग्राम और 12.5% ऐक्रिलमाइड एसडीएस-पेज विश्लेषण, जैसा कि प्रोटोकॉल के खंड 4 में वर्णित है। हरी रेखा AS नहीं है कि बफर बी की ग्रेडिएंट को दर्शाता है। प्रक्रिया के दौरान एएस धीरे-धीरे प्रणाली से बाहर धोया जाता है। चित्रा 7C करने के लिए इस पैनल की तुलना HIC-फेनिल विधि की तुलना में नी-NTA आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी की शक्ति को प्रदर्शित करता है, और प्रोटीन शोधन के लिए एक अपनेटैग प्रणाली का उपयोग करने का लाभ. (बी) एक अनुकरणीय क्रोमैटोग्राम और 12.5% ऐक्रिलमाइड एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए उनकीटैग ्ड की एफएएचडी की विश्लेषण Ni-NTA शुद्धिकरण के बाद। एक नमक ढाल का उपयोग करना, लागू नमूना अलग-अलग प्रोटीन में अलग है। (सी) एक अनुकरणीय क्रोमैटोग्राम और 12.5% ऐक्रिलमाइड एसडीएस-पेज विश्लेषण जी75 आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के अपने-टैग किए गए एफएएचडी के बाद काेशनिक एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

लगातार, प्रोटीन आगे cation/anion विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा बचे संदूषण से अलग है (उदाहरण के लिए, चित्र 8Bदेखें), आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी के बाद (उदाहरण के लिए, चित्र 8Cदेखें)। इस क्रम में एक प्रारंभिक शोधन रणनीति स्थापित करने की सलाह दी जाती है; हालांकि, इन स्तंभों के संयोजन में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, बाद में और भिन्नता में, जब तक प्रोटीन पर्याप्त रूप से शुद्ध है.

सरल गतिविधि assays, के लिए परीक्षण करने के लिए "हाँ या नहीं" सक्रिय substrates और / या cofactors पर निर्णय, Ni-NTA शुद्धि के बाद अपनेटैग प्रोटीन के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, या आयनिक विनिमय स्तंभ के बाद untagged प्रोटीन. विशिष्ट गतिविधियों और गतिज स्थिरांक उच्चतम शुद्धता के प्रोटीन के साथ निर्धारित किया जाना चाहिए. क्रिस्टलीकरण आयनिक विनिमय स्तंभ के बाद प्रोटीन के साथ प्रयास किया जा सकता है, लेकिन क्रिस्टल की गुणवत्ता लगभग हमेशा प्रोटीन शुद्धता के साथ संबंधित है. पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी शोधन प्रोटोकॉल के किसी भी चरण में प्रोटीन के खिलाफ उठाया जा सकता है; हालांकि, यहाँ गुणवत्ता भी प्रोटीन शुद्धता के साथ संबंधित है.

Discussion

महत्वपूर्ण कदम

FAHD प्रोटीन नमक सांद्रता के लिए बहुत संवेदनशील हैं. कम NaCl सांद्रता में, प्रोटीन thawing पर वेग हो सकता है, लेकिन वे आम तौर पर पूरी तरह से उच्च नमक सांद्रता पर पुनर्गठन किया जा सकता है. कि है, अगर एक FAHD प्रोटीन किसी कारण के लिए वेग, यह बरामद किया जा सकता है या उच्च नमक सांद्रता के साथ refolded (gt; 300 $M). कुछ और हाइड्रोफोबिक प्रोटीन, तथापि, बरामद नहीं किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, मानव FAHD2), लेकिन ऐसे CHAPS के रूप में डिटर्जेंट (अधिकतम 1%) या ग्लिसरोल (10%) उन्हें स्थिर समाधान में रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. किसी भी मामले में, -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और भंडारण का उपयोग कर सदमे मुक्त करने की सिफारिश की है, क्योंकि यह thawing की एक कोमल और धीमी प्रक्रिया है.

चरण 3.1.10 में Ni-NTA शुद्धिकरण के दौरान कुछ अनपेक्षित समस्याएँ हो सकती हैं। नोट की, पहले नमूने की तुलना में दूसरे एकत्र नमूने में एक उच्च OD agarose राल की एक बहुत अधिक मात्रा इंगित करता है (एक नोट ले लो और अगले प्रयोग में कम राल का उपयोग करें). इसके अलावा, agarose राल ही 280 एनएम पर एक ओडी संकेत की ओर जाता है (यानी, agarose राल बिस्तर के विघटन कृत्रिम संकेत दे देंगे). संदेह के मामले में, यह प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक ब्रैडफोर्ड या बीएसए परख की तरह अन्य तरीकों का उपयोग करने की सलाह दी है।

एंजाइमी परख में तीन महत्वपूर्ण पहलुओं पर विचार किया जाना है। सबसे पहले, प्रोटीन एकाग्रता का आकलन सही विशिष्ट गतिविधियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रोटीन की शुद्धता का स्तर परिणाम को प्रभावित कर रहा है और इसका अनुमान लगाने की आवश्यकता है। टैग किए गए प्रोटीन के मामले में, टैग भाग के द्रव्यमान की गणना की जानी चाहिए, और विशिष्ट गतिविधि को इसी प्रकार से ठीक किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल के अनुभाग 7 में वर्णित सरल परख के लिए, Ni-NTA शुद्धता सक्रिय और निष्क्रिय substrates, cofactors, आदि के बीच अंतर करने के लिए पर्याप्त है अधिक जटिल माइकलिस-मेन्टेन गतिज के मामले में, सभी reactant और सब्सट्रेट सांद्रता सही ढंग से निर्धारित किया जाना चाहिए. विशेष रूप से जब oxaloacetate का उपयोग कर (जो समय के साथ ऑटो decarboxylates) प्रतिक्रिया के एंजाइमी हिस्सा ऑटो decarboxylation के लिए सही किया जाना चाहिए (इस धारणा के तहत कि दोनों प्रतिक्रियाओं को एक साथ होते हैं). सब्सट्रेट के केटो-इनोल तनातनी को संबोधित ऑप्टिकल घनत्व संकेत में प्रारंभिक परिवर्तन पर विचार किया जाना चाहिए। तीसरा, सांद्रता और मात्रा समायोजित किया जाना चाहिए. एंजाइम और सब्सट्रेट की परिभाषित सांद्रता के साथ एक प्रतिक्रिया परख मात्रा पर निर्भर विभिन्न परिणाम दे सकते हैं. यदि प्रति अच्छी तरह से बहुत अधिक एंजाइम है, तो तरल का आसंजन वास्तव में परिणाम को पूर्वाग्रह कर सकता है।

माइकलिस-मेन्टेन गतिज का आकलन करने के लिए इष्टतम संयोजन खोजने के लिए 100 डिग्री सेल्सियस, 200 डिग्री सेल्सियस, और 300 डिग्री एल बैचों में प्रारंभिक प्रयोगों को करने की सिफारिश की जाती है। इसी तरह के पहलुओं गतिज परख के लिए एंजाइम-सब्सट्रेट सांद्रता के अनुपात के लिए लागू होते हैं। सब्सट्रेट या बहुत ज्यादा सब्सट्रेट प्रति बहुत अधिक एंजाइम रैखिक स्थिर राज्य माइकलिस रेंज के बाहर प्रणाली डाल दिया. प्रारंभिक प्रयोगों के लिए इन शर्तों का अनुकूलन आवश्यक हैं. मानव FAHD1 (जंगली प्रकार) प्रोटीन के लिए अनुकरणीय समायोजन धारा 8 में प्रदान की जाती हैं, जिसके परिणामस्वरूप गतिज आरेख (उदाहरण के लिए चित्र 5Bमें प्रस्तुत किया गया है)।

क्रिस्टलीकरण के लिए प्रोटीन समाधान की एक छोटी बूंद एक coverslip के केंद्र में pipeted और क्रिस्टलीकरण कॉकटेल की एक बूंद है, जो आम तौर पर एक बफर से बना है के साथ मिश्रित है (उदाहरण के लिए, Tris-HCl, HEPES) और एक precipitant (उदाहरण के लिए, polyethylene ग्लाइकोल, अमोनियम सल्फेट)। सह क्रिस्टलीकरण के लिए अवरोध करनेवाला समाधान की एक बूंद (जैसे इस प्रोटोकॉल में oxalate के रूप में) वैकल्पिक रूप से लागू किया जा सकता है. इसके बाद कवरस्लिप को क्रिस्टलीकरण कॉकटेल युक्त जलाशय के कुएं के ऊपर उल्टा रखा जाता है, सीलेंट तेल की सहायता से अच्छी तरह से हवा को टाइट कर दिया जाता है (चित्र 6 ख) । आदर्श रूप में, कोई वर्षा प्रयोग की शुरुआत में ड्रॉप के भीतर होता है जिसका अर्थ है प्रोटीन समाधान में रहता है. चूंकि जलाशय में तेजी से एकाग्रता बूंद की तुलना में अधिक है, ड्रॉप जलाशय के साथ संतुलन तक पहुंच गया है जब तक कि अच्छी तरह से वातावरण में वाष्पीकरण से पानी खोने के लिए शुरू होता है। जलाशय में पानी के प्रसार से बूंद की धीमी मात्रा में कमी आती है जो बदले में ड्रॉप में प्रोटीन और पूर्वाभासी एकाग्रता दोनों की वृद्धि का कारण बनती है। यदि प्रोटीन समाधान सुपर संतृप्ति की आवश्यक स्थिति तक पहुँच जाता है और इस प्रकार मेटा-स्थिरता, क्रिस्टल विकास के बाद सहज नाभिक हो सकता है. अतिसंतृप्त अवस्था तक पहुंचना क्रिस्टलीकरण के लिए एक आवश्यक लेकिन पर्याप्त शर्त नहीं है। प्रोटीनों के क्रिस्टलीकरण के लिए अनुकूल ऊष्मागतिक और गतिज दोनों स्थितियों की आवश्यकता होती है और यह प्रोटीन के अप्रत्याशित गुणों पर निर्भर करता है जिसे क्रिस्टलीकृतकियाजा सकता है।

संशोधन और समस्या निवारण

ई. कोलाई में प्रोटीन की अभिव्यक्ति अक्षम हो सकती है। विभिन्न IPTG सांद्रता, अभिव्यक्ति तापमान, और प्रवर्धन समय, इस तरह के कई घंटे के लिए कमरे के तापमान के रूप में या रात भर ठंडे कमरे में, प्रत्येक नए प्रोटीन के लिए इष्टतम स्थितियों को खोजने के लिए परीक्षण किया जा करने की आवश्यकता हो सकती है. समावेशन निकायों में प्रोटीन की वर्षा कभी कभी अधिक हाइड्रोफोबिक एहद प्रोटीन के लिए मनाया जाता है। ऐसे मामलों में कीट कोशिकाओं जैसी अन्य मॉडल प्रणालियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की सिफारिश की जाती है क्योंकि समावेशन निकायों के26रूपमें होने की संभावना कम होती है।

के रूप में FAHD प्रोटीन नमक और cofactor सांद्रता के प्रति संवेदनशील हैं, साथ ही पीएच, विभिन्न homologues के लिए शुद्धि रणनीतियों, orthologues, और बिंदु उत्परिवर्तन वेरिएंट अलग-अलग सेटिंग्स में अलग हो सकता है. वर्णित शुद्धि विधियों जंगली प्रकार मानव और माउस FAHD1 प्रोटीन के लिए विकसित कर रहे हैं. NaCl और imidazole के रूप में रसायनों की सांद्रता, साथ ही पीएच, एक अलग isoelectric बिंदु (pI) के साथ व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा करने के लिए हो सकता है. इसके अलावा ध्यान दें, नहीं हर उसकीटैग प्रोटीन एक Ni-NTA राल के लिए अच्छी तरह से बाध्य कर सकते हैं. यदि Ni-NTA स्तंभ के लिए प्रोटीन बाध्यकारी अक्षम है, NaCl और imidazole के अनुकूलित सांद्रता, साथ ही साथ Ni-NTA चल बफर में पीएच शर्तों अलग परिणाम की गुणवत्ता में सुधार करने में मदद मिल सकती है. यदि नहीं, तो Ni-NTA कदम लंघन और आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी के कदम पर आगे बढ़ने भी एक सफल शुद्धि रणनीति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यदि कोई प्रोटीन नी-एनटीए कॉलम से बांधता है लेकिन कॉलम से हटाया नहीं जा सकता है, तो कुछ एमएम EDTA के अलावा Ni2+ जटिल को बाधित करने में मदद मिल सकती है।

क्रिस्टलीकरण की प्रक्रिया के संबंध में, यह समझने की जरूरत है कि एक नियमित आवधिक जाली में बड़े और जटिल प्रोटीन अणुओं के आत्म संगठन एक स्वाभाविक संभावना नहीं प्रक्रिया है कि गतिज मापदंडों को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल पर भारी निर्भर करता है. क्रिस्टलीकरण के लिए इस्तेमाल किया सेट अप में भी छोटे परिवर्तन नाटकीय रूप से परिणाम बदल सकते हैं और कोई क्रिस्टल के रूप में होगा. प्रोटीन शुद्धता आम तौर पर सर्वोपरि महत्व का है. अंगूठे के एक नियम के रूप में, एक भारी ओवरलोडेड एसडीएस-पेज जेल अन्य बैंड नहीं दिखाना चाहिए। साथ ही, अनुक्रम जिसमें चरण निष्पादित किए जाते हैं परिणाम को प्रभावित कर सकता है। एक उदाहरण के रूप में, reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, यह अक्सर एक ही pipeting अनुक्रम रखने के लिए आवश्यक है, तो पहले प्रोटीन जोड़ने के लिए, और अंत में क्रिस्टलीकरण छोटी बूंद (या इसके विपरीत) के लिए precipitant जोड़ें. जो भी विधि का इस्तेमाल किया, यह एक ही रखा जाना चाहिए जब पुन: पेश करने या पैमाने पर प्रयोगों की कोशिश कर रहा. यदि इस प्रोटोकॉल का पालन करने वाले कोई क्रिस्टल नहीं देखे जाते हैं, तो रासायनिक वेग वेग संरचना, पीएच, ड्रॉप साइज और प्रोटीन-टू-प्रीसिटेट अनुपात को छोटी वेतन वृद्धि में अलग-अलग किया जा सकता है। धैर्य और बूंदों के लगातार टिप्पणियों पुण्य के हैं.

FAHD1 के उत्प्रेरक तंत्र के लिए टिप्पणी

प्रस्तुत तरीकों विशेष रूप से उच्च गुणवत्ता के FAHD1 प्रोटीन प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया है. यह FAHD1 क्रिस्टल के विकास के साथ ही FAHD1 युक्त क्रिस्टल की इंजीनियरिंग एक अवरोध करनेवाला (oxalate, PDB:6FOG) के लिए जटिल सक्षम. एक्स-रे संरचनाओं एंजाइम के उत्प्रेरक गुहा के एक 3 डी वास्तुकला प्रदान करते हैं। इन परिणामों के अवशेषों का एक व्यापक विवरण स्थापित संभावित इस पेचीदा एंजाइम के उत्प्रेरक तंत्र के लिए महत्वपूर्ण है. FAHD1 पहले acylpyruvates (acetylpyruvate, fumarylpyruvate)11छोड़ने में सक्षम होने के लिए वर्णित किया गया था। बाद में, यह पाया गया कि FAHD1 oxaloacetate12के एक decarboxylase के रूप में भी चल रही है. यद्यपि उपस्थाएं ऐसिलपिरुवट और ऑक्सोएसेट विभिन्न रासायनिक moieties हैं, रासायनिक परिवर्तन एक आम एकल सी3-सी4 बांड के रणनीतिक दरार को साझा करते हैं, ऊर्जावान रूप से यदि सी3 -C4 आबंध कक्षक C 2-कार्बोनिल15के र्-कक्षकों में लंबकोणीय रहते हैं। इस तरह के एक अनुरूपता सी3-carbanion क्षणिक दरार प्रक्रिया के दौरान गठित की अनुनाद स्थिरीकरण की अनुमति देता है. FAHD1 substrates (oxaloacetate और acylpyruvates) लचीला अणु हैं और tautomeric में मौजूद हो सकता है (केटो-इनोल) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सी2-hydrated रूपों (चित्र 9A) . विभिन्न प्रजातियों के बीच संतुलन मुख्य रूप से प्रयुक्त बफर संरचना, पीएच और धातु आयनों की उपस्थिति की प्रकृति द्वारा निर्धारित किया जाता है। निम्नलिखित में हम X-रे क्रिस्टल संरचनाओं जो FAHD1 के उत्प्रेरक केंद्र का खुलासा के विश्लेषण से प्रेरित hypothetic मशीनी परिदृश्यों पर चर्चा.

Figure 9
चित्र 9 : मानव FAHD1 के प्रस्तावित उत्प्रेरक तंत्र पर विवरण.
(क) ऑक्सोलोऐसीटेट क्रिस्टलीय अवस्था के साथ-साथ तटस्थ विलयन में मुख्य रूप से जेड-इनॉल रूप24में मौजूद है। हालांकि, शारीरिक पीएच-शर्तों के तहत 2-केटो फार्म प्रमुख प्रतिनिधित्व25है। (बी) एचएफएएचएडी1 गुहा15 का रासायनिक स्केच, जिसमें एमजी-बाउंड ऑक्सोऐसीटेट (बाएं) और ऐसिलपिरुवट (दाएं, आर1 के साथ कार्बनिक आराम के रूप में; लाल तीर आसन्न स्थिर जल अणु के नाभिक हमले को दर्शाता है) (चर्चा देखें)। (ग) सी3-सी के लिए अनुकूल अनुरूपताओं की तुलना (बी से ग) और हाइड्रोलेस (ख से ग) एफएएचडी1 की क्रियाविधि: दोनों प्रक्रियाओं के परिणामस्वरूप एमजी-कॉम्प्लेक्सेड पाइरुटेट-इनोलेट (चर्चा देखें)। इंटरमीडिएट ख और ख' Q109 द्वारा स्थिर होने की उम्मीद कर रहे हैं, के रूप में पैनल बी में sketched (चर्चा देखें). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

FAHD1 की डेकार्बोक्लेस गतिविधि

ऑक्सालोऐसीटेट क्रिस्टलीय अवस्था के साथ-साथ तटस्थ विलयन में मुख्य रूप से जेड-इनॉल रूप24में मौजूद है . लेकिन यह दिखाया गया था कि शारीरिक पीएच-शर्तों के तहत (पीएच 7-4 पर बफर शर्तें) 2-केटो रूप ऑक्सालोऐसीटेट25 का प्रमुख प्रतिनिधित्व है (चित्र 9 ए) और यह कि enolization decarboxylation के लिए एक शर्त नहीं है27 . ध्यान दें, डह2+ आयनों का ऑक्सालोऐसीटेट प्रजातियों के अनुपात पर 7ण्4 या28से नीचे के पीएच पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। ऑक्सोएसेटेट केटो के स्थानांतरण (संमिश्रित एंजाइम में बाउंड ऑक्सालेट द्वारा निर्देशित (पीडीबी: 6फोग15))ने बाध्य ऑक्सोएलेट15के एक अनुरूप नियामक के रूप में अवशेष Q109 का पता लगाया। जैसा कि एक अन्य अनुच्छेद15में उल्लिखित है , Q109 के कार्बेमोइल समूह में हाइड्रोजन आबंधन एक ऑक्सोऐसीटेट-अनुरूपता को स्थिर करता है जिसके परिणामस्वरूप C2-C3 आबंध के चारों ओर घूर्णन होता है (चित्र 9B, बाएँ फलक)। इस घूर्णन के परिणामस्वरूप ब्3-ब्4 आबंध (अपाख्यान होने के लिए) ब् 2-ऑर्बिटलके सापेक्ष लंबकोणीय स्वभाव को अपनाता है (चित्र 9 ब्)। कार्बन डाइऑक्साइड जारी किया जा सकता है. इस प्रक्रिया का प्राथमिक उत्पाद पाइरुटेट का अनुनाद स्थिर Mg-enolate होगा। यह ऑक्सोऐसीटेट-एमजी परिसरों की जांच से ज्ञात होता है कि एनोलेट सबसे अधिक स्थिर संकुल28,29का रूप धारण करता है। एक Mg-pyruvate enolate-complex के लिए एक तुलनीय स्थिरता को मानते हुए FAHD1 के cofactor अवरुद्ध किया जा सकता है, लेकिन lysine अवशेषK123 एक संतुलन में pyruvate-enolate प्रोटोनेट कर सकते हैं कोकारक15के नुकसान को रोकने के लिए .

दी गई व्याख्या FAHD1 के उत्प्रेरक ODx समारोह में एक विशिष्ट मध्यवर्ती के रूप में pyruvate एनॉल पता चलता है. hypothesized मॉडल में इस कदम पर, प्रयोगात्मक डेटा क्यों बंद ढक्कन उत्पाद जारी करने के लिए खुला होना चाहिए के रूप में किसी भी आगे संकेत प्रदान नहीं करता है. यह deduced हो सकता है, तथापि, कि प्रस्तावित तंत्र उत्पाद द्वारा एक एंजाइम अवरोध की तरह लग रहा है: क्रिस्टल संरचना अवशेषH30 और E33 में प्रस्तुत द्वारा FAHD1 उत्प्रेरक केंद्र की ओर दिशात्मक अभिविन्यास में आयोजित एक संरक्षित पानी अणु का पता चलता है एक लघु हेलिक्स15, जो लिगन्ड बाइंडिंग और ढक्कन बंद करने पर प्रेरित है। यदि प्राथमिक ईनोल एनोलेट के साथ संतुलन में रहता है, तो अनुनाद स्थिर एनोलेट को जल अणु द्वारा पायरुवेट में शमन किया जा सकता है। परिणामस्वरूप हाइड्रेक्सिल चिह् नक को Mg-cofactor जिस पर ढक्कन खुल जाएगा से पायरूटेट विस्थापित करने में सक्षम होगा। अंत में, उत्प्रेरक केंद्र mitochondrial वातावरण में बहाल किया जाएगा. इस hypothetic परिदृश्य में, गुहा पानी अणु क्रमशः एक एसिड के रूप में काम करेंगे.

FAHD1 की हाइड्रोलेस गतिविधि

किसी एंजाइम की हाइड्रोलेस गतिविधि के लिए एक हाइड्रैक्सिल न्यूक्लिओफील के मध्यवर्ती गठन की आवश्यकता होती है। यह तंत्र आमतौर पर एसिड-बेस उत्प्रेरक गतिविधि के संयोजन में पाया जाता है। प्रतिक्रिया की संक्रमणकालीन स्थिति गुहा में महत्वपूर्ण एमिनो एसिड साइड चेन द्वारा conformational नियंत्रण के माध्यम से तैयार किया जाना है. decarboxylase समारोह की चर्चा करने के लिए सादृश्य में, एंजाइम बाध्य acylpyruvate में 2-keto रूप में 4-कार्बोनिल ऑक्सीजन के हाइड्रोजन-बांडिंग द्वारा conformational नियंत्रण के तहत रखा जाएगा Q109 (चित्र 9B, सही पैनल). ऑक्सालेट-बाउंड एएचडी1 (PDB:6FOG) की क्रिस्टल संरचना एक संरक्षित जल अणु का पता चलता है जो एक लघु हेलिक्स15में प्रस्तुत अवशेषों H30 और E33 द्वारा FAHD1 उत्प्रेरक केंद्र की दिशा में दिशात्मक अभिविन्यास में आयोजित किया जाता है। E33-H30 dyad दिशात्मक स्थिति वाले जल को विरूपित करने के लिए सक्षम है और परिणामस्वरूप हाइड्रेक्सिल Q10915द्वारा अनुरूप नियंत्रण के तहत प्रस्तुत acylpyruvate के 4-कार्बनिल पर हमला करने के लिए आदर्श स्वभाव में है।

नोट की बात है, एएफए18के लिए इसी प्रकार का तंत्र प्रस्तावित किया गया है। हाइड्रेक्सिल न्यूक्लिओफी द्वारा हमला एक ऑक्सीएनिऑन प्रजाति में परिणाम होने की संभावना है, जो कक्षीय नियंत्रित ब्3-ब्4 आबंध दरार पर स्थिर होता है ( चित्र9 ब्)। इस निलेण्ड में ब्3-ब्4 आबंध घूर्णन (चित्र9 ब्) चित्र 9ठ में दर्शाए गए संगठित हाइड्रैक्सिल द्वारा न्यूक्लिओफिलिक आक्रमण के बाद होता है (अर्थात्, यह आबंध विदलन के लिए ऐसिलपाइरुटेट तैयार करता है)। प्राथमिक उत्पाद एसिटिक एसिड और Mg-pyruvate enolate होगा. इस hypothetic परिदृश्य में, एसिटिक एसिड pyruvate करने के लिए एनोल बुझाने और बाद में उत्पाद के विस्थापन की सहायता कर सकता है. 7ण्5 के चH के ऊपर तथा च् आयनों की उपस्थिति में ऐसिलपाइरुवट केटो- तथा इनोल-रूपों के बीच संतुलन में विद्यमान होते हैं, जो बाद में थोड़ी वरीयता30होते हैं। सबसे शायद दोनों रूपों बाद में ढक्कन बंद करने के तहत FAHD1 के cofactor के लिए बाध्य करने में सक्षम हैं. एंजाइम द्वारा enolic acylpyruvate substrates के प्रसंस्करण एनॉल रूप की सपाट संरचना के कारण बाधित है. सी3-सी4 दरार अनुनाद स्थिरीकरण के बिना एक vinylic carbanion में परिणाम होगा.

इसलिए, हम ऐसिल कार्बोनिल पर हाइड्रैक्सिल न्यूक्लिओफील के आक्रमण के लिए तैयार करने के लिए उत्प्रेरक केटोनाइजेशन चरण का प्रस्ताव करते हैं। तथापि, केटोनाइजेशन की इस प्रक्रिया में एएचएडी1 अवशेषों द्वारा प्रोटॉन स्थानांतरणों पर नियंत्रण की आवश्यकता होगी, जो एएचएडी1 के लिए एक अंतर्निहित समेमरस गतिविधि का श्रेय देगा। यह बताया गया है कि मिलीग्राम-बाउंड इनॉल हाइड्रोजन की अम्लता से संयुक्त राष्ट्र संघ के रूप28की तुलना में दस-हजार गुना वृद्धि का पता चलता है। Mg bound enol-form का एक deprotonation संयुक्त राष्ट्र द्वारा संभव होगा K123. K123 के deprotonation D102 के carboxylate द्वारा सहायता प्रदान की जा सकती है. अवशेषD102-K47-K123 द्वारा गठित एक हाइड्रोजन आबंध नेटवर्क एएचडी115के उत्प्रेरक केंद्र में आवश्यक प्रोटॉन रिले के रूप में काम कर सकता है। एक ऐसे गठित मध्यवर्ती enolate तो एक E33-H30-H20 त्रय सब्सट्रेट15के ketonization के तहत द्वारा बुझाया जा सकता है. 2-केटो रूप Q109 के अनुरूप नियंत्रण के तहत आ जाएगा, और संयोग से गठित हाइड्रैक्सिल एसिल कार्बोनिल पर हमला करेगा। संक्षेप चर्चा गुहा बनाने अवशेषों की परस्पर क्रिया के माध्यम से एसिड और आधार के बीच स्विच करने के लिए एक पानी के अणु के बारे में FAHD1 के नियंत्रण का तात्पर्य है.

भविष्य अनुप्रयोगों या विधि की दिशा

यहाँ वर्णित विधियों के भविष्य के अनुप्रयोगों के कई हैं. एफएएफ सुपर फैमिली के प्रोकैरियोटिक सदस्यों की एक बहुतायत अभी भी कार्यात्मक विशेषता का इंतजार कर रही है। यहां तक कि ज्ञात FAH superfamily सदस्यों के उत्प्रेरक गतिविधियों पर उपलब्ध जानकारी दुर्लभ है और, ज्यादातर मामलों में, सैद्धांतिक मान्यताओं के बजाय प्रयोगात्मक डेटा के आधार पर. प्रोकैरियोटिक एफए सुपरफैमिली सदस्यों के लिए यहां वर्णित विधियों का अनुप्रयोग जीवाणु विज्ञान में विशिष्ट अनुसंधान हितों पर निर्भर करता है। दूसरी ओर, हाल ही में प्रदर्शन है कि यूकैरियोटिक FAH superfamily सदस्यों विभिन्न सेलुलर डिब्बों में आवश्यक भूमिका निभाते हैं (उदाहरण के लिए, cytosol बनाम mitochondria) बेहतर इन प्रोटीन की विशेषता की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया (जिसमें से तीन किया गया है अब तक की पहचान की), विशेष रूप से, क्योंकि वर्तमान डेटा सुझाव है कि कुछ uncharacterized प्रोटीन mitochondrial जीव विज्ञान के संदर्भ में विभिन्न कार्यों को पूरा कर सकते हैं, उम्र बढ़ने अनुसंधान, और कैंसर अनुसंधान. यह प्रस्ताव है कि इन यूकैरियोटिक एफए सुपरफैमिली सदस्यों की पूर्ण आणविक और शारीरिक विशेषता जैव चिकित्सा क्षेत्र में समकालीन अनुसंधान के प्रमुख क्षेत्रों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है। FAHD1 के तंत्र पर अधिक अनुसंधान (और संबंधित एंजाइमों) बेहतर FAHD1 की द्वि-कार्यक्षमता अंतर्निहित तंत्र को समझने की जरूरत है, जो अभी भी पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है. FAHD1 म्यूटेंट, NMR-जांच, और अवरोधकरनेर परिसरों पर संरचनात्मक अध्ययन के साथ अतिरिक्त अध्ययन सही मशीनी परिदृश्यों जिसके लिए FAHD1 सक्षम होने लगता है को हल करने में मदद कर सकते हैं. इसके अलावा, ईनोल के कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन Mg-cofactor करने के लिए बाध्य करने में सक्षम mimics अंततः FAHD1 के शक्तिशाली inhibitors के लिए नेतृत्व करेंगे.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने और कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा करने के लिए कुछ भी नहीं है. एच जी MoleculeCrafting.HuGs e.U. में CEOCSO है और कस्टम संश्लेषण के माध्यम से इस अध्ययन के लिए acylpyruvates प्रदान की है। पी जे डी की प्रयोगशाला में काम ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (FWF): परियोजना संख्या P 31582-B26 द्वारा समर्थित किया गया था. इस पांडुलिपि के लिए प्रकाशन शुल्क आंशिक रूप से परियोजना संख्या पी 31582-B26 के तहत ऑस्ट्रिया ईविज्ञान फंड (FWF) द्वारा कवर किया गया है. ए एन और बी आर परियोजना P28395-B26 के तहत ऑस्ट्रिया विज्ञान कोष (FWF) द्वारा समर्थित हैं.

Acknowledgments

लेखकों Annabella Pittl द्वारा विशेषज्ञ तकनीकी सहायता और Haymo Pircher द्वारा पायलट विधि विकास के लिए बहुत आभारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21(DE3) pLysS competent E. coli Promega L1195 High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site
pET E. coli T7 Expression Vectors MERCK - http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav
0.45 µm filter units MERCK SLHP033NS Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
0.22 µm filter units MERCK SLGP033RS Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
Eppendof tubes 1.5 mL VWR 525-1042 microcentrifugal tubes; autoclaved
15 mL Falcon VWR 734-0451 centrifugal tubes
50 mL Falcon VWR 734-0448 centrifugal tubes
PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro VWR 30622-758 VIS transparent cuvettes
UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro VWR 47727-024 UV/VIS transparent cuvettes
isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) ROTH 2316 chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system
imidazole ROTH X998 chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin
Glass Econo-Column Columns Bio-Rad - http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378 antibiotic for bacterial growth selection; resistance endióded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 µg/mL final concentration
kanamycin Sigma-Aldrich 60615 antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 µg/mL final concentration
ampicillin Sigma-Aldrich A1593 antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 µg/mL final concentration
Ultra-15, MWCO 10 kDa Sigma-Aldrich Z706345 centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®ion=AT
Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units Sigma-Aldrich Z677108 centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&region=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2
oxaloacetic acid Sigma-Aldrich O4126 TCA metabolite
sodium oxlalate Sigma-Aldrich 71800 a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes
Dialysis tubing cellulose membrane Sigma-Aldrich D9277 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable
Ni-NTA agarose Thermo-Fischer R90101 a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence
96-Well UV Microplate Thermo-Fischer 8404 UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo-Fischer 26616 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616
ÄKTA FPLC system GE Healthcare Life Sciences - using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
HiTrap Phenyl HP column GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630
Mono S 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723
Mono Q 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608
HiLoad Superdex column 75 pg (G75) GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800
HiLoad Superdex column 200 pg (G200) GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283
TECAN microplate reader TECAN Life Sciences - https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers
acetylpyruvate MoleculeCrafting.HuGs e.U. - custom synthesis
benzoylpyruvate MoleculeCrafting.HuGs e.U. - custom synthesis
VDX™ plate (24 wells) Hampton HR3-142 24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
paraffin oil Hampton HR3-411 used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
coverslips (22 mm) Karl Hecht KG 14043 coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
Luria broth (LB) medium self-prepared - a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar
NZCYM medium self-prepared - a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4
Luria broth (LB) agarose plates self-prepared - autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/
Ni-NTA running buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Ni-NTA elution buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
HIC running buffer self-prepared - 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7
HIC running buffer AS self-prepared - HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0
Mono S low salt buffer self-prepared - 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono S high salt buffer self-prepared - 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono Q low salt buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0
Mono Q high salt buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0
G75 / G200 running buffer self-prepared - 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4
enzyme assay buffer self-prepared - 50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2
protein crystallization buffer self-prepared - G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT
reservoir solution for crystallization self-prepared - 100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2

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References

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जैव रसायन अंक 148 FAH FAHD FAHD1 ODx APH hydrolase decarboxylase oxaloacetate एसीटिल्पिरुटेट fumarylpyruvate acylpyruvate oxalate pyruvate MiDAS
अभिव्यक्ति, शुद्धि, क्रिस्टलीकरण, और फ्जाइम परख के Fumarylacetoaceate hydrolase डोमेन युक्त प्रोटीन
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Weiss, A. K. H., Holzknecht, M.,… More

Weiss, A. K. H., Holzknecht, M., Cappuccio, E., Dorigatti, I., Kreidl, K., Naschberger, A., Rupp, B., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins. J. Vis. Exp. (148), e59729, doi:10.3791/59729 (2019).

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