Artigo de método

Um duplo humanizado BLT-MICE modelo caracterizando um estável humano-como o intestino Microbiome e sistema imunológico humano

DOI:

10.3791/59773

⸱

30 de agosto de 2019

 ,  ,  , 
1Nebraska Center for Virology, 2School of Biological Sciences, University of Nebraska-Lincoln, 3Department of Food Science and Technology, University of Nebraska-Lincoln

Neste artigo

Resumo

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Nós descrevemos um método novo para gerar os BLT-ratos humanizados dobro que caracterizam um sistema imune humano funcional e um microbioma humano-como enxertado estável do intestino. Este protocolo pode ser seguido sem a necessidade para ratos germe-livres ou facilidades gnotobióticos.

Resumo

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Camundongos humanizados (Hu-camundongos) que apresentam um sistema imunológico humano funcional mudaram fundamentalmente o estudo de patógenos e doenças humanas. Podem ser usados para modelar as doenças que são de outra maneira difíceis ou impossíveis de estudar nos seres humanos ou em outros modelos animais. O microbioma intestinal pode ter um profundo impacto na saúde humana e na doença. No entanto, o microbioma do intestino murino é muito diferente do encontrado em humanos.  Há uma necessidade para os modelos pre-clínicos melhorados do Hu-ratos que têm um microbioma humano enxertado do intestino. Conseqüentemente, nós criamos Hu-ratos dobro que caracterizam um sistema imunitário humano e um microbioma humano-como estável do intestino. Aceno. Os camundongos CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG) são um dos melhores animais para a humanização devido ao seu alto nível de imunodeficiência. No entanto, camundongos NSG livres de germes e vários outros modelos de camundongos sem germes importantes não estão atualmente disponíveis comercialmente. Além disso, muitas configurações de pesquisa não têm acesso a instalações gnotobióticas, e trabalhar condições gnotobióticas muitas vezes pode ser caro e demorado. Importante, os ratos germe-livres têm diversas deficiências imunes que existem mesmo depois que o Engraftment dos micróbios. Conseqüentemente, nós desenvolvemos um protocolo que não exija animais germe-livres ou facilidades gnotobióticos. Para gerar ratos Hu-duplos, camundongos NSG foram tratados com radiação antes da cirurgia para criar camundongos de medula óssea, fígado, Thymus-humanizados (Hu-BLT). Os ratos foram tratados então com os antibióticos do espectro largo para esgotar o microbioma murino pre-existing do intestino. Após o tratamento antibiótico, os camundongos receberam transplantes fecais com amostras de doadores humanos saudáveis via gavagem oral. Os ratos dobro do Hu-BLT tiveram perfis originais do gene de 16S rRNA baseados na amostra fornecedora humana individual que foi transplantada. Importante, o microbioma humano-como transplantado era estável nos ratos dobro do Hu-BLT para a duração do estudo até 14,5 semanas após o transplante.

Introdução

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Camundongos humanizados (Hu-camundongos) transformaram o estudo de muitos aspectos da saúde humana e da doença, incluindo hematopoiese, imunidade, câncer, doença auto-imune e doenças infecciosas1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Estes Hu-ratos têm a vantagem distinta sobre outros modelos do rato que têm um sistema imune humano funcional e podem ser contaminados com os micróbios patogénicos específicos humanos. No entanto, a importância do microbioma intestinal tem sido demonstrada pelo seu papel em muitas doenças humanas, como obesidade, síndrome metabólica, doenças inflamatórias e câncer10,11,12, trezeanos. O sistema imunológico da mucosa e o microbioma intestinal são regulados reciprocamente para manter o intestino e a homeostase sistêmica. O sistema imunológico é moldado por antígenos apresentados pelo microbioma intestinal e reciprocamente o sistema imunológico desempenha um importante papel regulador na promoção de bactérias do intestino comensal e eliminando os patógenos14,15, 16. Entretanto, o microbioma do intestino de Hu-ratos não foi caracterizado bem e o microbioma murino do intestino difere substancialmente na composição e na função dos seres humanos17. Isso se deve às diferenças evolutivas, fisiológicas e anatômicas entre o intestino murino e humano, bem como outros fatores importantes, como a dieta, que podem influenciar os resultados experimentais dos modelos de doença de Hu-camundongos18. Conseqüentemente, além da classificação do microbioma murino do intestino de Hu-ratos, um modelo animal que caracteriza um sistema imunitário humano e um microbioma humano do intestino é necessário estudar as interações complexas da doença humana in vivo.

O estudo de doenças humanas diretamente em indivíduos humanos é muitas vezes impraticável ou antiético. Muitos modelos animais não podem ser usados para estudar patógenos humanos como o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). Os modelos de primatas não humanos são geneticamente superados, muito caros e não são suscetíveis a muitos patógenos humanos. Camundongos que foram derivados como germe livre (GF) e reconstituídos com Ademir intestinais semelhantes a humanos têm sido amplamente utilizados para estudar a saúde humana e a doença19,20. No entanto, estes animais não têm um sistema imunológico humano e trabalhar com animais GF requer instalações especializadas, procedimentos e conhecimentos especializados. Portanto, há a necessidade de melhores modelos pré-clínicos para estudar a complexa relação entre o microbioma intestinal e o sistema imunológico humano. Muitas cepas de camundongos, como NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG), não estão disponíveis comercialmente como GF. Os animais GF também podem sofrer de deficiências imunes de longa duração que não são completamente revertidas pelo Engraftment de micróbios21. Conseqüentemente, nós criamos um Hu-ratos dobro que caracterizam um sistema imune humano funcional e um microbioma humano-como estável do intestino circunstâncias específicas do micróbio patogénico livre (SPF). Para gerar ratos Hu-duplos, a cirurgia foi realizada em camundongos NSG para criar ratos de medula óssea, fígado, Timo humanizado (Hu-BLT). Os ratos de Hu-BLT foram tratados então com os antibióticos do espectro largo e deram então transplantações fecais com uma amostra humana saudável do doador. Nós caracterizamos o microbioma bacteriano do intestino de 173 amostras fecais de 45 ratos dobro do Hu-BLT e 4 amostras de doador fecal humanas. Os ratos dobro do Hu-BLT têm os perfis originais do gene de 16S rRNA baseados na amostra fornecedora humana individual que é transplantado. Importante, o microbioma humano-como transplantado era estável nos ratos para a duração do estudo até 14,5 semanas após o transplante. Além, os metagenomas previstos mostraram que os ratos dobro do Hu-BLT têm a capacidade funcional prevista diferente do que Hu-ratos que é mais similar às amostras do doador humano.

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Protocolo

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Todos os métodos aqui descritos foram conduzidos de acordo com os protocolos institucionais de assistência animal e de pesquisa (IACUC) aprovados na Universidade de Nebraska-Lincoln (UNL). O IACUC na UNL aprovou dois protocolos relacionados à geração e utilização de camundongos Hu-BLT, incluindo ratos duplos Hu. Adicionalmente, o Comitê de supervisão de pesquisa científica (SROC) da UNL também aprovou o uso de células-tronco embrionárias humanas e tecidos fetais, que são adquiridos dos recursos avançados de biociência para os estudos de camundongos humanizados (SROC # 2016-1-002).

1. ratos habitação e manutenção

  1. Compra 6-8-Week velhos ratos NSG (NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj).
  2. Abrigar os camundongos condições SPF com troca de ar, pré-filtros e filtros HEPA (0,22 μm) em uma sala com temperatura, umidade e pressão controladas.
    1. Abrigar e manter os camundongos em gaiolas de microisoladores individuais autoclavados em um sistema de rack capaz de gerenciar a troca de ar com pré-filtros e filtros HEPA (0,22 μm).
  3. Realize todos os procedimentos e manipulações dos camundongos em uma capa de fumos de segurança biológica classe II tipo a2 que foi pré-tratada com 70% de etanol. Antes de trabalhar na sala de animais, chuveiro e mudança em esfrega limpa, terno Tyvek, capas de boot, tampa do cabelo, máscara facial, e luvas. Use um vestido de cirurgia sobre o terno Tyvek durante procedimentos cirúrgicos.
    Nota: a descontaminação por luz ultravioleta (UV) também é preferida antes dos procedimentos.
    1. Autoclave todos os instrumentos e reagentes, se possível e depois desinfectar antes de transferir para a capa de fumos.
    2. Durante os procedimentos, remova as gaiolas individualmente ventiladas dos animais do rack e desinfete antes de transferir para a capa de fumaça.
  4. Alimente os ratos uma dieta irradiada e forneça a água autoclavada. Fornecer alimentos irradiados AB libitum e suplemento com alimentos irradiados adicionais, conforme necessário. Mude a água autoclavada semanalmente ou conforme necessário.
    Nota: a água acidificada autoclavada pode igualmente ser usada. A dieta irradiada forneceu um prazo de validade de 6 meses após a manufatura.

2. geração de camundongos BLT humanizados

Nota: a geração de camundongos Hu-BLT tem sido descrita anteriormente22,23,24.

  1. No dia da cirurgia, dê a irradiação do corpo inteiro dos ratos em uma dose de 12 cGy/g do peso corporal.
  2. Prepare os ratos para a cirurgia.
    1. Dê a cada rato irradiado uma mistura de cetamina na concentração de trabalho de 100 mg/kg e xilazina na concentração de 12 mg/kg, que variou de 130-170 μL por rato com base no peso corporal por injeção intraperitoneal (IP) para anestesia. Para preparar 3 ml da mistura de cetamina e xilazina, adicione 0,27 mL de cetamina na concentração de 100 mg/mL e 0, 3 mL de xilazina na concentração de 100 mg/mL a 2,7 mL de soro fisiológico estéril e misture bem. Desinfecte a pele com 70% de isopropanol antes da injecção.
    2. Dê a cada rato irradiado buprenorfina 1 mg/kg de peso corporal (Half-Live 72 h, SR-LAB) por injecção subcutânea para uma gestão da dor de longa duração.
    3. Dê a cada rato irradiado 100 μL (858 μg) de cefazolin por injeção de IP para profilaxia antibiótica pré-operatória.
    4. Raspar o cabelo dos ratos usando cortadores de cabelo elétrico em torno do lado esquerdo lateral e medial do mouse no local cirúrgico mais tarde usado para expor o rim esquerdo.
    5. Verificar o nível adequado de anestesia por pedal Reflex (firme Toe pinch).
    6. Dar gás isoflurano em 3-5% se a anestesia adicional é necessária em qualquer ponto durante a cirurgia.
    7. Aplique a pomada oftálmica a ambos os olhos para impedir o desiccation córneo. Aplique a etiqueta da orelha se necessário.
  3. Realize a cirurgia para implantar os tecidos do fígado e do timo na cápsula renal esquerda.
    1. Desinfecte a pele no local cirúrgico aplicando a esfoliação de iodo a partir do centro do local cirúrgico e movendo-se para o exterior de forma circular. Repita este processo com 70% de isopropanol e uma terceira vez com iodo.
    2. Usando o fórceps, primeiramente carregue um fragmento fetal humano do tecido do fígado em um trocar. Então usando o fórceps, carregue um fragmento fetal humano do tecido do Timo no trocar. Em seguida, usando fórceps, carregar outro fragmento de tecido hepático humano fetal no trocarte. Os tecidos devem ser cortados para 1-1,6 mm3 para caber as dimensões internas do trocarte.
    3. Use fórceps para levantar a pele e usar tesouras para fazer um pequeno corte longitudinalmente. Estender o corte para 1.5-2 cm no lado esquerdo do mouse.
    4. Use fórceps para levantar a camada muscular e usar tesouras para fazer um pequeno corte longitudinalmente. Estenda o corte conforme necessário para expor o rim.
    5. Expor o rim delicadamente agarrando o tecido adiposo em torno do rim. Não toque diretamente no parênquima renal.
    6. Faça uma incisão de 1-2 mm na extremidade posterior da cápsula renal usando um bisturi.
    7. Insira lentamente o trocarte pré-carregado através da incisão paralela ao longo eixo do rim e libere os tecidos entre a cápsula renal e o rim.
    8. Retorne com cuidado o rim e as entranhas a sua posição normal. Use Suturas absorvíveis de 5/0 P-3 (P-13) com a agulha do círculo de 13mm 3/8 para fechar a camada do músculo e grampos cirúrgicos para fechar a pele.
  4. Após a cirurgia, põr o rato em uma gaiola autoclavada limpa do microisolador para a recuperação.
    1. Para minimizar a perda de calor durante a recuperação post-Surgical, põr a gaiola que contem os ratos em uma almofada de aquecimento que seja conectada a uma bomba de água que aqueça e circule a água.
    2. Monitore os ratos até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a recumbência esternal.
  5. Dentro de 6 h da conclusão da cirurgia, através da cauda-veia, injete CD34 + pilhas de haste hematopoietic isoladas do tecido fetal humano do fígado.
    1. Aqueça os ratos com uma lâmpada de calor. Desinfecte a cauda com 70% de isopropanol e, em seguida, injectar 1,5 a 5 × 105 células estaminais/200 μl na veia da cauda.
    2. Pare qualquer sangramento da injeção e retorne os camundongos para a gaiola do microisolador e a gaiola do microisolador para o rack de gaiola.
      Nota: os camundongos pós-cirurgia são tipicamente alojados em conjunto, cinco por gaiola de microisolador, durante e após a recuperação. Entretanto, os ratos são alojados somente junto se todos receberam a cirurgia no mesmo dia.
  6. Verifique os ratos diariamente. Monitore cuidadosamente os grampos cirúrgicos e substitua-os conforme necessário. Monitore atentamente os camundongos para qualquer sinal de infecção ou desconforto. Forneça o alimento autoclavado no assoalho da gaiola do microisolador por alguns dias após a cirurgia.
  7. Retire os grampos cirúrgicos 7-10 dias após a cirurgia. Dar gás isoflurano em 3-5% para anestesiizar os camundongos. Retire cuidadosamente os grampos e aplique pomada antibiótica e alívio de dor no local.
  8. Permita 9-12 semanas para a reconstituição de pilhas imunes humanas, a seguir colete o sangue periférico da veia safena medial de cada um dos ratos humanizados.
    1. Contenha ratos conscientes usando uma contenção de cone de plástico apropriadamente dimensionada com uma abertura perto da cabeça do mouse para respirar e uma abertura perto da parte de trás do mouse para isolar uma perna. Coloque os ratos na cabeça do cone de contenção primeiro e, em seguida, puxe suavemente uma perna através da abertura da perna.
    2. Pulverize o lado medial do pé isolado com o isopropanol 70%, a seguir espalhe o antibiótico e a dor-aliviando a pomada no mesmo local.
      Nota: a pomada ajuda a revelar a localização da veia sem a necessidade de depilação e também auxilia na formação de gotas de sangue.
    3. Usando uma agulha de calibre 25 em um ângulo de 90 °, perfure a veia e colete 50-100 μL do sangue usando um tubo revestido EDTA da coleção do sangue. Pare o sangramento aplicando a pressão ao local com gaze estéril. Uma vez que o sangramento parou, retorne os ratos a sua gaiola.
      Nota: os volumes sanguíneos máximos recolhidos são tipicamente 50 μL por semana ou 100 μL a cada duas semanas.
    4. Use o sangue periférico coletado para testar o nível de reconstituição de células imunes humanas usando citometria de fluxo com anticorpos para hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.

3. tratamento antibiótico

  1. Antes do tratamento com antibióticos, colete amostras fecais pré-tratamento. Mova os ratos para uma nova gaiola de microisolador autoclavado.
  2. Prepare um coquetel fresco de antibióticos de largo espectro diariamente.
    1. Prepare 250 mL de água contendo metronidazol preparado na hora (1 g/L), neomicina (1 g/L), vancomicina (0,5 g/L) e ampicilina (1 g/L) para cada gaiola microisoladora de camundongos.
      Nota: Use água esterilizada ou estéril para o antibiótico suplementado água potável.
    2. Adicionar 9,2 g de açúcar de uva mistura de bebida adoçado a 250 mL de água suplementada com antibióticos.
      Nota: o uso de açúcar de uva adoçado mistura de bebidas máscaras o sabor amargo dos antibióticos e ajuda a prevenir a desidratação nos ratos.
    3. Mude o antibiótico e açúcar de uva adoçado Mix bebida suplementada água e colocar os ratos em uma nova gaiola autoclavada diariamente.
      Nota: camundongos são café e mudando as gaiolas diariamente impede que os camundongos de re-inocular-se com as bactérias do intestino.
    4. Para o Engraftment máximo do micróbio humano-como do intestino, forneça antibióticos por 14 dias. Durante o tratamento com antibióticos, monitore os camundongos para perda de peso e desidratação. A perda de peso é esperada durante os primeiros 3-4 dias e planaltos depois que para a duração do tratamento. Se a desidratação ocorrer, dê aos ratos solução salina ou de Ringers através da injeção intraperitoneal.
      Nota: outros protocolos do humanização do microbioma do intestino chamam para o gavagem oral dos antibióticos. Quando eficaz em esgotar as bactérias murino do intestino, nós encontramos que o método menos invasor de adicionar antibióticos à água bebendo põr menos esforço sobre nossos ratos humanizados e conduzido aos melhores resultados.

4. amostras de doadores e transplante fecal

  1. Prepare amostras fecais de doadores humanos.
    1. Use fontes adequadamente preparadas de material de transplante de microbiota fecal (FMT) para transplante fecal nos camundongos humanizados.
    2. Thaw FMT preparações e alíquotas-los em condições anaeróbias em uma câmara anaeróbia.
    3. Se desejado, nesta etapa misture partes iguais das amostras fecais juntas para criar uma amostra "humana" imparcial.
    4. Mantenha o congelamento e descongelamento do material de fmt a um mínimo, se alicitando ou misturar de amostras não é necessário, apenas descongelar imediatamente antes do procedimento.
  2. Transplante fecal humano
    1. Após a conclusão do tratamento antibiótico de 14 dias, mude a água bebendo à água autoclavada e mova os ratos em uma gaiola autoclavada nova. Pare as mudanças diárias da gaiola e implemente uma vez cada calendário de mudança da gaiola de 1-2 semanas.
    2. Dê dois transplantes fecais em 24 e 48 h pós-cessação de antibióticos.
    3. 24 h após o tratamento dos antibióticos, descongelar a quantidade necessária de material de FMT, dê a cada rato 200 μL de material de FMT através da gavagem oral. Repita o procedimento novamente em 48 h pós antibióticos.
    4. Espalhe todo o material FMT descongelado remanescente ou restante na pele dos ratos humanizados ou na cama da gaiola.

5. coleta fecal fresca da amostra

  1. Autoclave sacos de papel individuais antes de transferir para a capa de fumos.
  2. Na capa das emanações, põr um rato em cada saco de papel individual e permita que o rato defecate.
  3. Usando fórceps estéril, colete a amostra fecal em 1,5 mL de tubos plásticos e congele a-80 ° c. Devolva os ratos às gaiolas do microisolador.
    Nota: Este método de coleta de amostras fecais permite a coleta de amostra fecal fresca de camundongos individuais sem qualquer estresse induzindo manipulações.

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Resultados

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A Figura 1 mostra um contorno dos métodos usados para criar camundongos Double Hu-BLT e descreve brevemente o processo de adição de um sistema imunológico humano funcional e um microbioma intestinal estável, semelhante ao humano, aos camundongos NSG. A Figura 2 mostra um exemplo de análise de citometria de fluxo de sangue periférico de um blt-mouse humanizado 10 semanas após a cirurgia. A Figura 3 mostra a abundância relativa das am...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo descrito aqui é para a criação de ratos dobro do Hu-BLT que caracterizam um sistema imunitário humano funcional e um microbioma humano-como estável do intestino. Este protocolo pode ser adaptado a outros modelos de camundongos humanizados ou não humanizados sem a necessidade de animais GF e instalações gnotobióticas. Embora os métodos descritos aqui sejam relativamente simples, existem vários detalhes críticos que são importantes para a criação bem-sucedida de camundongos Double Hu-BLT. Os camundongos NSG são...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer a Yanmin Wan, Guobin Kang e Pallabi Kundu por sua ajuda na geração de camundongos humanizados por BLT. Gostaríamos de reconhecer a UNMC Genomics Core Facility que recebe apoio parcial da rede de pesquisa Nebraska em genômica funcional NE-INBRE P20GM103427-14, a biologia molecular dos sistemas Neurosensoriais CoBRE P30GM110768, o Fred & Pamela Centro do cancer de Buffett-P30CA036727, o centro para a inovação da raiz e do Rhizobiome (CRRI) 36-5150-2085-20, e a iniciativa da pesquisa de Nebraska. Gostaríamos de agradecer à Universidade de Nebraska-Lincoln Life Sciences anexo e seus funcionários para a sua assistência. Este estudo é apoiado em parte pelos institutos nacionais de saúde (NIH) concede R01AI124804, R21AI122377-01, p30 MH062261-16A1 infecção por HIV crônica e envelhecimento em neuroaids (cadeia) centro, 1R01AI111862 para Q li.  Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, preparação do manuscrito ou decisão de publicação.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulhas de Alimentação Animal 18GCadence Science9928B
Clidox-s ActivatorPharmacal Research Laboratories95120F
Clidox-s BasePharmacal Research Laboratories96125F
DGM 108 rack de gaiolaSaco de Compras Techniplast
Flat Brown 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L Grainger12R063
FMT Upper Delivery Microbiota Preparations OpenBiomeFMP30
Uva Kool-AidKraft Foods Inc.
hCD19-PE/Cy5Biolegend302209
hCD3-PEBiolegend300408
hCD4-Alexa 700Biolegend300526
hCD45-FITCBiolegend304006
hCD8-APC/Cy7Biolegend301016
Solução de Ringer Tamponada com LactatoBoston BioProducts Inc PY-906-500
mCD45-APCBiolegend103111
Microvette 100 K3EMicrovette20.1278.100
Neosporina Primeiros Socorros Antibiótico/Pomada Alívio da DorNeosporina
Camundongos NSG (NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)The Jackson Laboratory005557
PrecisionGlide 25 G AgulhaBD305127
RS200 Irradiador de raios-XRAD Source Technologies
Sealsafe Plus GM500 gaiolas microisolatadorasTechniplast
Gaze não tecida estérilFisherbrand22-028-558
Ração de rato irradiada com 16% de proteína global TekladTeklad2916

Referências

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