Summary
Aqui apresentamos um sistema de cultura monocamada mista ex-vivo para o estudo da migração de células glioma humanas (hGC) em tempo real. Este modelo fornece a capacidade de observar interações entre hGCs e axônios mielinated e não-myelinated dentro de uma câmara compartimentada.
Abstract
Glioblastoma é um dos cânceres humanos mais agressivos devido à extensa heterogeneidade celular e as propriedades migratórias dos hGCs. A fim de entender melhor os mecanismos moleculares subjacentes à migração de células glioma, a capacidade de estudar a interação entre hGCs e axônios dentro do microambiente tumoral é essencial. A fim modelar esta interação celular, nós desenvolvemos um sistema misturado da cultura que consiste em hGCs e em gânglios dorsais da raiz (DRG) co-culturas do axon-oligodendrocyte. As culturas drg foram selecionadas porque podem ser isoladas de forma eficiente e podem formar as projeções longas e extensas que são ideais para estudos migratórios dessa natureza. Oligodendrócitos de rato purificados foram então adicionados em axônios drg de rato purificados e induzidos a mielinate. Depois de confirmar a formação de mielina compacta, hGCs foram finalmente adicionados à co-cultura e suas interações com axônios DRG e oligodendrócitos foi monitorado em tempo real usando microscopia time-lapse. Nessas condições, os hGCs formam estruturas agregadas semelhantes a tumores que expressam GFAP e Ki67, migram ao longo de faixas axonais mielinadas e não mielinadas e interagem com esses axônios através da formação de pseudopodia. Nosso sistema de cocultura ex vivo pode ser usado para identificar novos mecanismos celulares e moleculares da migração de hGC e poderia potencialmente ser usado para testes de eficácia in vitro de medicamentos.
Introduction
Glioblastoma é um dos tumores mais agressivos e letais do cérebro humano. O padrão atual de atendimento inclui ressecção cirúrgica do tumor seguida de radiação1 mais administração concomitante e adjuvante de temozolomida2. Mesmo com esta abordagem multi-terapêutica, a recorrência tumoral é inevitável3. Isto é em parte devido à natureza migratória extensiva das pilhas do tumor, que invadem o parenchyma do cérebro que cria projeções finger-like múltiplas dentro do cérebro4 que fazem a ressecção completa improvável.
Nos últimos anos, tornou-se evidente que a agressividade do glioblastoma se deve, em parte, à presença de uma população de células-tronco cancerosas dentro da massa tumoral5,6, que apresentam alto potencial migratório7,8, resistência à quimioterapia e radiação9,10 e a capacidade de formar tumores secundários11. GSCs são capazes de recapitular tumores policlonais originais quando xenoenxertou a ratos nus5.
Apesar da riqueza de conhecimentos sobre o contexto genético dos glioblastomas, os estudos sobre a migração de células glioma (GC) são atualmente prejudicados pela falta de modelos eficientes de migração in vitro ou in vivo. Notavelmente, enquanto as interações glioma célula-axonal moduladas por fatores celulares e ambientais são um componente central da invasão de glioma, ao nosso conhecimento não há atualmente nenhum sistema experimental com a capacidade de modelar essas interações12,13,14. Para resolver essa deficiência, desenvolvemos um sistema de cultura ex vivo de hGCs primários co-cultivados com axon-oligodendrócitos drg purificados que resultam em expressão elevada de marcadores tumorais diferenciados, bem como extensa migração e interação de hGCs com fibras mielinadas e não-mielinadas. Esta plataforma ex vivo, devido ao seu layout compartimentado, é adequada para testar os efeitos de novas terapêuticas sobre os padrões de migração do hGC.,
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Protocol
Os protocolos de coleta, isolamento e propagação de células de glioma humanas derivadas do paciente foram aprovados pelo comitê do IRB do Rhode Island Hospital. Todos os animais foram mantidos de acordo com o Guia nih para o cuidado e uso de animais de laboratório. Todos os protocolos de uso animal foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee do Rhode Island Hospital.
1. Media e preparações tampão
- Prepare 50 mL of Neurosphere Media: 1x Neuronal basal medium w/o vitamin A, 1x serum free supplement w/o vitamin A, 2 mM L-glutamine, 20 ng/mL epidermal growth factor (EGF), 20 ng/mL basic-fibroblast growth factor (FGF), 2 μg/mL heparin, and 1x antibiotic-antimycotic (anti-anti).
- Prepare 50 mL de basal neuronal complementado Médio: 1x Neuronal basal médio, 1x soro livre suplemento, 4 g/L D-glicose, 2 mM L-glutamina, e 50 ng/mL fator de crescimento do nervo (NGF).
- Prepare 500 mL de N2B2 Médio: 1:1 Dulbecco's Modified Eagle Medium-Ham's F12 Nutrient Mixture (DMEM-F12), 1x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G), 66 mg/mL bovino soro albumin (BSA), 0,1 mg/mL transferrina, 0,01 mg/mL biotina, 6,29 mg/mL progesterona, 5 μg/mL N-Acetil-L-cystine (NAC) e 1 mM putriscine. Aliquot e congelar a -20 °C.
- Prepare 500 mL de C-Medium: 1x Mínimo Essencial Médio (MEM), D-glicose (final 4 g/L), 10% de soro bovino fetal (FBS) e 2 mM L-glutamina. Aliquot e congelar a -20 °C. Adicionar fator de crescimento nervoso (NGF) fresco antes do uso (50 ng/mL).
- Prepare 200 mL de Papain Buffer: 1x Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), 100 mM Mg 2 SO4,30% Glicose, 0,25 M EGTA e 1 M NaHCO3.
- Prepare 10 mL de DMEM-ITS-G Medium: 1x DMEM, 0,5% BSA e 1x ITS-G.
- Prepare 200 mL de PB Buffer: 1x Dulbecco's fosfato-buffered saline (DPBS) sem Ca2 + e Mg2 + e 0,5% BSA. Degas o tampão antes de usar e manter o gelo.
2. Isolamento e cultura das Neuroesferas de Células-Tronco de Glioma
-
Isolamento das Neuroesferas
- Coletar IRB aprovado e paciente consentiu o tecido humano fresco do glioblastoma (GBM) do quarto de funcionamento. Transfira amostras de GBM no gelo em DPBS contendo 2x anti-anti para um armário de segurança biológica certificado bl2.
- Transfira uma amostra de 1 cm3 GBM com necrose mínima ou contaminação de glóbulos vermelhos para uma placa de 60 mm e corte em fragmentos de 1 mm3; remover qualquer excesso de DPBS.
- Digerie o tecido com 5 mL de colagenase/dispase (1 mg/mL) por 30 min a 37 °C e redemoinho suavemente o prato a cada 5-10 min.
- Transfira fragmentos digeridos para um tubo de 50 mL e triturar por pipetting com uma pipeta de 10 mL várias vezes para dissociar o tecido.
- Adicionar um volume igual de Neurosphere Media e triturar o tecido novamente; permitindo que os grandes fragmentos se instalem.
- Remova os meios sem fragmentos de tecido e passe lentamente através de um filtro de célula de 70 μM colocado sobre um tubo fresco de 50 mL.
- Repita os passos 2.1.5-2.1.6 até que todo o tecido tenha sido dissociado, alterando o filtro celular conforme necessário.
- Gire a suspensão celular a 110 x g por 10 min.
- Retire o supernatant e resuspender a pelota em 10 mL de ACK lofinização tampão para remover a contaminação das células vermelhas do sangue. Incubar por 10 min à temperatura ambiente.
- Gire a suspensão celular a 110 x g por 5 min.
- Retire as células supernatant e resuspender em 10 mL da Neurosphere Media. Tome 10 μL da suspensão celular e diluir com 10 μL de trypan azul. Conte 10 μL da suspensão celular usando um contador de células automatizado ou hemocytometer e placa em 10 mL da Neurosphere Media em uma densidade de 3 x 106 células em placas de cultura de suspensão de 100 mm.
- Adicione 2 mL de neurosphere media fresco à cultura 2-3 vezes por semana.
NOTA: Neurospheres se formarão em suspensão dentro de 3-4 semanas. Após a subculização por 2-4 vezes, confirme a haste através do ensaio limitante da diluição e da recapitulação do tumor através da transplantação xenográfica em ratos imunocomprometidos como descrito previamente 22.
-
Neuroesferas sub-culturing
- Quando as esferas se formam e atingem um diâmetro entre 200-500 μm, transfira neuroesferas para um tubo de 15 mL e gire a 110 x g por 5 min.
- Resuspenda as neuroesferas em 1 mL de solução de desprendimento celular pré-aquecido.
- Transfira para um tubo de 1,5 mL e incubar a 37 °C por 5 min.
- Definir uma pipeta P200 para 150 μL e triturar por pipetting cima e para baixo para dissociar neuroesferas.
- Transfira células dissociadas para um tubo de 15 mL. Adicione 4 mL de Neurosphere Media e gire a 300 x g por 5 min.
- Retire as células supernatant e resuspender em 5 mL da Neurosphere Media. Tome 10 μL da suspensão celular e diluir com 10 μL de trypan azul. Conte 10 μL da suspensão celular usando um contador de células automatizado ou hemocytometer e placa em uma densidade de 1 x 106 células/60 mm prato em um volume final de 4 mL.
- Atualizar a mídia 2 vezes por semana e as células de subcultura, conforme necessário. Congele as neuroesferas inteiras quando desejada na mídia basal neuronal w/o vitamina A complementada com 10% DMSO. As neuroesferas podem ser usadas para experimentos após o P4.
3. Cultura compartimentada de Rat Dorsal Root Ganglia (DRGs), Oligodendrócitos (OPCs) e hGCs
- Preparação de pratos de cultura compartimentados
NOTA: Executar os seguintes passos nos dias antes da colheita planejada dos DRGs.- Monte pratos de cultura compartimentados.
- Solução de ações de colágeno diluída a 500 μg/mL em H2O destilado estéril; Homogeneizar.
- Com uma pipeta de transferência estéril, preencha um prato de cultura de 35 mm com 2 mL de solução de colágeno; remover a solução, deixando uma fina película de colágeno para trás e colocá-lo no prato próximo 35 mm. Repita este processo, adicionando mais solução de colágeno, conforme necessário, até que todos os pratos tenham sido revestidos.
- Uma vez que todas as placas são revestidas, coloque as placas em uma bandeja de cultura de 245 mm x 245 mm e coloque três almofadas de gaze de 1 mm x 1 mm no centro da bandeja.
- Para polimerizar o colágeno, almofadas de gaze molhadas com 1 mL de hidróxido de amônio concentrado e cubra as bandejas por 15 min.
- Retire as almofadas de gaze e permita que os pratos de 35 mm sequem na capa de fluxo laminar.
- Enquanto os pratos estão secando, carregue o barril do aplicador de graxa de seringa com graxa de alto vácuo. Coloque as câmaras compartimentadas em uma garrafa de mídia grande boca cheia de água destilada. Esterilizar tanto por autoclismo e deixe esfriar.
- Arquivo fora do ponto de um 18-G necessários para fazer uma ponta sem corte. Esterilizar em 70% de etanol. Anexar a agulha para a seringa de graxa.
- Esterilizar o ancinho de alfinete embebendo em 70% de etanol; permita que seque ao ar na capa de fluxo laminar.
- Retire a tampa de um prato seco, revestido de colágeno de 35 mm. Segure o prato entre o polegar e o dedo indicador. Segure o ancinho do alfinete com a outra mão. Aplique uma pressão firme para criar até 200 μM arranhões de largura em todo o centro do prato.
- Usando uma pipeta de pasto, coloque duas gotas de meio basal neuronal complementado no centro dos arranhões.
- Repita os passos 3.1.10-3.1.11 até que todos os pratos tenham sido riscados.
- Seque as câmaras compartimentadas em um capô de fluxo laminar.
- Com fórceps hemostásicos estéreis, segure uma câmara compartimentada pelo divisor central. Vire os fórceps hemostáticos para que o fundo da câmara esteja virado para cima.
- Aplique graxa de silicone na câmara compartimentada, começando no topo. Certifique-se de que a graxa é colocada ordenadamente e se sobrepõe em todos os cantos.
- Retire a tampa de um prato de 35 mm. Inverter o prato e colocar os arranhões sobre a câmara. Bata para baixo na parte inferior da placa delicadamente com um par de fórceps.
- Gentilmente virar a placa usando os fórceps hemostásicos. Solte as fórceps.
- Coloque um monte de graxa na base do compartimento central. Encha cada câmara com o basal basal neuronal suplementar (NB) e verifique se há vazamentos. Vazamentos de foca com graxa de silicone, conforme necessário.
- Continue montando todos os pratos culturais e guarde durante a noite a 37°, 5% CO2.
- Isolamento de neurônios rat drg e cultura na câmara compartimentada
- Sacrifique um rato E16 Sprague-Dawley grávida cronometrada por asfixia de CO2 ou por overdose química.
- Coloque o animal na posição supina em uma superfície limpa; desinfetar o abdómen com 70% de etanol.
- Segure a pele do abdômen inferior com fórceps e levante suavemente.
- Usando uma tesoura, faça uma incisão "eu" ao longo da linha média do animal, tomando cuidado para não perfurar os músculos da parede abdominal.
- Com um par limpo de fórceps, agarrar a parede muscular e fazer uma incisão transversal com um par limpo de tesoura usando cautela para não perfurar o útero ou intestinos.
- Com um par de fórceps contundentes, agarrar o útero e gentilmente levantar-se para fora da cavidade peritoneal.
- Usando tesoura fresca e estéril, corte o tecido conjuntivo na base de cada chifre uterino.
- Coloque todo o útero em um prato estéril de cultura de tecido de 100 mm.
- Leve o útero para um capô de fluxo laminar para dissecação.
- Retire os embriões do útero, um de cada vez, cortando através do saco amniótico e suavemente provocando o embrião para fora e em um prato de 60 mm contendo 5 mL de L-15 com 1x pen-estreptococos.
- Com fórceps finos, coloque 3-4 embriões em um prato de 60 mm contendo 5 mL de L-15 com 1x pen-strep.
- Trabalhando um microscópio dissecando e com um embrião de cada vez, eutanasiado por decapitação.
- Deite o embrião do lado ventral para cima e retire os membros e a cauda.
- Com fórceps finos, faça uma incisão midline no animal.
- Remover órgãos internos e tecidos para expor as estruturas dorsais, particularmente a medula espinhal, que deve ser visível após a conclusão.
- Coloque uma lâmina de micro-dissecação tesoura entre a coluna vertebral e o canal espinhal e corte cuidadosamente a coluna vertebral para expor a medula espinhal. Tome cuidado para não cortar a medula espinhal.
- Com fórceps finos, agarre levemente a extremidade rostral da medula espinal e levante lentamente fora do embrião. Os DRGs serão anexados à medula espinhal.
- Transfira as medulas espinhais e os DRGs anexados a um prato de 35 mm contendo 2 ml de L-15 com 1x pen-strep. Coloque no gelo.
- Uma vez que todas as cordas espinal foram isoladas, use fórceps finos para arrancar individualmente DRGs da medula espinal. Coloque drgs em um prato fresco de 35 mm.
- Se as raízes nervosas estão presentes em DRGs, clip-los.
- Retire os pratos preparados de 35 mm da incubadora de 37 °C, 5% CO2. Retire a mídia do dia anterior. Coloque 80 μL de Supplemented Neuronal Basal Media (NBF) contendo 10 μM 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR) no compartimento central e 250 μL de mídia em cada compartimento externo.
- Coloque 2 gânglios em cada compartimento central. Retorne pratos para a incubadora de 37 °C, 5% CO2.
- No dia seguinte, adicione 2,5 mL de NBF.
- Alimente as culturas que seguem o cronograma na Tabela 1,alterando o cronograma com base no dia escolhido para iniciar a preparação da DRG.
- No dia 21 (ou quando os axônios chegam ao fim dos compartimentos distais), ou culturas de sementes com uma neurosfera GBM (Passo 3.2.26) e imagem viva ou myelinate as culturas com culturas oligodendrócitos (Proceda a passo 3.3) e, em seguida, sementes com uma neuroesfera GBM depois da mienação.
- Substitua o NB Medium complementado em cada câmara compartimentada distal que será semeada por uma neurosfera GBM por NB Médio Complementado contendo 10% FBS.
- Com uma pipeta P20 definida para 10 μL, retire uma neurosfera GBM do prato de cultura. A neurosfera GBM deve medir aproximadamente 200 mícrons de tamanho.
- Coloque a ponta da pipeta na câmara distal e expulsar a neuroesfera GBM lentamente para que ele cai suavemente sobre os axônios na parte da câmara distal que está mais próximo da câmara central, sobre os axônios perto da câmara central. Tenha cuidado para não deixar a ponta pipette perturbar os axônios.
- Deixe a cultura no armário de biossegurança por 1 h à temperatura ambiente para permitir que a neuroesfera GBM se anexe.
- Uma vez que a neurosfera tenha anexado, substituir com muito cuidado a mídia no compartimento distal com Suplementos NB Médio.
- Culturas de imagem ao vivo por 3-7 dias, adicionando mídia conforme necessário. Neste caso, um cerco controlado da pilha viva do CO2 unido ao microscópio (por exemplo, Zeiss Axiovert) foi usado para monitorar continuamente a migração da pilha por 7 dias usando o brightfield. As imagens foram adquiridas a cada 10 min usando o software associado. Repita o mesmo protocolo usando hGCs que foram etalitadamente transfected para expressar GFP e imagens foram capturadas usando uma combinação de brightfield e 488 nm laser.
NOTA: As neuroesferas podem ser transinduzidas com lentivírus ou transacionadas com plasmídeos ou siRNAs. Os compartimentos também podem ser tratados com inibidores desejados de pequenas moléculas para estudar a migração.
- Mielination de DrG Axons com Oligodendrocytes
- Um dia antes do isolamento oligodendrocyte, substituir o Nb Medium nos DRGs com C-Medium.
- Antes da dissecação, coloque 10 mL de Papain Buffer em um prato de 60 mm na incubadora para equilibrar.
- Em um capô de fluxo laminar, preencha um prato de 100 mm e um prato de 60 mm com HBSS gelado. Coloque no gelo.
- Sacrifique um filhote de rato P2 por decapitação. Retire a pele usando um par de tesouras. Depois que a pele é removida, corte o crânio ao longo da linha média com um par de tesouras finas.
- Retire delicadamente o crânio com baceps finos. Usando uma espátula, colher suavemente o cérebro do fundo do crânio e transferir para uma tampa de placa de cultura de tecido invertido.
- Retire o cerebelo e divida o cerebelo em dois hemisférios cerebrais. Retire as lâmpadas olfativas, hipocampo e gânglios basais abaixo do córtex cerebral de cada hemisfério. Coloque o córtex cerebral no prato de 100 mm contendo HBSS. Repita os passos 3.3.4-3.3.6 para os animais restantes.
- Trabalhando com um córtex de cada vez, retire as meninges com fórceps Dumont finos. Coloque todos os córticos sem meninges em pratos frescos de 60 mm com HBSS.
- Corte o tecido cortical em 1 mm3 pedaços. Coloque no gelo.
- Coloque o Papain Buffer equilibrado em um tubo de 15 mL. Adicione 200 unidades de papaína e 2 mg de cisteína L. Filtrar esterilizar e adicionar 200 μL de DNase estéril I.
- Retire hbss do tecido cerebral em cubos e substituir por papain buffer de 3.3.2. Coloque o prato em 37 °C, 5% de CO2 incubadora por 80 min, agitando suavemente a cada 15 min.
- Transfira o tecido digerido para um tubo de 50 mL e adicione 2 mL de C-médio.
- Triturar com uma pipeta sorológica de 5 mL para dissociar o tecido; permitir que pedaços maiores de tecido para resolver. Retire o supernatant e coloque em um tubo estéril de 15 mL.
- Adicione 2 mL de C-Médio e repita a trituração com uma pipeta sorológica de 5 mL mais uma vez. Mude para uma ponta de pipeta de 1 mL e triturar até que o tecido é completamente dissociado. Transfira para o tubo de 15 mL.
- Gire o tecido triturado em 300 x g por 15 min. Retire cuidadosamente a pelota supernatant e resuspende em 8 mL de DMEM-ITS-G Medium.
- Pré-molhado um filtro estéril de células 30 μM com 2 mL de PB Buffer. Coloque filtro de célula sobre um tubo de 50 mL e filtrar a suspensão celular 1 mL de cada vez. Lave o filtro com 5 mL de PB Buffer.
- Transfira a suspensão celular para uma placa bacteriológica de 100 mm; incubada por 15 min em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 para permitir que a microglia se anexe.
- Retire a mídia e coloque em um tubo de 15 mL. Lave a placa suavemente com 2 mL de dmem-its-g médio e transferir para o tubo de 15 mL.
- Resuspenda a suspensão celular suavemente. Tome 10 μL da suspensão celular e diluir com 10 μl de trypan azul. Conte 10 μl da suspensão celular usando um contador de células automatizado ou hemocytometer.
- Gire a suspensão celular a 300 x g por 10 min.
- Aspirate supernatant completamente e resuspender células em 70 μL de PB Buffer para cada 1 x 107 células. Misture bem e incubar a 4 °C por 10 min.
- Adicione 20 μl de microesferas anti-A2B5 para cada 1 x 107 células. Misture bem e incubar a 4 °C.
- Adicione 1-2 mL de PB Buffer para cada 1 x 107 células e centrífugas a 300 x g por 10 min em uma centrífuga de 4 °C.
- Aspirate supernatant completamente. Suspender até um total de 108 células em 500 μL de PB Buffer. Continue no gelo.
- Coloque uma coluna de contas magnéticas no campo magnético de um separador.
- Prepare a coluna enxaguando com 500 μL de PB Buffer. Aplique a suspensão celular na coluna. Descarte o fluxo através de um recipiente de resíduos (este contém células não rotuladas).
- Lave a coluna com 500 μL de PB Buffer 3 vezes. Descarte o fluxo.
- Retire a coluna do separador magnético e coloque em um tubo de coleta.
- Pipette 1 mL de PB Buffer na coluna. Lave as células magneticamente rotuladas empurrando firmemente o desentupidor para dentro da coluna.
- Adicione 4 mL de C-Médio à fração celular e gire a 300 x g por 10 min.
- Remover supernatant e resuspender em 5 mL de N2B2 Médio. Tome 10 μL da suspensão celular e diluir com 10 μL de trypan azul. Conte 10 μL da suspensão celular usando um contador de células automatizado ou hemocytometer.
- Placa oligodendrócitos em uma concentração de 150.000 células por câmara compartimentada contendo um DRG com axônios totalmente estendidos.
- No dia seguinte, mude a mídia na câmara compartimentada para N2B2 para permitir a mielização. Substitua a mídia a cada 2 a 3 dias. A mielinização estará completa em 14 dias.
- No dia 14, a cultura da semente com uma neurofera gbm como em 3.2.26-3.2.32. Mantenha culturas mielinadas no N2B2 Medium durante qualquer experimento.
NOTA: O protocolo é apresentado como um fluxograma esquemático na Figura 1.
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Representative Results
Para estudar a interação de hGCs com axônios, geramos axônios drg purificados como descrito anteriormente15,16,17,18. Esses axônios drg purificados foram então semeados com hGCs, que formaram estruturas semelhantes a tumores GFAP+/Ki67+ integradas dentro da rede axonal, enquanto hGCs individuais migraram em associação ou entre os axônios (Figura 2). Para determinar como os hGCs interagem com axônios myelinated, nós semeamos culturas do axônio de DRG com oligodendrócitos purificados do rato e mielination induzido como descrito previamente19,20,21. A adição de hGCs sobre o myelinated DRG-oligodendrocyte co-culturas mostrou que hGCs migrar em associação com os axônios mielinated e longe da massa tumoral através da formação de pseudopodia como mostrado em nosso artigo recente (Figura 3)22. A mielinização de Oligodendrocyte pode ser determinada usando a monelina Proteína Básica (MBP) de coloração das culturas. Para quantificar a migração de hGCs nessas culturas medimos a área total da cultura ocupada pelos hGCs migratórios usando o software Image J22.
| Segunda-feira | Quarta | Sexta | |
| DIA 1 | NBF NBF | ||
| SEMANA 1 | Nb | NBF NBF | Nb |
| SEMANA 2 | NBF NBF | Nb | Nb |
| SEMANA 3 | Nb | Nb |
Tabela 1: Programação de alimentação das culturas DRG.
Figura 1: Resumo esquemático do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: hGCs formam estruturas semelhantes a tumores na co-cultura com axônios DRG. A cultura foi fixada e manchada para os marcadores tumorais GFAP (vermelho) e Ki67 (verde), enquanto os axônios foram manchados com Neurofilament (azul). Barra de escala: 200 μm. Este número foi modificado a partir do nosso artigo recentemente publicado22. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: hGCs migram ao longo de faixas axonais mielinadas. hGCs expressando a proteína fluorescente verde (GFP) migram ao longo de faixas axonais mielinadas manchadas de vermelho para MBP no sistema de cultura hGC-DRG-oligodendrocyte. Barra de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Estudos de migração para hGCs podem ser realizados usando sistemas de câmara Boyden ou ensaios de arranhões. No entanto, enquanto esses experimentos não dão qualquer informação sobre as interações das células tumorais com outros tecidos circundantes, o sistema atual pode recapitular as interações GC com fibras mielinadas e não-mielinadas. Além disso, para estudar a formação de tumores e a migração de ponto final, culturas organotípicas do cérebro de roedores ou implantação in vivo de células de glioma no cérebro ou flanco de roedores já foram utilizadas23,24,25. Esforços mais recentes na modelagem tridimensional de células glioma têm utilizado sistemas como camadas de colágeno26,27,28, andaimes à base de astrocito29,30, camadas de matriz extracelular31, nanofibras eletrosmadas32,e hidrogéis33. Embora esses experimentos produzam resultados satisfatórios de ponto final em relação à migração, eles não têm a capacidade de serem estudados em tempo real por microscopia de alta resolução.
Aqui, demonstramos uma nova abordagem para estudar a migração de hGCs atolando uma co-cultura drg em uma câmara compartimentada. Se o acesso ao tecido GBM fresco estiver disponível, os hGCs podem ser isolados e cultivados de forma confiável. Embora os hGCs desempenam muito tempo para formar neuroesferas inicialmente, as culturas são fáceis de manter e a subcultura uma vez que as esferas se formam. Para garantir o sucesso da cultura do hGC, o tecido deve ser processado o mais rápido possível. O tempo entre a ressecção e o processamento deve ser minimizado tanto quanto possível, e as amostras devem sempre ser transportadas no gelo.
O DRG também é fácil de isolar, estende seus axônios por mais tempo do que os neurônios corticais e pode ser facilmente mielinado na cultura com oligodendrócitos. As neuroesferas do hGC ou os hGCs dissociados são co-cultivados nos compartimentos distais das câmaras, permitindo a imagem latente viva da pilha e o quantification em tempo real de interações celulares com axônios e fibras myelinated. Além disso, este protocolo não se limita apenas a culturas DRG, como neurônios corticais também podem ser isolados e mielinated com poucas modificações a este protocolo. Este modelo também pode ser usado para estudar outras formas de câncer cerebral.
Embora o DRG seja relativamente simples de isolar e manter, a adição da câmara compartimentada é demorada e cria uma infinidade de limitações técnicas que exigem treinamento e prática para ter sucesso. Crítico para o sucesso deste protocolo é o revestimento de colágeno uniforme e coçar os pratos de cultura, porque colágeno irregular ou excessivamente grosso tende a descascar. O cuidado extremo deve igualmente ser tomado ao coloc a graxa do silicone nas câmaras compartimentadas. Se mesmo a pressão não é usada ao dispensar a graxa do silicone, haverá umas aberturas ao longo da parte inferior da câmara compartimentada que exigirão selar com graxa adicional para impedir o escapamento dos meios. Além disso, a pressão mínima deve ser usada ao aderindo as câmaras compartimentadas para o piso do prato de cultura. Se os axônios não conseguem atravessar para fora do compartimento médio após a primeira semana e o DRG parece saudável, é provável que muita pressão foi aplicada ao colocar a câmara compartimentada ou uma quantidade excessiva de graxa foi usada.
HGC migração ao longo mielinated e não-myelinated axonal tratos no cérebro não tem sido bem descrito devido à falta de eficiente e reprodutível ex vivo modelos. Descrevemos aqui o desenvolvimento de um inovador sistema de cultura ex vivo para estudar como as células glioma migram ao longo de axônios e mielina, um componente crucial no desenvolvimento de novos tratamentos que visam especificamente a migração de células tumorais. Nosso sistema de cultura é versátil, uma vez que há isolamento fluídico entre os compartimentos, facilitando a capacidade de estudar vários novos tratamentos ou diferentes concentrações de substâncias que afetam a migração de células glioma. Uma vantagem adicional do nosso sistema de co-cultura é a capacidade de monitorar a migração de hGC e os efeitos dos vários tratamentos em tempo real. O protocolo descrito aqui está sendo usado atualmente como base para o desenvolvimento de sistemas biomiméticos de ex vivo tridimensionais mais sofisticados usando componentes celulares exclusivamente humanos que poderiam ser usados para avaliar a toxicologia e a eficácia de novos medicamentos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por fundos internos do Departamento de Neurocirurgia, Universidade Brown para N.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
| 60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
| Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
| AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
| Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
| Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| D-Glucose | Sigma | G5146 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
| DNase I | Sigma | D7291 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
| EBSS | Sigma | E7510 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
| HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
| Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
| Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
| Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
| NAC | Sigma | A8199 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
| Ordinary forceps | |||
| P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
| Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Uridine | Sigma | U3003 |
References
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