Nós apresentamos um método útil para a síntese e a purificação enzimáticas em grande escala de enantiômeros e de regioisômeros específicos dos epóxidos do ácido araquidônico (AA), do ácido docosahexaenóico (DHA), e do ácido eicosapentaenóico (EPA) com o uso de um citocromo bacteriano Enzima P450 (BM3).
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Artigo de método
Síntese enzimática de metabólitos Epoxidizados de ácidos docosahexaenóico, eicosapentaenóico e Aracidônico
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os metabólitos epoxidizados de vários ácidos graxos poli-insaturado (PUFAs), denominados ácidos graxos epóxi, têm uma ampla gama de papéis na fisiologia humana. Estes metabolitos são produzidos endogenamente pela classe de enzimas do citocromo P450. Por causa de seus efeitos biológicos diversos e potentes, há um interesse considerável em estudar estes metabolitos. Determinar as funções únicas destes metabolitos no corpo é uma tarefa difícil, como os ácidos graxos epóxi deve primeiro ser obtido em quantidades significativas e com alta pureza. A obtenção de compostos de fontes naturais é muitas vezes trabalhoso, e Hidrolina de epoxida solúvel (sEH) rapidamente hidrolisar os metabolitos. Por outro lado, a obtenção desses metabólitos por meio de reações químicas é muito ineficiente, devido à dificuldade de obtenção de regioisômeros puros e enantiômeros, baixos rendimentos e purificação extensa (e cara). Aqui, nós apresentamos uma síntese enzimática eficiente de 19 (s), 20 (r)-e 16 (s), 17 (r)-ácidos epoxydocosapentaenoic (edps) de DHA através do epoxidação com BM3, uma enzima CYP450 bacteriana isolada originalmente do bacilo megaterium (que é prontamente expresso em Escherichia coli). A caracterização e a determinação da pureza são realizadas com espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e espectrometria de massas (MS). Este procedimento ilustra os benefícios da síntese enzimática de metabolitos da epoxi de PUFA, e é aplicável à epoxidação de outros ácidos gordos, incluindo o ácido araquidônico (AA) e o ácido eicosapentaenóico (EPA) para produzir o epoxyeicosatrienoic análogo ácidos (Eets) e ácidos ver (EEQS), respectivamente.
Introdução
Como o interesse no papel que os ácidos gordos polyinsaturados (particularmente Omega-3 e Omega-6 ácidos gordos polyinsaturados) jogam na biologia humana cresceu nos últimos anos, os investigadores tomaram a observação da escala larga de benefícios atraentes que seus metabolitos Exposição. Em particular, os metabólitos de ácidos graxos epóxi produzidos pela classe de enzimas do citocromo P450 têm sido um grande ponto de foco. Por exemplo, muitos epoxídeos de PUFA, incluindo ácidos epoxyeicosatrienoic (Eets), ácidos ver (edps) e ácidos ver (EEQS), desempenham um papel crítico na regulação da pressão arterial e inflamação1,2
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Protocolo
Atenção: por favor, consulte todas as fichas de dados de segurança (MSDS) relevantes antes de utilizar os produtos químicos listados.
1. expressão do selvagem-tipo BM3
- Inocular pBS-BM3 transfected DH5α E. coli (uma doação generosa de Dr. F. Ann Walker) em 5 ml de caldo lb estéril com 0,5 mg de ampicilina adicionado em um tubo de cultura de 20 ml.
- Incubar a cultura celular em uma coqueteleira a 37 ° c por 24 h a 200 rpm. Adicione a cultura de partida durante a noite (5 mL) e 100 mg de ampicilina a 1 L de caldo LB estéril em um frasco de Fernbach ou Erlenmeyer. Agitar a 37 ° c por 6 h a 200 rpm, depois a 30 ° c po....
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Resultados
O cromatograma de coluna flash (realizado usando um sistema automatizado de purificação de flash como descrito abaixo) obtido após a purificação da mistura bruta de epoxidação enzimática é mostrado na Figura 1. Após a esterificação e separação dos regioisómeros, foram obtidos 16 (s) puros, 17 (r)-EDP e 19 (s), 20 (r)-ésteres metílicos de EDP. Tipicamente, eles estão presentes em uma proporção aproximada de 1:4 a 1:5, sendo .......
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Discussão
Apresentamos aqui um método operacionalmente simples e econômico para a preparação dos dois metabólitos epoxídicos mais abundantes de DHA-19, 20 e 16,17-EDP. Estes ácidos graxos epóxi podem ser preparados em altamente enantiopure (como seu S, R-isómeros) forma usando selvagem-tipo BM3 enzima. Vários pontos críticos que podem ser usados para solução de problemas, e a extensão do nosso método para a preparação de metabólitos epóxi enantiopure de AA e EPA, são descritos abaixo.
B.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho é financiado por r00 ES024806 (institutos nacionais de saúde), DMS-1761320 (National Science Foundation) e fundos de arranque da Universidade Estadual de Michigan. Os autores desejam agradecer ao Dr. Jun Yang (Universidade da Califórnia em Davis) e Lalitha Karchalla (Michigan State University) para obter assistência com a otimização da reação enzimática, e Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass espectrometria e Metabolomics Facility) para obter assistência com a aquisição de dados da HRMS.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bicarbonato de amônio | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicilina | GoldBio | A30125 | NA |
| Sulfato de magnésio anidro | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Metanol anidro | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Sulfato de sódio anidro | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anidro tolueno | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Ácido Araquidônico (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Sensível ao ar. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (grau de biologia molecular) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Ácido Docosahexaenóico (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Sensível ao ar. |
| EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Ácido Eicosapentaenóico (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Sensível ao ar. |
| Acetato de etila | Sigma | 34858 | NA |
| Cartuchos de coluna Flash 25, 40, 4, tamanhos de 12 g | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternativamente, a cromatografia de coluna convencional pode ser usada |
| ácido fórmico (grau HPLC) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Caldo | Sigma | L3022 | NA |
| Hidróxido de lítio | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Cloreto de magnésio | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Metanol (grau HPLC) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Sal Tetrassódico | Sigma-Aldrich | 481973 | Sensível ao ar. |
| Ácido oxálico | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfectado DH5α E. coli | NA | NA | |
| NA PMSF (fluoreto de fenilmetanossulfonil) | Sigma | P7626 | Tóxico! |
| Permanganato de Potássio | Sigma-Aldrich | 223468 | Para coloração TLC. |
| Fosfato de potássio dibásico | Sigma | 795496 | NA |
| Fosfato de potássio monobásico | Sigma | 795488 | NA |
| Q Resina de fluxo rápido de sepharose (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | Para purificação de troca aniônica da enzima |
| Cloreto de sódio | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahidrofurano, anidro | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazometano (2,0 M em hexanos) | Sigma-Aldrich | 362832 | Muito tóxico. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| strong>Também necessário: | |||
| Sistema automático de purificação de flash (usamos um Buchi Reveleris X2) | Coluna de HPLC Buchi | ||
| C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Centrífuga Agilent | ||
| capaz de 10.000 x g | |||
| Coluna de HPLC quiral (Lux celulose-3), 250 x 4,6 mm, 5 µ M, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| Suprimentos de química geral: um funil separatório de 2 L, béqueres e frascos Erlenmeyer com capacidade de 1000-2000 L, frascos de 20 mL, frascos de HPLC, pequenos frascos de fundo redondo e barras de agitação. | |||
| HPLC (usamos uma bomba analítica Shimadzu Prominence LC-20AT e detector UV-vis SPD-20A | Espectrofotômetro Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Espectrômetro Agilent DD2 (500 MHz) | ||
| Evaporador rotativo | Buchi | ||
| Sonic dismembrator ou homogeneizador ultrassônico | Cole-Parmer |
Referências
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al.
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Reimpressões e permissões
