Method Article

Medição de BK-Polyomavirus não-codificação região controle driven transcriptional atividade via citometria de fluxo

DOI:

10.3791/59755

⸱

July 13th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen, 2Institute for Virology, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen, 3Center for Translational Medicine, Medical Department I, Marien Hospital Herne, University Hospital of the Ruhr-University of Bochum, 4Department of Infectious Diseases, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen Hufelandstr

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste manuscrito, um protocolo é apresentado para executar a medida FACS-baseada da atividade transcricional de BK-Polyomavirus usando as pilhas HEK293T transfected com um plasmídeo bidirecional do repórter que expressa tdtomato e EGFP. Este método permite determinar quantitativamente a influência de novos compostos na transcrição viral.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os poliomavírus, como o BK-Polyomavirus (BKPyV), podem causar patologias severas em pacientes imunocomprometidos. No entanto, uma vez que os antivirais altamente eficazes não estão atualmente disponíveis, são necessários métodos que medem o impacto de potenciais agentes antivirais. Aqui, um repórter de fluorescência dupla que permite a análise do BKPyV não-codificação de controle-região (NCCR) impulsionado atividade precoce e tardia promotor foi construído para quantificar o impacto de potenciais medicamentos antivirais na expressão gênica viral via tdTomato e eGFP Expressão. Além, clonando os amplicões de bkpyv-nccr que neste protocolo foram obtidos exemplarmente do ADN sangue-derivado de pacientes transplantados renais imunocomprometidos, o impacto de nccr-rearranjos na expressão de gene viral pode ser determinado. Depois da clonagem dos amplicons derivados pacientes, as pilhas HEK293T foram transfected com o repórter-Plasmids, e tratadas com os agentes antivirais potenciais. Subseqüentemente, as pilhas foram sujeitadas a FACS-análise para medir as intensidades médias da fluorescência 72 h transfection do borne. Para testar também a análise de drogas que têm um potencial efeito inibidor do ciclo celular, apenas transfected e, portanto, as células fluorescentes são usadas. Desde que este ensaio é executado no grande antígeno de T que expressa pilhas, o impacto da expressão adiantada e atrasada pode ser analisado em uma maneira mutuamente independente.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os poliomavírus representam uma família independente de pequenos vírus de DNA duplo-encalhado (dsDNA) com o vírus Simian 40 (SV40) como uma espécie de protótipo. A infecção primária ocorre principalmente durante a infância, que geralmente prosseguem sem sintomas de doença e geralmente causam infecções latentes em hospedeiros competentes imunológicos. O BK-Polyomavirus (BKPyV) persiste principalmente em células tubulares renais sem causar nefropatologia, no entanto, em caso de comprometimento da imuno-competência após o transplante renal, o vírus pode reativar e causar danos graves e comprometimento do enxerto função ao atingir uma viremia alta (1 x 104 bkpyv DNA cópias/ml)1,2. Em aproximadamente 10% dos receptores de transplante renal, a reativação do BK-Polyomavirus (bkpyv) resulta em uma nefropatia associada ao poliomavírus (pyvan), que foi de até 80% associada a um alto risco de falhas renais do aloenxerto3,4 . Desde que nenhum agente antiviral aprovado está disponível, a terapia atual é baseada na redução do immunosuppression. Curiosamente, os inibidores de mTOR parecem ter um efeito antiviral; assim, comutar a terapia imunossupressores ao imunossupressão mTOR-baseado pôde representar uma aproximação alternativa para impedir a progressão do bkpyv viremia5,6,7. No entanto, o mecanismo antiviral baseado em mTOR é atualmente ainda incompletamente compreendido. Assim, são necessários métodos que medem o impacto de potenciais agentes antivirais em concentrações clinicamente relevantes.

O genoma circular do BKPyV consiste em aproximadamente 5 KB abrigando uma região de controle não-codificante (NCCR) que serve como uma origem de replicação e concomitantemente um promotor bidirecional dirigindo a expressão de transcrições de mRNA de fase precoce e tardia. Desde que ocorra espontâneamente nccr-rearranjos, deleções, e duplicações são encontrados no bkpyv patogénico8 e acumulado significativamente nos pacientes que sofrem de pvan5,9, uma comparação de arquetípico (WT) e Re-arranjado (RR) NCCR-atividades são úteis para caracterizar a aptidão replicativa viral.

Como resumido na Figura 1, este protocolo descreve um método comumente usado para medir a atividade transcricional de BKPyV nccr quantificando a fluorescência de dois fluoróforos tdTomato e EGFP expressos a partir de um repórter plasmídeo5, 9,10,11. O procedimento é realizado na presença do antígeno T SV40 grande (lTAg), que permite analisar o impacto de potenciais agentes antivirais na atividade de NCCR precoce e tardia separadamente5. Este ensaio analisa ainda mais o impacto dos rearranjos sobre a atividade da nccr e a comparação com o WT-nccrs5,9. O plasmídeo do repórter abriga o sinal atrasado da poliadenilação SV40 a jusante de cada frame de leitura aberto do fluoróforo para assegurar o processamento comparável e eficiente de ambos os transcritos para tdtomato e EGFP, respectivamente. Comparado aos métodos baseados em qRT-PCR5,12, esta aproximação FACS-baseada representa uma alternativa compatível do baixo custo e da taxa de transferência elevada desde nenhuns protocolos complicados da extração para a cultura de pilha contaminada e nenhum caro os anticorpos para a mancha imune da fluorescência são necessários. Além disso, uma vez que uma quantidade definida de células fluorescentes é analisada através da citometria de fluxo, a análise dos agentes inibidores do ciclo celular também é possível de forma quantitativa.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo segue as diretrizes da pesquisa humana, conforme aprovado pelo Comitê de ética da faculdade de medicina da Universidade de Duisburg-Essen (14-6028-BO).

1. coleta de amostras de sangue ou urina e isolamento de DNA de poliomavirus

  1. Colete pelo menos 3 mL de sangue em tubos de EDTA ou urina em tubos de aquisição.
  2. Centrifugue a amostra a 2.500 x g durante 15 min. Se necessário, pipeta o plasma em um tubo novo e armazene as amostras do plasma em 4 ° c por diversos dias ou congele-se em-20 ° c para um armazenamento mais longo.
  3. Prepare 40 μL de proteinase K para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 400 μL de plasma por pipetagem.
  4. Lyse a amostra adicionando 400 μL de tampão de Lise, vortex por 15 s, e incubar por 10 min a 56 ° c.
  5. Isole o DNA usando um kit de extração de sangue de DNA, conforme descrito nas instruções do fabricante. Momentaneamente, adicione o álcool e carregue os lysates em uma coluna da rotação que contem uma membrana sílica-baseada de ligação do ADN. Lave as colunas várias vezes para produzir DNA puro.
  6. Elute o ADN rendido em 30-50 μL do tampão de TE.

2. amplificação da região de controlo não codificante (NCCR)

  1. Realize o procedimento a seguir em salas separadas fisicamente. Use uma sala isolada para preparar os reagentes e distribuir a mistura para os tubos de PCR.
  2. Prepare a mistura mestra para o pre-PCR usando o par da primeira demão A (tabela 1) em um volume total de 50 μl e use o ADN previamente isolado da etapa 1,6. O esquema de pipetagem para preparar a mistura mestra para a PCR pré e aninhada é impresso na tabela 2.
  3. Distribuir 45 μL da mistura mestra nos tubos de PCR.
  4. Adicionar 5 μL do DNA isolado nos tubos de PCR.
    Nota: use outra sala do que a para a preparação do Mix mestre para evitar a contaminação.
  5. Execute o PCR com as condições da reação como ilustrado na tabela 3. Repita a desnaturação, o recozimento, e a extensão em 35 ciclos.
  6. Para a amplificação aninhada use primer par B abrigando os locais de restrição para AgeI e SpeI (tabela 1).
  7. Execute o PCR aninhado com as condições da reação como descrito nas etapas 2,2 a 2,5 usando 5 μL do pre-PCR.
  8. Misturar 10 μL do produto PCR com 2 μL de corante de carregamento de gel 6x. Carregar 10 μL da mistura num gel de agarose de 1,5% e administrar o gel durante 30 min a 60 mA.
  9. Visualize o gel usando um sistema de documentação UV apropriado.
    Nota: o tamanho do amplicon é esperado estar entre 300-500 BP dependendo se os rearranjos (deleções, inserções, ou duplicações) ocorreram (Figura 2C).
  10. Purify os amplicões do PCR usando um jogo da purificação do PCR de acordo com as instruções do fabricante. Elute os amplicões do PCR em 30 μl do amortecedor da eluição.
  11. Envie os amplicões para sequenciamento de Sanger usando o par de primer B.

3. clonagem da NCCR para o repórter de fluorescência dupla

  1. Digerir os amplicões purificados (passo 2,10) com agei e Spei durante 2 h a 37 ° c, conforme descrito na tabela 4.
  2. Repita o passo 2,10 e purifique os amplicons digeridos.
  3. Paralelamente, também digerir a espinha dorsal plasmídeo (1,5 μg) com AgeI e SpeI para 2 h a 37 ° c, conforme descrito na tabela 5. Esta etapa só precisa ser executada uma vez. Para reações subsequentes, congele a digestão a-20 ° c.
  4. Analise o backbone plasmídeo digerido em um gel de agarose de baixo derretimento de 0,8%.
    Nota: não execute o gel com uma corrente superior a 40 mA. A pastilha esperada da região espaçador originalmente derivada do plasmídeo pEX-K4 2-LTR CD313 é 128 BP (Figura 2C).
  5. Visualize fragmentos de DNA usando luz UV de onda longa (320 nm) e recorte a banda de backbone usando um bisturi limpo. Transfira o fragmento de gel de baixa fusão para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Evite longos tempos de exposição UV para evitar danos ao DNA.
    Nota: desde que o baixo Agarose do derretimento é usado, não é necessário purificar o ADN antes da ligadura.
  6. Aqueça a espinha dorsal que contém a parte baixa do Agarose do derretimento por 10 minutos em 65 ° c a fim derreter a parte do gel e misturar cada 2 minutos pelo vortexing delicado. O gel derretido pode ser usado diretamente para a ligadura.
  7. Ligate a espinha dorsal e o amplicon digerido usando a ligase do ADN T4 sobre a noite em 16 ° c usando o esquema mostrado na tabela 6.
  8. Realize a transformação em E. coli usando o método de choque térmico, bactérias da placa em placas lb-amp, e cultura a 37 ° c durante a noite.
  9. No dia seguinte, selecione três clones positivos e prepare culturas de e. coli durante a noite (5 ml de lb-amp) e cultura a 37 ° c.
  10. Isole o Plasmid-DNA usando protocolos padrão como descrito em outro lugar14, realize a digestão de agei e de Spei para verific para ver se há clones positivos e visualize fragmentos cortados em um gel de agarose de 1%. A banda espaçador (128 BP) será substituída pela maior sequência de NCCR (300-500 BP, ver acima).
  11. Envie o plasmídeo para sequenciamento de Sanger usando primer EGFP-N ou primer par B (tabela 1).
  12. Como as mutações podem ocorrer espontaneamente, compare os resultados de sequenciamento com os resultados de sequenciamento obtidos com o amplicon. Utilize apenas os clones que contenham sequências idênticas em comparação com o amplicon.
  13. Use um software de bancada molecular (por exemplo, freeware GENtle 1.9.4 ou outros programas de edição de sequência) para alinhar e editar as sequências obtidas (Figura 3).
  14. Inicie o GENtle 1.9.4 e importe as sequências de DNA clicando no botão Import (seta verde para baixo).
  15. Em seguida, clique na ferramenta e selecione o alinhamento a partir do menu (use Ctrl + G como um atalho) e escolha as seqüências de DNA para o alinhamento.
  16. Adicione uma sequência ao alinhamento clicando em Adicionar ou remover uma sequência clicando em remover. Inclua uma seqüência arquetípico do consenso de nccr como JN19243815, não use a nccr-seqüência do Dunlop-tensão16comumente usada, desde que abriga rearranjos e duplicações outro do que o bkpyv arquetípico Cepas.
    Nota: o NCCR já contém o Codon de início translacional (Figura 3).
  17. Escolha um método para o alinhamento clicando no algoritmo na barra de ferramentas e escolha CLUSTAL W. defina os parâmetros de alinhamento para corresponder a 2; penalidade de extensão de Gap-1; penalidade de Gap-2 e clique em OK para executar o alinhamento.

4. transfecção transitória de células HEK293T com o plasmídeo repórter e tratamento com potenciais agentes antivirais

  1. Para preparar quantidades suficientes de DNA plasmídeo para experimentos subsequentes de transfecção, prepare uma cultura de 150 mL durante a noite. Isole o DNA plasmídeo usando um kit de isolamento plasmídeo. Alternativamente, outros kits de purificação de plasmídeo podem ser usados.
  2. Sementes 1 x 105 HEK293T células em DMEM contendo 10% FCS, penicilina e estreptomicina (1x) por poço de uma placa de 12 poços 24 h antes da transfecção e incubar durante a noite a 37 ° c e 5% co2 para manter a proliferação ativa durante a transfecção.
    Nota: as células devem ser aproximadamente 80% confluentes na transfecção.
  3. Coloque 250 μL de meios séricos reduzidos num tubo estéril e adicione 1 μg de cada ADN de plasmídeo de repórter e misture suavemente com pipetagem.
  4. Adicionar 3 μL do reagente de transfecção à mistura de ADN, misturar suavemente introduzindo pipetagem e incubar durante 15 min. pré aqueça o reagente de transfecção à temperatura ambiente de 22 ° c e vórtice suavemente antes de utilizar.
  5. Adicione a mistura gota-sábio para os poços e gentilmente distribuir para o poço.
  6. Após 4 h, substitua o sobrenadante por meio fresco contendo os agentes de teste e o controle do solvente. Incubar a 37 ° c até a análise. Neste exemplo, os inibidores de mTOR INK128 (100 ng/ml) e rapamicina (100 ng/ml) foram usados.

5. microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

  1. Verificar as células para a fluorescência vermelha e verde o microscópio de fluorescência (Figura 4).
    Nota: a fluorescência vermelha e verde corresponde à expressão genética inicial e tardia do BKPyV, respetivamente.
  2. Após o transfection do borne de 72 h, aspirar o sobrenadante e lavar as pilhas duas vezes com 1 mL de PBS frio.
  3. Adicione suavemente 500 μL de tripsina e rode ligeiramente a placa para evitar o descolamento prematuro das células. Esta etapa é importante evitar doublets da pilha.
  4. Após a adição, remova o tripsina diretamente com a mesma ponta da pipeta.
  5. Incubar as células durante pelo menos 5 min a 37 ° c.
  6. Suspender as células tripsinizadas com 1 mL de PBS contendo 3% de FCS e transferir a suspensão em tubos de FACS pré-rotulados.
  7. Adicionar DAPI (1 μg/mL) antes da análise FACS.
  8. Analise as células usando um citometro de fluxo. Para cada amostra, medir pelo menos 10.000 células vivas, que são negativas para a coloração DAPI.

6. análise de dados

  1. Importe os dados para o software de análise de citometria de fluxo e adicione amostras por clique e arraste para o espaço de trabalho.
  2. Clique duas vezes no arquivo importado e crie uma plotagem de gráfico. Escolha FSC-A versus SSC-A clicando no eixo x e y. Porta a população de células principal clicando em polígono na barra de ferramentas e enquadrar a população de células (Figura 5). Nomeie a população de células escolhida conforme necessário (por exemplo, "células simples"). As "células individuais" aparecerá como um novo espaço de trabalho.
  3. Prossiga com a gating "células individuais" para DAPI negativa (i.e., "células vivas"). Para identificar células vivas comparar a população celular com e sem coloração DAPI. Em ambas as parcelas escolha FSC-A versus Pacific-Blue-A.
  4. Clique no retângulo e escolha a população de células negativas DAPI, nomeie a população de célula escolhida "células vivas" e crie um novo gráfico de pontos mostrando FITC (eGFP) versus PE (tdTomato) como descrito anteriormente.
  5. Adicione quadrantes em "células vivas" escolhendo Quad na barra de ferramentas. Porta a população arrastando o centro do quadrante para a borda de cada população. Os quadrantes representam 1) EGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM +, 3) eGFP + tdTOM-, 4) eGFP + tdTOM +.
    Nota: devido à sobreposição espectral de espectros de emissão entre FITC e PE, a compensação inicial é essencial para distinguir entre sinais vermelhos e verdes e para alcançar resultados precisos.
  6. Determine a média de intensidades de fluorescência (IFM) clicando com o botão direito do mouse no quadrante e escolhendo adicionar estatísticas. Escolha média e clique em OK. O MFI médio é agora exibido abaixo da população na seção "Estatísticas". Os quadrantes 2 e 4 correspondem à expressão precoce, enquanto os quadrantes 3 e 4 representam a expressão tardia.
  7. Adicione réplicas adicionais da mesma maneira para poder estatístico.
  8. Para valores de MFI de plotagem de interpretação de dados de cedo e tarde em um gráfico de barras:
  9. Para comparar as atividades de NCCR obtidas de diferentes doadores ou cepas de vírus, adicione um controle arquetípico ou a cepa Dunlop16 e defina suas IFM relativas a 100% e calcule os valores de IFM relativos. Repita com cada repetição e determine a média e o desvio padrão.
  10. Para avaliar um efeito de potenciais compostos na atividade transcricional, definir o solvente-controle para 100% e traçar o IFM das células tratadas.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste experimento representativo, a atividade transcricional da região de controle não-codificante BK-Polyomavirus foi mensurada via citometria de fluxo. Além, um inibidor de mTOR, que possa ser usado para tratar pacientes após o reactivation de BKPyV, foi testado para sua inibição da expressão adiantada viral do gene. Para tal, utilizou-se um ensaio de dupla fluorescência-repórter como publicado anteriormente5. O esquema de fluxo de trabalho geral da configuração ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste artigo, um método comumente usado é apresentado que permite a análise do BKPyV não-codificação controle-região (NCCR) impulsionado atividade promotor precoce e tardia. A atividade da NCCR pode ser medida simultaneamente e não precisa de Lise das células transfectadas. Além disso, um número relativamente grande de pilhas pode ser analisado e o co-transfection de marcadores adicionais para a normalização dos valores da fluorescência não é necessário.

Uma parte crítica deste método é que o ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Johannes Korth recebeu subsídios para a taxa do orador e despesas de viagem de Astellas e Novartis. Marek Widera recebeu honorários de consultoria da Novartis. Oliver Witzke recebeu subsídios para estudos clínicos, taxa do orador, honorários e despesas de viagem de Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, Chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. Köhler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi e TEVA.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem a Barbara Bleekmann pela excelente assistência técnica. Estes estudos foram apoiados pelo IFORES-programa da Universidade de Duisburg-Essen Medical School e do RIMUR-programa da Universidade Alliance Ruhr e Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Os autores agradecem a Jürgen-Manchot-Stiftung pela bolsa de doutorado de Helene Sertznig e apoio constante. A coleta e uso do material do paciente foi aprovada pelo Comitê de ética da faculdade de medicina da Universidade Duisburg-Essen (14-6028-BO).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Escada de 100 pbNEBN3231Qualquer escada com alcance de até 1 kb pode ser substituída por
escada de 2 torasNEBN0550Qualquer escada com alcance de até 10 kb pode ser substituída
Agar-Agar, Kobe ICarl Roth5210.3
AgeI-HFNEBR3552
Ampicilina Natriumsalz CellpureCarl RothHP62.1
Aqua ad iniectabiliaBbraun2351744pode ser substituído por qualquer fabricante
BD FACSCanto™ IIBD Biosciences
BD FACSDivaBD Biosciences
DAPISigma10236276001
módulo de câmera DFC450CLeicaQualquer câmera pode ser usada
DMEMGibco41966-029pode ser substituída por qualquer fabricante
DMIL Microscópio LEDLeicaQualquer microscópio de fluorescência pode ser usado
DNA Blood Mini KitQiagen51104pode ser substituído por qualquer fabricante
E.coli DH5alpha Células CompetentesThermo Scientific18258012
FBS SuperiorMerckMillipore50615Qualquer FBS pode ser usado
FlowJo v10.5.3FlowJo, LLCQualquer software de citometria de fluxo FBS pode ser usado
Corante de Carregamento de Gel, Roxo (6X) NEBB7024Qualquer corante de carga 6x pode ser substituído
HEK293T célulasATCC11268Essas células expressam constitutivamente o antígeno T grande do vírus símio 40 (SV40), e o clone 17 foi selecionado especificamente por sua alta transfectabilidade.
A Incubadora de CO2 HERAcell® 240iThermo Scientificpode ser substituída por qualquer fabricante
Kit de PCR HotStarQiagen203203
IntasGel Qualquersistema de visualização para DNA corado contendo géis de agarose pode ser usado
Low Melt AgaroseBiozym850081pode ser substituído por qualquer fabricante
Opti-MEMInvitrogen31985070pode ser substituído por qualquer fabricante
pBKV (34-2)ATCC45025Plasmídeo que abriga o genoma completo da cepa BKPyV Dunlop; foi usado como controle positivo; DNA Seq. Acc.: KP412983
PBSGibco14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal CyclerBio-Radproduto descontinuadoQualquer termociclador pode ser usado
PCR Nucleotide Mix, 10 mMPromega#C1145pode ser substituído por qualquer fabricante
PCR1 e PCR2 Primersmetabionnão aplicávelDessalgado. Diluir para (10 µ M) com água de grau PCR
PenStrep (100x)Gibco15140-122pode ser substituído por qualquer fabricante
Roti®-GelStainCarl Roth3865Uma coloração à base de fluorescência para medir a concentração de dsDNA
SpeI-HFNEBR3133
T4-DNA LigaseNEBM0202
TransIT LT1MirusMIR2300
Tripsina 0,05% - EDTAGibco25300-054pode ser substituído por qualquer fabricante
ZymoPURE II Plasmid KitZymoD4201pode ser substituído por qualquer fabricante
Sistema de documentação

References

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