Summary
I artikeln beskrivs ett snabbt protokoll för märkning blod kärl i en Benfisk fisk genom hjärt per fusion av DiI utspädd i fixativ, med hjälp av medaka (oryzias Auktor) som modell och med fokus på hjärna och hypofys vävnad.
Abstract
Blod kärlen innerverar alla vävnader i ryggradsdjur, vilket möjliggör deras överlevnad genom att tillhandahålla nödvändiga näringsämnen, syre och hormonella signaler. Det är en av de första organen att börja fungera under utvecklingen. Mekanismerna för bildandet av blod kärl har blivit föremål för ett högt vetenskapligt och kliniskt intresse. Hos vuxna är det dock svårt att visualisera kärl i de flesta levande djur på grund av deras lokalisering djupt inom andra vävnader. Ändå är visualisering av blod kärl viktigt för flera studier såsom endokrinologi och neurobiologi. Medan flera transgena linjer har utvecklats i zebra fisk, med blod kärl direkt visualiseras genom uttryck av fluorescerande proteiner, inga sådana verktyg finns för andra Benfisk arter. Med hjälp av medaka (oryzias Auktor) som modell, det nuvarande protokollet presenterar en snabb och direkt teknik för att märka blod kärl i hjärnan och hypofysen genom att parfymera genom hjärtat med fixativ som innehåller DiI. Detta protokoll gör det möjligt att förbättra vår förståelse för hur hjärnan och hypofysen celler interagerar med blod kärl i hela vävnad eller tjocka vävnad skivor.
Introduction
Blod kärlen spelar en viktig del av ryggradsdjur eftersom de ger nödvändiga näringsämnen, syre och hormonella signaler till alla organ. Dessutom, eftersom upptäckten av deras inblandning i cancer utveckling1, de har fått mycket uppmärksamhet i klinisk forskning. Även om ett antal publikationer har undersökt de mekanismer som möjliggör blod kärlens tillväxt och morfogenes, och ett stort antal gener viktiga för deras bildning har identifierats2, återstår mycket att förstå om samspelet mellan celler eller vävnader och det cirkulerande blodet.
Visualisering av blod kärl i hjärnan och hypofysen är viktigt. Nerv celler i hjärnan kräver en hög tillförsel av syre och glukos3, och hypofysen innehåller upp till åtta viktiga hormonproducerande cell typer som använder blod flödet för att ta emot signal från hjärnan och skicka sina respektive hormoner till olika perifera organ4,5. Även i däggdjur, Portal systemet vid basen av hypotalamus som heter median eminens, länkar hjärnan och hypofysen6, en sådan tydlig blod bro har inte beskrivits i Benfisk fisk. I själva verket, i teleosts, preoptico-hypotalamus nerv celler direkt projicera sina axoner i pars nervosa av hypofysen7 och mesta dels innerverar de olika endokrina cell typer direkt8,9. Emellertid, några av dessa nerv celler har sina nerv ändar ligger i extravaskulär rymden, i nära närhet till blod kapillärer10. Därför är skillnaden mellan Benfisk fisk och däggdjur inte så tydlig, och förhållandet mellan blod kärl och hjärnan och hypofysen celler kräver större utredning i Benfisk fisk.
Zebrafish har i många avseenden ett anatomiskt och funktionellt jämförbart kärl system till andra ryggradsdjur11. Det har blivit en kraftfull ryggradsdjur modell för kardiovaskulär forskning främst tack vare utvecklingen av flera transgena linjer där komponenter i det vaskulära systemet är märkta med fluorescerande reporter proteiner12. Emellertid, exakt cirkulations systemet anatomi kan variera mellan arter, eller till och med mellan två individer som tillhör samma art. Därför kan visualisering av blod kärl vara av stort intresse även i andra Benfisk arter för vilka genmodifiering verktyg inte existerar.
Flera tekniker har beskrivits för att märka blod kärlen i både däggdjur och teleoster. Dessa inkluderar in situ hybridisering för vasculature-specifika gener, alkaliska fosfataser färgning, mikroangiografi, och färg ämnen injektioner (för en översyn se13). Fluorescerande lipofila katjoniska indocarbocyanine Dye (DiI) användes först för att studera membran lipider lateral rörlighet som det bevaras i lipidbilayers och kan migrera genom det14,15,16. Faktum är att en molekyl av DiI består av två kolvätekedjor och kromophores. Medan kolvätekedjorna integreras i lipidbilayer cell membranet i cellerna i kontakt med den, kromophores kvar på sin yta17. En gång i membranet, DiI molekyler diffusa i sidled inom Lipiden lipidens som hjälper till att färga membran strukturer som inte är i direkt kontakt med DiI lösningen. Injicera en DiI lösning genom hjärt per fusion, kommer därför att märka alla endotelceller i kontakt med föreningen möjliggör direkt märkning av blod kärlen. Idag DiI används också för andra färgning ändamål, såsom enstaka molekyl avbildning, öde kart läggning, och neuronala spårning. Intressant, flera fluorophores finns (med olika våg längder av utsläpp) så att kombinationen med andra fluorescerande etiketter, och införlivandet samt den laterala diffusion av DiI kan förekomma i både levande och fasta vävnader18, och 19.
Formaldehyd, upptäcktes av Ferdinand Blum i 1893, har använts i stor utsträckning till nutid som den föredragna kemikalie för vävnadsfixering20,21. Den visar en bred specificitet för de flesta cellulära mål och bevarar den cellulära strukturen22,23. Det bevarar också de fluorescerande egenskaperna hos de flesta fluorophores, och kan därför användas för att fixera transgena djur för vilka riktade celler uttrycker fluorescerande reporter proteiner.
I detta manuskript, ett tidigare protokoll som utvecklats för att märka blod kärl i små experimentella däggdjurs modeller24 har anpassats till användningen i fisk. Hela proceduren tar bara några timmar att utföra. Det visar hur man kan parfymera en fixativ lösning av formaldehyd som innehåller DiI i fisken hjärtat för att direkt märka alla blod kärl i hjärnan och hypofysen av modellen fisk medaka. Medaka är en liten sötvatten fisk hemma i Asien, främst i Japan. Det är en forskningsmodellorganism med en svit av molekyl ära och genetiska verktyg tillgängliga25. Därför, identifiering av blod kärl i denna art samt i andra kommer att göra det möjligt att förbättra vår förståelse för hur hjärnan och hypofysen celler interagerar med blod kärl i hela vävnad eller tjocka vävnad skivor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All djur hantering utfördes i enlighet med rekommendationerna för vård och välfärd för forsknings djur vid Norges universitet för livs vetenskaper och under överinseende av auktoriserade utredare.
1. förberedelse av instrument och lösningar
- Förbered DiI stam lösning upplösning 5 mg DiI kristall i 1,5 mL plaströr med 1 mL 96% EtOH. Vortex i 30 s och hålla täckt med aluminiumfolie.
Anmärkning: Den DiI stam lösning kan bevaras i mörker vid-20 ° c i flera månader. - Förbered fisk hållaren (figur 1a) genom att skära en bit polystyren till 5 cm längd, 3 cm bredd, och 2 cm tjocklek, och limning den till en 9 cm-diameter plast skålen. Gör en 3 cm båtformade hål med en skalpell blad i polystyren.
- Förbered parfym systemet (figur 2) genom att tillsätta en 30-50 cm lång plastkanyl i änden av nålen.
- Bered 40 mL färsk 4% paraformaldehyd-lösning (PFA) genom spädning av 10 mL 16% PFA med 30 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i ett 50 mL plaströr.
- Bered 10 mL fixativ/DiI lösning genom spädning av 1 mL av DiI stam lösning i 9 mL nyberedd 4% PFA i ett 10 mL plaströr. Håll i mörkret tills den används.
Anmärkning: Den DiI kristaller som inte är upplöst kan hållas i beståndet lösningen röret, och ny etanol kan tillsättas för att förbereda nya DiI stam lösning (se steg 1,1). -
Förbered 50 mL trikain (MS-222) lager.
- Lös upp 200 mg Trikain pulver i 48 mL H2O. Tillsätt 2 ml 1 M tris bas (pH 9). Justera till pH 7 med 1 M HCl och förvara vid-20 ° c.
- Späd 5 mL Tricaine-lager i 50 mL rent vatten i ett litet glas.
- Förbered flera 5 cm glaspipetter (figur 2) genom att sträcka ut ett glas kapillär med en pipett avdragare enligt tillverkarens anvisningar.
2. dissektion och per fusion
Anmärkning: PFA är en giftig flyktig förening, därför dissektion och per fusion bör utföras i en huva eller i ett ventilerat rum, och användaren måste vara klädd i en gasmask.
- Förbered dissektion verktyg inklusive små sax, och en skarp och en stark pincett innan dissektion.
- Fyll sprutan med den beredda lösningen av PFA/DiI genom att placera den i 50 mL-röret och dra upp den. Placera sedan nålen med kanylen i änden av sprutan (figur 2).
- Fäst sprutan på bänken med hjälp av flera tejpbitar placerade i olika riktningar, justera mikroskopets läge och sätet för att få en bra position för dissektion och för att trycka sprutkolven (figur 1B).
Anmärkning: I detta protokoll, armbågen används för att trycka ner sprutkolven, men andra möjligheter alternativ kan användas, t. ex., hjälp från en annan person. - Euthanize fisken med en överdos av trikainmesilat genom att placera fisken i lösningen beredd i steg 1,7. Vänta 30 s och testa reflexer av fisken genom att ta tag i sin stjärtfenan fin med pincett. Fisken kan användas när den har slutat reagera på stimuli.
- Placera fisken i fisk hållaren med buken vänd uppåt och fäst en nål i extremiteten av huvudet och en annan ovanför svansen för att hålla fisken på plats.
- Öppna den främre buken med saxen genom att horisontellt skära det ytliga lagret av huden.
- Med hjälp av pincett, ta bort huden över hjärtat tills en klar till gång till ventrikeln och bulbus arteriosus tillhandahålls (figur 3).
- Tillsätt en glaspipett i änden av kapillär och Bryt spetsen på glas pipetten.
Anmärkning: Hålet i den trasiga spetsen bör vara tillräckligt stor för att låta vätskan ut, men ändå tillräckligt liten för att enkelt komma in i vävnaden. Glaspipetten kan återanvändas om den inte bryts eller blir igensatt. - Ta glaspipetten nära ventrikeln och tillsätt tryck till sprutkolven med armbågen för att tvinga ut vätskan.
- Fäst hjärtventrikeln med glaspipetten samtidigt som du lägger tryck på sprutan.
- Direkt efter, perforera sinus Auktor med pincett att göra det möjligt för blod att lämna cirkulationen.
Anmärkning: Hjärtventrikeln blir bräckligare på grund av fixativ. Det blir också mindre röd som blodet späds med fixative/DiI lösning. - Från ventrikeln, justera vinkeln på glaset pipetten för att hitta ingången till bulbus arteriosus. Ta pipettöppningen inuti bulbus arteriosus som visas i figur 2, och tillsätt mer tryck på sprutan.
Anmärkning: Den bulbus arteriosus är transparent och vävnaden är elastisk. När du byter blod med DiI/fixativ, glaset pipetten inuti hjärtat bör bli mer synlig och genom att lägga till tryck, storleken på bulbus arteriosus bör expandera. Detta steg är avgörande för att se till att tillräckligt tryck har använts för att ersätta alla blod med fixativ/DiI lösning, och att alla blod kärl har nåtts. Ofta när det lyckas, PFA provocerar muskel sammandragningar och fisken kommer att röra sig. - Fortsätt att lägga tryck på sprutan för 30-60 s fortfarande hålla glaset pipetten inuti bulbus arteriosus.
- Ta bort glaspipetten och nålarna från fisken.
- Dissekera hjärnan och hypofysen, och inkubera vävnader i färskt 4% PFA i PBS för 2 h i mörkret vid rums temperatur.
Anmärkning: Dissektion av hjärna och hypofysen har tidigare beskrivits i detalj på två olika sätt av Fontaine et al.26 och Ager-Wick et al.27. På grund av fixering, vävnaden blir ganska hårt och den ömtåliga länken mellan hjärnan och hypofysen kan brytas. Efter dissektion kan efterfixeringsbehandling även utföras över natten vid 4 ° c. - Skölj vävnaden två gånger i PBS i 10 min innan du förbereder för avbildning.
Anmärkning: Vävnaden kan sedan monteras mellan glid och täckslip med distanser i mellan och monterings medium för konfokal avbildning (se figur 4), eller snittas med en vibratome som beskrivs i detalj i Fontaine et al.26 före montering mellan glid-och täckslip för bild tagning med stereomicroskop (se figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll visar en steg för steg förfarande för att märka blod kärlen i medaka hjärnan och hypofysen, och samtidigt fastställa vävnaden. Efter märkning genom hjärt injektion av en fixativ lösning som innehåller DiI i hjärtat, kan blod kärlen observeras på skivor med hjälp av ett fluorescerande stereo mikroskopet (figur 4) eller på hela vävnaden med hjälp av ett konfokal Mikroskop (figur 5). Antingen på den tjocka vävnaden skiva eller på hela vävnaden, kan arkitekturen i blod kärl observeras i tre dimensioner. Vävnads skivor kan märkas för specifika riktade proteiner med standard immunofluorescens protokoll efter slutet av fixeringen, och på transgena linjer där celler av intresse uttrycker fluorescerande reporter proteiner (figur 6). Detta gör det möjligt att utreda interaktioner mellan blod kärl och andra specifika cell typer. Här till exempel, användning av en transgen linje av medaka där grönt fluorescerande protein (GFP)-producerande celler avslöjade placeringen av hypofys LH-celler28. Man kan konstatera att dessa celler skickar förlängningar mot blod kärlen. Vissa blod kärl får inte märkas korrekt om per fusion är suboptimal. Detta kan vara fallet, till exempel om lösningen injiceras i hjärtventrikeln i stället för bulbus arteriosus, eller om du använder för lågt tryck och/eller för kort en period på sprutkolven (figur 7). Slutligen, genom att avbilda samma vävnad med samma avbildnings parametrar, intensiteten av märkningen visades att minska efter fyra dagar, med signalen mer utspridda (figur 8).
Figur 1 : Bilder på hållplattan för per fusion av fisken (a) och insprutnings inställningen (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Schema för medaka fisk hjärta och per fusion system visas med idel placeringen av glasnålen i hjärtat för framgångs rik per fusion. Pilen huvudet visar var att perforera hjärtat att låta blodet att lämna cirkulationen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Bilden av den ventrala sidan av fisken öppnas, med hjärtat utsatt för per fusion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Bild av blod kärl i en bit av hjärnan och hypofysen vävnad från medaka. En vuxen medaka var parfymerad med en fixativ lösning som innehåller DiI. Hjärnan och hypofysen dissekeras och fast över natten. Vävnader var monterade i 3% AGA ros och snittas med en vibratome före avbildning med ett fluorescensmikroskop. Alla blod kärl märkta med DiI ses genom hela avsnittet visar kärl i hjärnan och hypofysen. OT = optisk tectum; Tel = telencephalon; Hyp = hypotalamus; Grop = hypofys; CB = cerebellum; Hind = hindbrain. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : 3D-rendering av en konfokal z-stack från blod kärl i medaka hypofys. En vuxen medaka var parfymerad med en fixativ lösning som innehåller DiI. Brain-hypofys dissekeras och fast över natten. Hypofysen dissekerades från hjärnan och monterade mellan en bild och täckglas med distansörer IB mellan, före avbildning med en konfokal Mikroskop. Z-stack spelades in, och en 3D-rendering gjordes med Fiji program vara och 3D Viewer plugin29. Hela hypofysen blod kärl kan observeras i 3D. RPD = rostralt pars distalis; PPD = proximala pars distalis; PI = pars intermedia. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Z projektion av konfokalmikroskopi z-stack från en vävnad skiva av transgena medaka där lhβ Promotorn kontrollerar uttryck av grönt fluorescerande reporter protein. En vuxen TG (LHB: hrgfpii) medaka var parfymerad med en fixativ lösning som innehåller DiI. Brain-hypofys dissekeras och fast över natten. Vävnader var monterade i 3% AGA ros och snittas med en vibratome. Vissa hormon producerande celler, LH-celler i detta fall, skicka förlängningar (pilhuvuden) mot blod kärlen kan observeras, förmodligen att känna av signaler från blodet och/eller släppa sina hormoner i cirkulationen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Bild av blod kärl i en bit av hjärnan och hypofysen vävnad från dåligt parfymerade medaka. En vuxen medaka var dåligt parfymerad med en fixativ lösning som innehåller DiI genom att injicera lösningen i ventrikeln endast. Brain-hypofys dissekeras och fast över natten. Vävnader var monterade i 3% AGA ros och snittas med en vibratome före avbildning med ett konfokal Mikroskop. Blod kärlen var dåligt märkta med DiI och några av dem var inte märkta alls. OT = optisk tectum; Tel =, telencephalon; Hyp = hypotalamus; Grop = hypofys; CB = cerebellum; Hind = hindbrain. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Tids fördröjning avbildning av märkta blod kärl i medaka hjärna-hypofys vävnad avsnitt. En vuxen medaka var parfymerad med en fixativ lösning som innehåller DiI. Brain-hypofys dissekeras och fast över natten. Vävnader var monterade i 3% AGA ros och snittas med en vibratome före avbildning med ett stereo mikroskopet direkt efter montering (a), och 4 dagar efter montering (B) med samma bild parametrar. Observera att märkningen har minskat och sprids ut med tiden. OT = optisk tectum; Tel = telencephalon; Hyp = hypotalamus; Grop = hypofys; CB = cerebellum; Hind = hindbrain. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjärt per fusion med DiI tidigare har använts för att märka blod kärl i flera modell arter24, inklusive Benfisk fisk13.
Som DiI levereras direkt till endotelceller cell membranet genom per fusion i vasculature, är det möjligt att öka signal-brus-förhållandet genom att öka DiI koncentrationen i fixativ lösning. Dessutom ger fluorophore intensiv färgning när upphetsad med minimal blekning möjliggör relativt långvariga utsläpp18,30. Dessutom kan märkningen finnas kvar i flera dagar och användas i kombination med andra märknings tekniker som kräver milda behandlingar, såsom i immuofluorescence (IF)31.
Men denna teknik har vissa begränsningar. Efter avlägsnande från fixativ lösning, märkning och avbildning av vävnaderna bör utföras så snabbt som möjligt eftersom intensiteten av märkningen kommer att försvaga, och signalen kommer att sprida sig med tiden (figur 8). Denna process kommer att bli ännu snabbare när du använder rengörings medel som ökar porositet av membranet. Dessutom, eftersom PFA är en giftig flyktiga förening, flera försiktighets åtgärder bör vidtas när du utför detta experiment. För att minimera de farliga aspekterna av detta protokoll, kan man parfymera en lösning av DiI och PBS innan dissekera vävnaden av intresse och fixa det med PFA lösningen direkt efter per fusion. Detta kan dock utföras endast för små vävnader, eftersom penetration av PFA i större vävnadsprover kommer att vara mindre effektiva än under per fusion.
Framgången för detta protokoll förbättras genom utbildning, så det förväntas att forskarna kommer att behöva lite tid att bekanta sig med de olika stegen i tekniken. Till exempel är den per fusion av lösningen i bulbus arteriosus ett särskilt kritiskt steg i protokollet och kräver viss utbildning för att uppnå ett bra resultat. Också hålla nålen i rätt läge för tillräckligt länge under per fusion är inte trivialt, och kommer att kräva utbildning av manipulator.
Slutligen, detta protokoll är optimerad för vuxna medaka men det kan användas för andra arter med vissa anpassningar. Olika vävnader av intresse, eller ens olika livs stadier av djuret inom samma vävnad kommer också att kräva optimeringar för koncentrationen av DiI och tiden för per fusion samt det material som används (nål och spruta storlekar till exempel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja
Acknowledgments
Vi tackar Dr Shinji Kanda för demonstration av hjärt per fusion med fixativ lösning i medaka, MS Lourdes Carreon G Tan för hjälp med medaka djur hållning, och Mr Anthony Peltier för illustrationer. Detta arbete finansierades av NMBU och av Norges forsknings råd, stipendium nummer 248828 (Digital Life Norge-programmet).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M.
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magistretti, P. J. Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. Zigmond, M., et al. , Academic Press. 389-413 (1999).
- Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
- Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
- Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
- Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
- Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M.
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).
- Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
- Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
- Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P.
- Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
- Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
- Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).
