Modelo murino de tumores hepáticos metastáticos no cenário de lesão de reperfusão de isquemia

Resumo

Nós descrevemos em detalhe um modelo clinicamente relevante do tumor das metástases do fígado do cancro colorretal (crlm) e a influência do reperfusão da isquemia do fígado (I/R) no crescimento e na metástase do tumor. Este modelo pode ajudar a compreender melhor os mecanismos subjacentes à promoção cirurgia-induzida do crescimento metastático do fígado.

Resumo

A lesão de isquemia e reperfusão hepática (I/R), um desafio clínico comum, continua sendo um processo fisiopatológico inevitável que tem demonstrado induzir múltiplos danos nos tecidos e órgãos. Apesar dos avanços recentes e das aproximações terapêuticas, a morbosidade total permaneceu insatisfatória especial nos pacientes com anomalias parenquimatosas subjacentes. No contexto do crescimento agressivo do cancro e da metástase, o I/R cirúrgico é suspeitado para ser o promotor que regula o retorno do tumor. Este artigo tem como objetivo descrever um modelo murino clinicamente relevante de I/R hepática e metástase hepática colorretal. Ao fazê-lo, pretendemos ajudar outros investigadores a estabelecer e aperfeiçoar este modelo para a sua prática de investigação de rotina para compreender melhor os efeitos do fígado I/R sobre a promoção de metástases hepáticas.

Introdução

O fígado é um dos locais mais comuns para o desenvolvimento da doença metastática¹. A mortalidade é quase invariavelmente atribuível a complicações associadas ao crescimento tumoral no fígado. Em pacientes com tumores sólidos metastáticos no fígado, a cirurgia continua sendo uma intervenção crucial para o controle da doença e uma possível abordagem curativa. Entretanto, a maioria vasta dos pacientes apresenta finalmente com doença periódica, predominante no fígado^2,3. Durante a cirurgia hepatic, o sangramento intraoperativo é comum, frequentemente necessitando a transfusão de sangue e as aproximações técnicas diferentes para o controle do sangramento, incluindo métodos de aperto vasculares. No entanto, tais medidas causam isquemia/reperfusão hepática (I/R) ao tecido hepático. Os efeitos adversos da I/R na função hepatocelular têm sido bem documentados. O insulto do fígado I/R inflama cascatas inflamatórias durante a restauração do fluxo sanguíneo através de vias inflamatórias⁴. Não só a lesão hepática I/R contribui para a insuficiência hepática, mas a evidência atual também mostra que a lesão de I/R estimula a adesão de células tumorais, e promove a incidência de formação de metástases e o crescimento da doença micrometastática existente⁵. Nós temos relatado previamente que o esforço cirúrgico induz a ativação de pilhas imunes que ajuda não somente no crescimento do tumor preliminar, mas igualmente facilita metástases capturando pilhas de cancro dentro da circulação⁶.

Aqui nós descrevemos em detalhe uma técnica para estabelecer um modelo do tumor do rato da metástase do fígado. Neste modelo, também apresentamos um método para induzir lesão de reperfusão hepática de isquemia que atua como um substituto para o estresse cirúrgico presente clinicamente durante hepatectomias. Os métodos combinados da injeção do cancro e do I/R hepatic podem com sucesso interpretar o desenvolvimento de CRLM nos pacientes que se submeteram ao Resection preliminar do tumor.

Protocolo

Todos os protocolos de animais são aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais e aderiram aos institutos nacionais de saúde (NIH) diretrizes. Os instrumentos utilizados para qualquer procedimento cirúrgico foram completamente esterilizados.

1. Preparação inicial

1. Antes de injetar células cancerosas no baço do rato, autoclave e esterilizar todos os instrumentos a serem utilizados durante o procedimento.
2. Esterilizar e/ou autoclave uma almofada de aquecimento, luvas cirúrgicas, gaze, pares de tesouras, grampos pequenos, dilatador da embarcação, fórceps cirúrgico, e um suporte da agulha.
3. Prepare o analgésico pós-operatório (0,1 mg/kg de buprenorfina) para ser administrado após a esplenectomia e a cada 12 h durante 2 dias.

2. cultura celular

1. Assegure-se de que as células cancerosas estão livres da contaminação do Mycoplasma usando um jogo de ELISA do Mycoplasma.
2. Prepare uma solução de 500 mL de meio de cultivo de Dulbecco Modified Eagle médio (DMEM) a 4 ° c para a cultura de células cancerosas Colorretais murinas (MC38). Os meios de cultivo devem ser suplementados com soro bovino fetal inativado por calor a 10% (FBS), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 15 mM de HEPES e 200 mM de L-glutamina.
3. Células cancerosas da cultura em um balão DNAse-e RNAse-livre (75 cm²). Incubar a cultura celular em uma incubadora umidificada de células/tecidos contendo 5% de CO₂. Manter a temperatura a 37 ° c.
4. Uma vez que as células proliferantes atingem 90 – 100% de confluência, aspiram os meios antigos, lavam as células com 1x tampão fosfato salina (PBS) e, em seguida, tratá-los com 1x tripsina (0,25%) para separar as células do balão.
5. Colete células em um tubo cônico de 15 mL e centrifugue por 5 min a 700 x g.
6. Aspirar a mídia e lave com 1X PBS duas vezes por centrifugação repetida.
7. Proceder para confirmar a viabilidade celular por células de coloração com mancha azul Tripan (0,4%).
8. Reressuscitem as células para uma concentração de 1 x 10⁶ células/100 μl em 1X PBS. Células de Pipet completamente para evitar quaisquer aglomerantes. Mantenha as células cancerosas no gelo antes da injeção.

3. injetando células tumorais

1. Anestesie 8 – 12-week-old macho (C57BL6) ratos através da administração de cetamina (150 mg/kg) e xilazina (12 mg/kg) via intraperitoneal usando um 1 ml 25 G (0,5 mm x 16 mm) agulha.
2. Raspar a pele abdominal dos ratos usando cortadores para evitar quaisquer infecções pós-operatórias.
3. Coloc ratos no sistema magnético da retração do fixador. Confirme que os camundongos estão completamente o efeito da anestesia por beliscar um dedo do pé ou a cauda.
4. Adicione gotas Salinas nos olhos para evitar a secura durante o procedimento.
5. Esfregue a solução de iodo-povidona (7,5%) à parede abdominal raspada para desinfectar a pele antes de fazer uma incisão cirúrgica.
6. Levante inicialmente a pele com o fórceps dentado e faça uma incisão do midline com a ajuda das tesouras cirúrgicas. Então, levante o músculo abdominal e o peritônio para criar uma incisão do midline do comprimento de aproximadamente 3 cm (midabdominal ao processo do xifóide para expor os índices abdominais. Tome cuidado para não estender a incisão além do processo xifóide para evitar sangramento extenso.
7. Coloque o hemostato em ambos os lados da incisão e o processo xifóide. Estenda o abdômen puxando a cauda para baixo e gravando-a. Use o aplicador estéril da ponta do algodão de 6 polegadas para separar e expor o spleen do tecido gordo pancreatic.
8. Antes da injeção no baço, vórtice das células cancerosas para evitar quaisquer aglomerantes de células.
9. Utilize uma seringa de insulina de 0,5 mL 28 G (0,36 mm x 13 mm) para injetáveis. Evite bolhas de ar.
10. Injete lentamente e cuidadosamente 100 μL de células na ponta do baço. Coloc uma ponta do algodão e adicione a pressão delicada para evitar o refluxo na região abdominal. Uma injeção bem sucedida pode ser observada identificando a mudança na cor do fígado durante a injeção.
11. Umedeça uma gaze estéril com 1X PBS e coloque-a sobre a área dissecada.
12. Transfira os ratos para uma almofada de aquecimento durante 15 minutos para permitir que as células cancerosas circulem dentro do sistema.
13. Para prosseguir com a lesão cirúrgica da isquemia e do reperfusão, siga as etapas 5.3-5.10.
    Nota: este procedimento destina-se a estudar o efeito do estabelecimento induzido por I/R de focos metastáticos.

4. SPLENECTOMY

1. Para realizar uma esplenectomia, use um dispositivo de cauterização manual. Levante com cuidado o spleen com fórceps liso e cauterizar os vasos sanguíneos splenic para evitar o sangramento excessivo. Remova o baço transecting os vasos na seção cauterizada.
2. Imediatamente após o procedimento, feche a incisão em um padrão de dupla camada, primeiro suturando a camada muscular e, em seguida, a pele. Utilize 4-0 suturas de polipropileno tanto para a parede abdominal como para a pele.
3. Antes de repetir o procedimento em um outro animal, desinfecte todos os instrumentos pulverizando os com o isopropanol de 70% ou introduzindo os em um banho do grânulo.
4. Coloque os ratos de volta em gaiolas originais e procure sinais de angústia e dor pós-cirúrgica.
5. Injetar analgésico pós-operatório (buprenorfina 0,1 mg/kg) a cada 12 h durante 2 dias para evitar a dor pós-cirúrgica.

5. lesão de reperfusão de isquemia

1. Aos 5 dias após a primeira laparotomia, anestesiam os camundongos administrando cetamina (150 mg/kg) e xilazina (12 mg/kg) intraperitonealmente usando uma agulha de 1 mL 25 G (0,5 mm x 16 mm). Siga os passos 3.3 – 3.4.
2. Esfregue a solução de iodo-povidona (7,5%) no abdômen raspado do mouse para desinfectar a pele e realizar uma laparotomia Midline como descrito acima na etapa 3,6.
3. Usando duas pontas umedecidas do algodão, mova delicadamente o intestino da cavidade para expor as estruturas associadas, incluindo a veia portal. Dissecar o Hilo do fígado livre do tecido circundante.
4. Levante a mediana e os lóbulos laterais esquerdos contra o diafragma. Separe o lóbulo quadrate do lobo lateral esquerdo dissecando o Hilo do fígado com as tesouras da mola usando um microscópio de funcionamento para permitir a visibilidade desobstruída para a estrutura portal da Tríade.
5. Coloc um cotonete úmido pequeno do algodão entre o lóbulo mediano e o lóbulo lateral direito para criar o suficiente espaço para apertar. Usando o fórceps do dilatador do vaso, passe cuidadosamente a rosca de 10 cm (4,0 sutura de polipropileno) para elevar a Tríade Portal. Obstrua todas as estruturas na tríade Portal (artéria hepatic, veia portal, e colagogo) aos lóbulos esquerdos e médios do fígado coloc uma braçadeira microvascular usando um micro-serrefine o aplicador da braçadeira com fechamento.
6. Se os lóbulos não mostrarem um branqueamento significativo, reajustar o grampo removendo e aplicando novamente.
   Nota: se o branqueamento imediato do fígado não ocorrer mesmo depois de reajustar o grampo, considere cuidadosamente se deve ou não proceder com a I/R.
7. Retire o cotonete de algodão pequeno colocado entre os lóbulos médios e laterais direito. Substitua suavemente o intestino na cavidade abdominal. Cubra a parede abdominal com uma gaze úmida (embebido com 1X PBS) e cubra com um envoltório plástico para minimizar a perda evaporativa.
8. Coloque o mouse sobre a almofada de aquecimento e aplique o grampo por um período de 60 min.
9. Ao longo do intervalo isquêmico, procure evidências de lesão por isquemia visualizando o claramento pálido dos lóbulos medial e lateral direito medial e esquerdo.
10. Inicie a reperfusão removendo as braçadeiras após o período de 60 min.
    Nota: a evidência da reperfusão pode ser observada por uma mudança imediata da cor da mediana e dos lóbulos laterais esquerdos.
11. Imediatamente após a reperfusão, feche a incisão com um padrão de sutura de dupla camada, primeiro suturando a camada muscular e, em seguida, a pele. Use a sutura de polipropileno 4-0 com a ajuda de um suporte de agulha para fechar a parede abdominal e a pele.
12. Antes de repetir o procedimento em outro animal, desinfete todos os instrumentos pulverizando-os com isopropanol de 70% ou inserindo-os em um banho aquecido do grânulo.
13. Coloque os ratos de volta em gaiolas originais e procure sinais de angústia e dor pós-cirúrgica.
14. Injetar analgésico pós-operatório (0,1 mg/kg de buprenorfina) a cada 12 h durante 2 dias para evitar a dor pós-cirúrgica.
15. Para camundongos Sham do fígado I/R, realize laparotomia, dissecção de Hilo e suturas abdominais.
    Nota: O papel do stress cirúrgico que influencia o estabelecimento de metástases do fígado pode ser investigado com dois projetos experimentais diferentes. O protocolo acima (modelo-1) é utilizado para estabelecer a doença hepática micrometastática e estudar o efeito da I/R hepática em seu crescimento (Figura 1a). Alternativamente, a I/R hepática e a injeção tumoral podem ser realizadas concomitantemente (modelo-2) para estudar o efeito da lesão de i/r no estabelecimento de novos focos metastáticos (Figura 1b). Para fazer isso, injetar células cancerosas no baço como descrito acima e permitir que eles circulem por 15 min. executar I/R fígado ou cirurgia Sham após o período circulante para 60 min. Realize a esplenectomia lateral 60 min mais tarde, e depois feche a incisão da laparotomia.

6. avaliação dos ratos operados

1. Durante o procedimento cirúrgico assegure-se de que os ratos estejam a influência da anestesia do estágio III realizando o teste palpebral e reflexo córneo. A dose anestésica adicional deve ser administrada sobre os sinais de reflexos.
2. Forneça o analgésico pós-operatório (buprenorfina 0,1 mg/kg) logo após a cirurgia e a cada 12h por 2 dias para evitar a dor pós-cirúrgica.
3. Permitir ratos 30 – 60 min de tempo de recuperação da anestesia. Monitore constantemente ratos e não os deixe desacompanhado até a recuperação completa.
4. Procure sinais da aflição tais como a parte traseira curvado, os olhos fechados, o movimento lento, e a falha ao noivo. Trate em conformidade até que os ratos voltem à sua atividade normal.
5. O cuidado supplimental que inclui líquidos, calor, agente da reversão de Yohimbine para o xylazine, roupa de cama de papel macia da toalha (para evitar a aspiração) deve ser fornecido após a cirurgia para melhorar o período da recuperação.

7. avaliação da lesão de reperfusão de isquemia hepática

1. Imediatamente após a aplicação da braçadeira, certifique-se de que o branqueamento pálido dos lóbulos médios e laterais esquerdos ocorra comparado aos lóbulos caudado e quadrate.
2. Avalie a lesão de isquemia hepática medindo os níveis séricos de alanina transaminase (sal), aspartato transaminase sérica (CET) e lactato desidrogenase sérica (sLDH). O sangue pode ser extraído da veia facial para extrair o soro 3 – 6 h após o início da reperfusão. Realize histologia hepática para analisar a área tumoral percentual dentro do lobo isquêmico.

Resultados

Todos os camundongos tipo selvagem (C57BL6) (n = 20) foram submetidos ao modelo de metástases hepáticas utilizando o protocolo descrito acima. Todos os camundongos injetados com ou sem lesão de reperfusão de isquemia sobreviveram até a data do sacrifício. O diagrama esquemático Figura 1a de um fígado com injeção de câncer ilustra o aperto da Tríade Portal (artéria hepática, veia porta e ducto biliar) que induz um fígado parcial isquêmico (70%) insulto para a mediana e os lóbulos laterais esq...

Discussão

O modelo animal descrito neste manuscrito é baseado em duas abordagens principais. O primeiro é reconhecer a capacidade das células cancerosas para localizar e proliferar nos lóbulos do fígado. O segundo é estudar o efeito da lesão hepática de reperfusão de isquemia influenciando o crescimento tumoral e as metástases. Este modelo permite o estudo relevante de metástases do fígado na ausência de metástases secundárias em um rato imuno-competente. O modelo é útil para abordar as questões de eficiência metastática, como ext...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Lonza	12-614F
Soro Fetal	Bovino Lonza	900-108
L-Glutamina	Gibco	25030-081
Penicilina	Fisher scientific	15-140-122
Stretomysin	Fisher scientific	15-140-122
HEPES	Fisher Scientific
Trypsin	Hyclone	sh30042.02
Frasco de cultura de células 75cm	5 células Star	658170
15ml PP Tubos cônicos	BioExcell	41021037
Trypan Blue Stain	Giibco	15250-061
Gaze	Fisherbrand	1376152
Cautry	Bovie	AA01
braçadeira microvascular	Ferramentas Finescience	18055-03
Micro-Serrefine aplicador de braçadeira com trava	Tesoura de mola Fine science toosl	FST-18056-14
de mola Fine science toosl	FST-15021-15
Dilatador de vaso	Fine science toosl	FST-00276-13
Fixador magnético Sistema de retração	Fine ciência toosl	FST-18200020
Micro-Adson Fórceps	Fine science toosl	FST-11019-12
Micro-Adson Fórceps	Fine science toosl	FST-11018-12
4-0 polipropileno sutura	Ethicon	K881H
Porta-agulha	Harvard Apparatus	72-8826
Almofada de aquecimento	Fisher scientific
Clipper	Oster	559A
Solução de iodo-povidona	Medline	MDS093945
Seringa 1ml 25G	BD segurança Glide	305903
Seringa de insulina 0,5 ml	Seringas de insulina BD	32946
Aplicador com ponta de algodão	Fisher Scientific	23-400-101
Cirúrgico Microscópio	Leica	LR92240
Mycoplasma Elisa Kit	Roche	11663925910
Cetamina	Putney	#056344
Xylazine	NADA	#139-236
Tira ALT	Heska	15809554
Tira AST	Heska	15809542
Tira LDH	Heska	15809607

SH3023701 Tesoura 1443915