Usando estímulos visuais de Looming para avaliar a visão do mouse

Resumo

Para examinar a visão do mouse, realizamos um teste de iminente. Camundongos foram colocados em uma grande arena quadrada com um monitor em seu teto. O estímulo visual iminente evocou consistentemente as reações de congelamento ou de voo nos camundongos.

Resumo

O sistema visual no sistema nervoso central processa diversos sinais visuais. Embora a estrutura geral tenha sido caracterizada a partir da retina através do núcleo geniculado lateral para o córtex visual, o sistema é complexo. Estudos celulares e moleculares têm sido conduzidos para elucidar os mecanismos que sustentam o processamento visual e, por extensão, mecanismos de doença. Estes estudos podem contribuir para o desenvolvimento de sistemas visuais artificiais. Para validar os resultados desses estudos, é necessário o teste de visão comportamental. Aqui, mostramos que o experimento de estimulação iminente é um teste de visão confiável do mouse que requer uma configuração relativamente simples. O experimento em ascensão foi conduzido em um grande recinto com um abrigo em um canto e um monitor de computador localizado no teto. Uma câmera CCD posicionada ao lado do monitor do computador serviu para observar o comportamento do mouse. Um rato foi colocado no recinto por 10 minutos e permitiu aclime e explorar os arredores. Em seguida, o monitor projetou um estímulo de iminente derivado do programa 10 vezes. O rato respondeu aos estímulos ou congelando-se ou fugindo ao esconderijo. O comportamento do mouse antes e após os estímulos de iminente foi gravado, e o vídeo foi analisado usando o software de rastreamento de movimento. A velocidade do movimento do mouse mudou significativamente após os estímulos de iminente. Em contraste, nenhuma reação foi observada em camundongos cegos. Nossos resultados demonstram que o experimento de iminente simples é um teste confiável de visão do mouse.

Introdução

O sistema visual começa na retina, onde os sinais visuais são capturados por fotorreceptores, canalizados para células bipolares (2 neurônios de ordem^ND), e finalmente passados para células ganglionares (3^RD-ordem neurônios). Os neurônios da ordem retina 2^NDe 3^RDsão pensados para formar múltiplas vias neurais que transmitem aspectos específicos da sinalização visual, como cor, movimento ou forma. Estas características visuais diversificadas são retransmitidas ao núcleo geniculado lateral e ao córtice visual. Ao contrário, os sinais visuais que conduzem ao movimento do olho são emitidos ao colliculus superior. Classicamente, duas vias retino-corticais foram identificadas: os caminhos magnocelular e parvocelular. Esses caminhos codificam objetos móveis e estacionários, respectivamente, e sua existência incorpora o conceito básico de processamento paralelo^1,2,3,4,5, a ⁶. Recentemente, mais de 15 tipos de células bipolares^7,8,9,10,11 e células ganglionares^{12,13,14 ,15,16} foram relatados na retina de muitas espécies, incluindo o primata retina. Estas células distinguem-se não só pelos aspectos morfológicos, mas também pela expressão de diferentes marcadores e genes^8,10,17,¹⁸, sugerindo que várias características da os sinais visuais são processados paralelamente, o que é mais complicado do que o previsto inicialmente.

As tecnologias celulares e moleculares contribuíram para a nossa compreensão do processamento visual e dos potenciais mecanismos de doença que podem surgir do processamento visual aberrante. Tal entendimento pode contribuir para o desenvolvimento de olhos artificiais. Embora as examinações e a análise celulares ofereçam o conhecimento detalhado em um nível celular, uma combinação de experiências comportáveis e de experiências celulares aumentaria significativamente nossa compreensão atual de processos visuais minuciados. Por exemplo, Yoshida et al.¹⁹ descobriram que as células amacrinas Starburst são os neurônios-chave para a detecção de movimento na retina do mouse. Após experimentos celulares, eles realizaram o experimento comportamental de nistagmo optocinético (OKN) para mostrar que camundongos mutantes em que as células amacrinas Starburst foram disfuncionais não responderam a objetos em movimento, confirmando assim a sua rede celular Investigações. Além disso, Pearson et al.²⁰ realizaram transplante de fotorreceptores na retina do camundongo para restaurar a visão em camundongos doentes. Eles realizaram não apenas experimentos celulares, mas também mediram o comportamento do mouse através do uso de gravações de resposta optomotora e tarefas de labirinto de água, permitindo assim Pearson et al. verificar que os fotorreceptores transplantados restauraram a visão no anteriormente cego Ratos. Tomados em conjunto, experimentos comportamentais são ferramentas fortes para avaliar a visão do mouse.

Vários métodos estão disponíveis para medir a visão do mouse. Esses métodos têm vantagens e limitações. In vivo ERG fornece informações sobre se a retina do mouse, particularmente fotorreceptores e em células bipolares, responde adequadamente a estímulos leves. O ERG pode ser testado as condições Scotopic ou photopic^21,22. No entanto, o ERG requer anestesia, o que pode afetar a medição de saída²³. O reflexo optocinético (OKR) ou a resposta optomotora (OMR) é um método robusto para avaliar a sensibilidade ao contraste e a resolução espacial, ambos os componentes funcionais da visão do mouse. No entanto, o OKR requer cirurgia para anexar um dispositivo de fixação ao crânio do mouse²⁴. OMR não requer cirurgia nem treinamento de mouse; no entanto, requer treinamento para permitir que um experimentador detecte subjetivamente os movimentos sutis da cabeça do mouse em resposta a uma grade em movimento em um tambor óptico ^25,26. O reflexo de luz pupilar mede a constrição da pupila em resposta a estímulos leves, o que não requer anestesia e apresenta respostas objetivas e robustas ¹⁹. Embora o reflexo da pupila simule a resposta clara retinal in vivo, o reflexo é negociado principalmente pelas pilhas retinal intrinsecamente fotossensível do gânglio (iprgcs) ²⁷. Porque os ipRGCs representam uma minoria pequena de RGCs e não servem como pilhas convencionais da imagem-formação do gânglio, esta medida não fornece a informação que pertence à maioria de pilhas do gânglio.

O experimento de luz iminente não foi previamente considerado um teste importante para medir a visão do mouse. No entanto, é também um teste de visão robusto e confiável em várias espécies, tais como^{mouse 28,29}, zebrafish³⁰, Locust^31,32, e^{humano 33,34, 35}. importante, o experimento iminente é um dos poucos métodos para testar a via de formação de imagem-não é uma via reflexa-dado o Visual e os sistemas límbico no sistema nervoso central estão envolvidos neste circuito^{36, 37,38}. Nós estabelecemos um sistema de estímulo visual iminente e demonstraram sua capacidade de eliciar detecção de movimento no mouse, que usamos como um proxy para avaliar a intactência do sistema visual do mouse.

Protocolo

Todos os experimentos e cuidados com animais foram conduzidos de acordo com o protocolo aprovado pelos comitês institucionais de cuidado e uso de animais da Wayne State University (protocolo n º 17-11-0399).

1. preparação para o experimento

1. Construa um cerco retangular da abrir-tampa para abrigar o rato durante a apresentação de estímulo visual de aparecimento. Foi construído um invólucro de 40 cm x 50 cm x 33 cm com moldura em alumínio e painéis de PVC (Figura 1a, B). Coloque uma folha de papel para cobrir todo o piso do recinto para garantir uma limpeza fácil entre os ensaios. Adicione um abrigo opaco em um canto do recinto com uma entrada virada para o centro da arena para fácil entrada e saída.
2. Configure uma câmera com uma lente grande angular para capturar o comportamento do mouse. Fixe a câmara a um suporte montado na mesa adjacente ao recinto. Para captura de vídeo de melhor qualidade, use uma taxa de quadros de câmera de 60 FPS ou superior.
3. Configure um monitor de computador na parte superior do compartimento. Porque o monitor não pôde ser visto do lado de fora, um segundo monitor foi preparado, que duplicou as imagens mostradas no monitor principal.
4. Prepare um padrão iminente para projeção. Uma maneira de fazer isso é usar o PsychToolbox3 dentro do software MatLab para codificar para um círculo preto em expansão (Figura 1C). Definir o estímulo para começar em um ângulo visual de 2 ° e expandir para 50 ° sobre 250 MS; Estes parâmetros determinam a velocidade do estímulo (ver Figura 1D para cálculo do ângulo visual). Defina o código para repetir o estímulo 10 vezes com um intervalo de 1 s.
   Nota: o estímulo iniciou cada repetição imediatamente após o término da apresentação anterior. Para mais informações sobre a apresentação do estímulo, consulte a secção 3.
5. Selecione os ratos de interesse para os estímulos de iminente. Aqui, use 32 ratos de olhos saudáveis de um fundo C57, masculino e feminino, 4 a 14 semanas de idade. Além disso, use 3 camundongos cegos (cataratas graves em ambos os olhos) para avaliar se a resposta ao estímulo iminente foi realmente um comportamento visualmente guiado. Estes ratos cegos não tiveram nenhum reflexo pupilar da luz e nenhuma resposta do optomotor.

2. aclimatação do rato

1. Coloque um rato no recinto e deixe-o explorar livremente os seus arredores. Se possível, tente minimizar o stress durante a transferência de animais usando a parte de trás de sua mão livre como um lugar de descanso para o mouse em vez de deixá-lo pendurar sem suporte. O rato deve encontrar o cerco inteiro para ser seguro e deve descobrir o esconderijo. Deixe cair algumas pelotas de alimento no canto oposto ao refúgio para incentivar o rato permanecer fora do refúgio.
2. Permita que o rato aclimatar em qualquer lugar de 7 a 15 minutos^29,39. Nós permitimos 10 minutos do aclimatação antes do início do estímulo. Além disso, 10 minutos de aclimatação um dia antes do experimento podem aliviar os camundongos.

3. projeção de estímulos visuais em iminente

1. Antes de inserir o mouse na arena, certifique-se de que o código de estímulo esteja pronto para ser executado para facilitar o quanto as alterações de iluminação forem possíveis enquanto o mouse estiver no compartimento. Uma vez que o software está pronto para funcionar, coloc delicadamente o rato no cerco.
2. 10 segundos antes da estimulação, inicie a captura de vídeo.
3. Iniciar o aparecimento de estímulos visuais quando o mouse está longe do abrigo e movendo-se livremente na arena aberta. Aguarde 10 segundos após a última apresentação do estímulo para encerrar a gravação.
   1. Comece a apresentação do estímulo quando o mouse está no canto mais distante do refúgio. No entanto, quando os ratos parecem não dispostos a explorar o canto distante, apresentar o estímulo quando o mouse está em um canto diferente da arena. Isso não parece fazer a diferença na resposta comportamental animal.
4. Transfira o mouse de volta para sua gaiola original. Limpe o recinto para o próximo rato, pulverizando as paredes e refúgio com 70% etanol e limpá-lo para baixo. Substitua o forro do assoalho do papel se sujado e reposicione o refúgio à mesma posição inicial se movido durante a transferência animal e a limpeza do cerco.

4. análise de vídeo

1. Salve o clipe de vídeo para cada mouse no formato. avi sem compactação de arquivos, a fim de garantir nenhuma perda de dados durante a transferência para o software de análise.
   Observação: falta de compactação levará a tamanho de arquivo maior; Portanto, use o disco rígido externo para armazenamento.
2. Use o software de análise para rastrear o movimento do animal em torno da Arena antes, durante e após a apresentação do estímulo. Use o software comercialmente disponível (consulte a tabela de materiais) com uma capacidade de rastreamento manual para rastrear a posição da cabeça do mouse em cada quadro de vídeo, que gerou a coordenação X e Y a cada 1/60 ms. outro software de rastreamento de movimento inclui Fiji (NIH )⁴⁰ e ethovision (noldus).
3. Calcule a velocidade ea distância do mouse a partir do refúgio. Se a imagem da arena for distorcida devido ao ângulo de vídeo, corrija a coordenação X e Y antes do cálculo (Figura 2).
4. Compare os parâmetros antes e após o início do estímulo iminente para determinar como o mouse respondeu aos estímulos, seja por congelamento, fugindo ou demonstrando nenhuma alteração no comportamento²⁹. Definir congelamento como episódios em que a velocidade era inferior a 20 mm/s para 0,5 s ou mais. Defina o vôo como episódios em que a velocidade aumentou para 400 mm/s ou maior e terminou com o mouse no refúgio. As definições de congelamento e de voo foram baseadas nas estabelecidas por Franceschi et al.²⁹

Resultados

Um rato com olhos sadios foi coloc no cerco e permitido ao aclimatar por 10 minutos. A arena com o monitor no teto foi mantida condições de luz mesópica (7 x 10⁵ fótons/μm²/s). Durante o período de aclimatação, o rato explorou o espaço e encontrou a cúpula opaca como um refúgio. Quando o mouse se afastou do refúgio, a captura de vídeo começou, seguida pela iniciação do estímulo visual. Em resposta ao estímulo iminente, a maioria dos camundongos correu para a cúpula (resposta de voo), que foi observa...

Discussão

Com o sistema de estímulo visual iminente, a maioria (97%) do olho-ratos saudáveis mostraram a resposta do vôo. Um dos 29 ratos não mostraram uma resposta de voo óbvia. No entanto, o mouse caminhou em direção à cúpula e permaneceu perto dele até o aparecimento desaparecer, indicando que o mouse era pelo menos cauteloso quando os estímulos de iminente ocorreram. Conseqüentemente, os estímulos de aparecimento eliciaram consistentemente respostas inatas do medo em ratos saudável-eyed. Por outro lado, três camundongos cegos ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Monitor de 10,1" (2° display)	Elecrow	Elecrow 10.1 Polegadas Raspberry Pi 1920x1080p Resolução Display
Laptop de Classe Executiva de 14" 5490	Dell	84 / rcrc961481-4860836
20" x 50" Absorventes Fisher	Scientific	AL2050	funciona bem para proteger o chão da arena, poderia usar qualquer tipo de monitor de forro de
21.5" (1° display)	Acer	Acer R221Q bid 21.5 polegadas IPS Full HD Display
CCD Camera	Lumenera Corporation	Infiniyy3S-1UR	excelente para estudos comportamentais devido à alta taxa de fps (60 fps)
Gabinete (quadros de alumínio e painéis de PVC)	80/20 Inc.	4x cat.#9010, 4x cat.#9005, 1x cat.#9000, 5x cat.#65-2616	excelente, usado guia de construção rápida para encontrar PVC, juntas e moldura
Etanol	Fisher Scientific	22-032-601
Software de Planilha Excel	Microsoft Office		amigável ao usuário e amplo conhecimento do software Microsoft Office
Freearm	Amazon		usado para montar a câmera na mesa, poderia usar qualquer montável braço extensível
ImagePro Premiere 3D	Media Cybernetics	versão 9.3	bom programa, poderia usar alguma atualização com o recurso de rastreamento automatizado
Software Matlab (Psychotoolbox 3)	MathWorks	Matlab R2018b 64 bits (9.5.0.944444)	excelente software para gerar estímulos padrão de quaisquer condições
SteamPix sorftware	Norpix	StreamPix 7 64-bit Câmera	únicafunciona bem, alguns problemas com queda de quadros, mas bom atendimento ao cliente
WD My Book Disco rígido externo	Western Digital	WDBBGB0080HBK disco rígido 8 TB USB 3.0	necessário se estiver usando arquivos .avi sem codec de compressão devido ao grande tamanho dos arquivos
Lente grande angular	Navitar	NMV-5M23	excelente e necessária para capturar toda a arena