Artigo de método

Gravações electrofisiológicas de correntes do íon da único-pilha o esforço de tesoura bem definido

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DOI:

10.3791/59776

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2 de agosto de 2019

 , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary, Critical Care, Sleep and Allergy, University of Illinois at Chicago

Neste artigo

Resumo

O objetivo deste protocolo é descrever uma câmara de fluxo de placa paralela modificada para uso na investigação da ativação em tempo real de canais de íons mecanosensíveis por tensão de cisalhamento.

Resumo

O stress de cisalhamento fluido é bem conhecido por desempenhar um papel importante na função endotelial. Na maioria das camas vasculares, o estresse de cisalhamento elevado de aumentos agudos no fluxo sanguíneo desencadeia uma cascata de sinalização resultando em vasodilatação, aliviando assim o estresse mecânico na parede vascular. O padrão de estresse de cisalhamento também é bem conhecido por ser um fator crítico no desenvolvimento da aterosclerose com estresse de cisalhamento laminar sendo aterogênico e perturbado o estresse de cisalhamento sendo pró-aterogénico. Quando nós tivermos uma compreensão detalhada das várias vias intermediárias da sinalização da pilha, os receptores que traduzem primeiramente o estímulo mecânico em mediadores químicos não são compreendidos completamente. Os canais de íons mecanosensíveis são fundamentais para a resposta ao cisalhamento e regulam a sinalização celular induzida por cisalhamento, controlando assim a produção de mediadores vasoativos. Esses canais estão entre os primeiros componentes de sinalização ativados para cisalhamento e foram vinculados à vasodilatação induzida por cisalhamento por meio da promoção da produção de óxido nítrico (por exemplo, retificando internamente K+ [Kir] e potencial de receptor transitório [TRP] canais) e fator de hiperpolarização do endotélio (por exemplo, canais Kir e K+ [KCA] ativados por cálcio) e vasoconstrição induzida por cisalhamento por meio de um mecanismo indeterminado que envolve canais piezo. Compreender o mecanismo biofísico pelo qual esses canais são ativados por forças de cisalhamento (ou seja, diretamente ou através de um Mecano-receptor primário) poderia fornecer potenciais novos alvos para resolver a fisiopatologia associada à disfunção endotelial e aterogênese. Ainda é um grande desafio para registrar a ativação induzida por fluxo de canais iônicos em tempo real usando eletrofisiologia. Os métodos padrão para expor as células à tensão de cisalhamento bem definida, como o Reômetro de cone e placa e a câmara de fluxo de placa paralela fechada, não permitem o estudo em tempo real da ativação do canal iônico. O objetivo deste protocolo é descrever uma câmara de fluxo de placa paralela modificada que permita a gravação eletrofisiológica em tempo real de canais de íons mecanosensíveis estresse de cisalhamento bem definido.

Introdução

As forças hemodinâmicas geradas pelo fluxo sanguíneo são bem conhecidas por desempenhar papéis importantes na função endotelial e vascular1,2. É sabido igualmente que diversos tipos de canaletas do íon respondem agudamente às mudanças no esforço de tesoura3,4,5 que conduzem à hipótese que os canais de íon podem ser sensores preliminares do esforço de tesoura. Mais recentemente, nós e outros mostramos que os canais iônicos mecanosensíveis desempenham papéis críticos em várias funções vasculares sensíveis ao cisalhamento-stress, incluindo a resposta vasoativa ao estresse de cisalhamento6,7,8 e angiogênese do desenvolvimento9. Os mecanismos da sensibilidade do cisalhamento-stress de canaletas do íon, entretanto, são quase totalmente desconhecidos. Esta lacuna de conhecimento é susceptível de ser devido à dificuldade técnica de realizar gravações eletrofisiológicas estresse de cisalhamento bem definido. Neste artigo, portanto, fornecemos um protocolo detalhado passo a passo rotineiramente realizado em nosso laboratório para atingir esse objetivo6,7,10,11.

O objetivo geral deste método é permitir a investigação em tempo real da mecanoativação do canal iônico estresse de cisalhamento bem definido na faixa fisiológica. Isto é conseguido modificando uma câmara paralela padrão do fluxo da placa para permitir que uma pipeta eletrofisiológicos seja abaixada na câmara e as pilhas do acesso crescidas na placa inferior durante a exposição do tempo real ao fluxo, fornecendo uma aproximação original para conseguir este objetivo6,7,11. Em contrapartida, as câmaras de fluxo de placas paralelas padrão, descritas em publicações anteriores, podem ser utilizadas para a análise de imagens em tempo real de células expostas a forças de cisalhamento12 ou outras abordagens não invasivas13,14, mas não para Eletrofisiologia. Similarmente, o cone e o instrumento da placa, uma outra aproximação poderosa para expor pilhas ao esforço de cisalhamento15,16 não são igualmente apropriados para gravações electrofisiológicas. Assim, estes dispositivos de fluxo não permitem a investigação da sensibilidade de tensão de cisalhamento de canais iônicos. A dificuldade em realizar gravações eletrofisiológicas fluxo é a principal razão para a escassez de informações sobre os mecanismos responsáveis por esses efeitos cruciais.

Em termos das abordagens alternativas para atingir o mesmo objetivo, não há nenhum que são tão precisos ou controlados. Alguns estudos anteriores tentaram registrar a atividade do canal iônico fluxo, expondo as células a um fluxo de líquido proveniente de outra pipeta trazida para a vizinhança de uma célula de acima de17,18. Isto é altamente não-fisiológico, como as forças mecânicas geradas nestas condições têm pouco em comum com os perfis fisiológicos de tensão de cisalhamento nos vasos sanguíneos. As preocupações similares aplicam-se às tentativas de simular o stress fisiológico da tesoura pela perfusão de câmaras abertas. Como discutido em detalhe em nosso estudo mais adiantado10, uma relação aberta do líquido-ar cria distúrbios e recirculação múltiplos, que são não-physiological. Para endereçar todas estas preocupações, nós projetamos uma câmara paralela modificada do fluxo da placa (MPP), igualmente referida como o "dispositivo minimamente invasor do fluxo" em nossos estudos mais adiantados6,7,10,11, feitos de acrílico e amplamente utilizado em nosso laboratório. No entanto, apesar do fato de que a descrição original do projeto foi publicada há quase 20 anos e é o único dispositivo de fluxo que permite a realização de gravações eletrofisiológicas estresse de cisalhamento bem definido, esta metodologia não foi adotados por outros laboratórios e há poucos estudos que tentam registrar correntes fluxo. Acreditamos, portanto, que fornecer uma descrição detalhada para o uso da câmara de fluxo MPP será de grande ajuda para pesquisas que estão interessadas em canais iônicos mecanosensíveis e biologia vascular.

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Protocolo

O uso de animais em nossos estudos é aprovado pela Universidade de Illinois no Comitê de cuidados de animais de Chicago (#16-183).

1. montagem da câmara de fluxo de placa paralela modificada

Nota: Refira por favor a tabela 1 e a Figura 1 para IDs da parte da câmara de fluxo MPP. Por favor, consulte a Figura 1 para um esquemático detalhando a orientação de peças de câmara para montagem.

  1. Para aderir ao vidro de cobertura retangular, peça D, à parte inferior da peça C, primeiro faça a solução de elastômero de silicone misturando completamente 500 μL de agente de cura de elastômero de silicone em 5 mL de base de elastômero de silicone.
  2. Aplique uma camada fina da solução de elastômero de silicone ao redor das bordas do espaço retangular da peça C e Coloque suavemente a peça de vidro de cobertura retangular D diretamente na solução de elastômero, de forma que a peça D cubra completamente o espaço retangular aberto da peça C. Limpe cuidadosamente o excesso de solução de elastômero de silicone.
  3. Repita o passo 1,2 para aderir ao vidro de cobertura retangular, peça F, à parte inferior da peça e e permita que a solução de elastômero de silicone Cure durante a noite à temperatura ambiente.
    Nota: Uma vez curado, o vidro de cobertura retangular permanecerá aderido por até seis meses antes de precisar ser substituído.
  4. Começando com a parte inferior da câmara, peça E, montar a câmara de fluxo MPP, colocando sequencialmente cada peça em cima do anterior na seguinte ordem: peça E (parte inferior), peça C, peça B, peça A (parte superior).
  5. Alinhe os furos do parafuso de cada parte nos cantos e parafuse firmemente as partes junto para impedir que os escapes ocorram ao administrar o fluxo à câmara de fluxo MPP.

2. preparação de células e semeadura na câmara de fluxo MPP

Nota: Siga os passos 2.1 − 2.7 para as células endoteliais cultivadas. Siga o método detalhado nas etapas 2.8 − 2.14 para isolar pilhas endothelial da arcada arterial mesentérica do rato e da preparação de pilhas endothelial recentemente isoladas.

  1. Em uma placa de 6 poços, coloque quatro a 5 12 mm cobrem círculos de vidro/poço e células de semente entre 10% e 30% de confluência, de modo que as células individuais possam ser acessadas para gravações eletrofisiológicas.
  2. Incubar células condições de cultivo padrão (5% CO2, 37 ° c) para não menos de 2 h para permitir que as células aderem e não mais do que 24 h como células endoteliais na experiência dos autores tornam-se muito plana e difícil de remendo quando semeadas em subconfluência para mais de 24 H.
  3. Retire um vidro de cobertura contendo células aderiram de um poço da placa de 6 poços, enxague rapidamente em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e transfira para um prato de Petri de 35 mm contendo 2 mL de solução de banho electrofisiológico (tabela 2) antes da transferência para o fluxo MPP Câmara.
  4. Transfira o círculo de vidro da tampa ao vidro retangular da tampa, parte D, que é aderido à parte C da câmara de fluxo de MPP que está sendo certa que a solução adequada permanece no vidro da tampa de modo que as pilhas não fiquem expostas ao ar. Adicione a solução desejada do banho (~ 250 μL) às pilhas de modo que o círculo e as pilhas de vidro da tampa estejam submergidos completamente na solução.
  5. Posicione o círculo de vidro de cobertura de modo que repouse na metade mais próxima do lado do reservatório de vácuo para que as células estejam de acordo com as aberturas de fenda da peça B. Assegure-se de que o círculo de cobertura de vidro adere à peça D através da adesão de vidro de solução para que a aplicação de o fluxo para a câmara não interrompe a posição do círculo de vidro da tampa.
  6. Monte a câmara de fluxo MPP parafusando as peças juntas na ordem apropriada, conforme descrito nas etapas 1,4 e 1,5 e conforme mostrado na Figura 1. Transfira a câmara para o estágio do microscópio e perfuse imediatamente a câmara com a solução do banho tal que a solução alcança o reservatório do vácuo para a aspiração (~ 10 mL).
  7. Identifique uma célula saudável para o experimento identificando uma célula com uma borda escura e um núcleo óbvio. Evite células que parecem ser blebbing ou células que estão em contato com outras células.
    Nota: No laboratório dos autores, as pilhas endothelial aórticas humanas e as pilhas endothelial mesentérica do rato preliminar na cultura são usadas. No entanto, qualquer outro tipo de célula aderente que seja de interesse para necessidades específicas de pesquisa pode ser usado da mesma forma.
  8. Lave a arcada arterial isolada em solução de dissociação (tabela 2). Transfira o arcade para um tubo de centrífuga de 2 mL contendo 2 mL de solução de dissociação pré-aquecida (37 ° c) (receita para solução de dissociação mostrada na tabela 2) contendo protease neutra (0,5 mg/ml) e elastase (0,5 mg/ml). Incubar por 1 h a 37 ° c com agitação suave a cada 10 min.
  9. Retire 1 mL da solução neutra de dissociação da protease/elastase e adicione 1 mg/mL de colagenase tipo 1. Devolva a solução de colagenase para a solução que contém as artérias para uma concentração final do tipo 1 de colagenase de 0,5 mg/mL. Incubar por 2 − 3 min a 37 ° c.
  10. Usando pinças de 5 graus, mova rapidamente o arcade para um prato de Petri de 35 mm de diâmetro contendo uma gota de 750 μL de solução de dissociação fresca e refrigerada. Dissociar ainda mais o tecido usando agulhas de seringa de 2 20 G para liberar mecanicamente as células endoteliais das artérias digeridas enzimaticamente.
  11. Usando um 9 "Pipet de vidro Pasteur descartável, triturar a solução de célula 10x antes de transferir as células para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL usando o Pipet de vidro.
  12. Lave o prato de Petri com outro 750 μL de solução de dissociação e transfira para o mesmo tubo. Usando a pipeta de vidro, dispersar mais mecanicamente as pilhas pipetando pelo menos 10x para criar uma única suspensão da pilha que tem cuidado para não introduzir as bolhas que podem danificar a integridade endothelial da pilha.
  13. Adicionar 750 μL da suspensão da célula endotelial (~ 500 − 1000 células) diretamente à parte D da câmara de fluxo MPP na metade mais próxima do lado do vácuo do reservatório. Permitir que as células endoteliais aderir entre 45 min e 1 h à temperatura ambiente.
  14. Monte a câmara de fluxo MPP parafusando as peças juntas na ordem apropriada, conforme descrito nas etapas 1,4 e 1,5 e conforme mostrado na Figura 1. Transfira a câmara para o estágio do microscópio e perfuse imediatamente a câmara com a solução do banho tal que a solução alcança a aspiração do vácuo (~ 10 mL). Identificar células endoteliais acessíveis pelo seu fenótipo áspero e redondo19,20.
    Nota: Uma variedade de métodos de digestão e coquetéis enzimáticos têm sido usados para isolar células endoteliais de diferentes leitos arteriais. Veja a tabela 3 para descrições detalhadas dos protocolos que foram usados por uma variedade de investigadores para isolar pilhas endothelial para a electrofisiologia da braçadeira de remendo de canaletas de íon mechanosensitive. Estes métodos são prováveis apropriados para o uso em combinação com a câmara de fluxo MPP.

3. controlando a tensão de cisalhamento para a câmara de fluxo MPP para gravações eletrofisiológicas de canais de íons Mecanosensíveis de cisalhamento ativados

  1. Ajuste um sistema da perfusão da gravidade conectando um cilindro graduado da seringa de 30 mL a um fechamento do luer de 3 vias cabido com a tubulação do Microbore (diâmetro interno: 0, 5 polegadas, diâmetro exterior: 0, 9 polegadas) serido para a inserção no furo de entrada do diâmetro de 3 milímetros da parte a do MPP Câmara.
  2. Prenda o cilindro graduado à face exterior da gaiola de Faraday que circunda o equipamento da electrofisiologia (Figura 2) usando a fita frente e verso. Antes de inserir o tubo na câmara MPP, pré-encha a seringa e a tubagem com solução de banho (ver tabela 2 para solução de banho utilizada para investigar internamente retificando canais K+ em células endoteliais). Insira o tubo no orifício de entrada da câmara de fluxo MPP da peça A.
  3. Pré-encha a câmara de fluxo MPP com solução de tal forma que a solução está a ser removida no reservatório de vácuo. Parar o fluxo para a câmara e encher o cilindro graduado para a marca superior. Calcule as taxas de fluxo manualmente permitindo que a solução flua através da câmara e usando um batente-relógio para calcular mL/s em uma determinada altura do cilindro da seringa.
  4. Levante ou abaixe a seringa para alterar o fluxo e, assim, corte na câmara, e continuar este processo até que um nível desejado de tensão de cisalhamento é encontrado.
  5. Calcule a tensão de cisalhamento em uma câmara paralela usando a seguinte equação21:
    τ = 6μQ/h2w
    onde μ = viscosidade do fluido (g/cm · s), Q = vazão (mL/s), e largura da câmara da placa paralela (w = 2,2 cm) e altura (h = 0,1 cm).
    Nota: No sistema atual da perfusão da gravidade, em uma altura do cilindro da seringa (como medido da parte superior do cilindro) de 57 cm acima da fase do microscópio, a taxa de fluxo é 0,3 mL/s. A tesoura calculada na câmara nesta seringa altura do cilindro e vazão é 0,7 dyn/cm2. Deve-se notar também que outros sistemas de perfusão, como uma bomba peristáltica, podem ser usados para controlar o fluxo para a câmara de fluxo MPP. No entanto, esses dispositivos podem adicionar turbulência indesejada e influenciar a estabilidade das medições de eletrofisiologia fluxo, portanto, o uso do sistema de perfusão por gravidade descrito aqui é recomendado.
  6. Transfira uma câmara montada contendo células aderidas ao estágio do microscópio do equipamento da electrofisiologia e introduza a tubulação pre-enchida com a solução do banho no furo da parte a. Encha simultaneamente a câmara e lave as células com 10 mL de solução de banho girando o bloqueio Luer 3-Way tal que a solução flui para a câmara.
  7. Uma vez que a configuração desejada do remendo é obtida com sucesso permita que as correntes de canaleta estabilizem em um banho estático na temperatura ambiente. Uma vez que as correntes estabilizaram, aplique a tesoura em uma forma passo-sábia permitindo aumentos na corrente estabilizar antes do aumento seguinte da etapa no esforço de cisalhamento.
    Nota: Os autores encontram o mais sucesso com a configuração perfurada do remendo ao estudar canais de íon mechanoactivated em pilhas endothelial. Para executar as configurações perfuradas do remendo da inteiro-pilha, adicione 5 μL de uma anfotericina B do estoque de 60 mg/ml no sulfóxido de dimetil (DMSO) a 1 ml da solução filtrada estéril da pipeta de 0,2 μm. Após ter gerando um selo do giga-ohm na configuração Cell-Attached, os remendos perfurados da inteiro-pilha dão forma dentro de 2 − 5 minutos.
  8. Remova a exposição da tesoura às pilhas parando o fluxo à câmara permitindo correntes mecanosensitive do canal de retornar às correntes da linha de base observadas no banho estático.
  9. Isole correntes de canal de íons mecanosensíveis de interesse alterando a solução de Valência (por exemplo, 60 mM K+ em solução de banho com 0 CA2 + em solução de pipeta para estudar internamente retificando canais K +. A tabela 2 mostra exemplos de receitas de soluções) e/ou inibição farmacológica de fontes de corrente potencialmente contaminantes.

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Resultados

Várias fotografias que mostram diferentes pontos de vista da câmara de fluxo MPP no estágio do microscópio (painel superior) e uma representação esquemática da câmara de fluxo MPP (painel inferior) são mostradas na Figura 1. O esquemático detalha as dimensões de todo o dispositivo e a câmara de fluxo. A Figura 2 mostra uma fotografia do sistema de perfusão por gravidade para a câmara de fluxo MPP em nosso laboratório (painel supe...

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Discussão

O sistema vascular está constantemente exposto a forças hemodinâmicas ativas, que ativam os canais deíons mecanosensíveis,22 mas os papéis fisiológicos desses canais na mecanotransdução induzida por estresse de cisalhamento são apenas começando a emergir4,6,8. Os mecanismos responsáveis pela mecanosensibilidade dos canais ativados por estresse de cisalhamento permanecem ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do coração, pulmão e sangue (R01 HL073965, IL) e (T32 HL007829-24, ISF). Os autores também gostariam de reconhecer a oficina de máquinas científicas na Universidade de Illinois, em Chicago, por gerar nossas mais recentes câmaras de fluxo MPP.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,2 µ m filtros de seringa estéreisVWR28145-501Usado para filtrar solução de pipeta eletrofisiológica
5 graus fórcepsFine Scientific Tools1252-30Usado para transferir artérias digeridas para solução fresca
9" Pasteur PipetFisher Scientifc13-678-20DUsado para interromper mecanicamente artérias digeridas e transferir células endohteliais recém-isoladas 
12 mm de diâmetro Círculos de vidro de coberturaFisher Scientifc12-545-80Para uso com estudos envolvendo células cultivadas e múltiplos tratamentos. As células aderidas ao vidro de cobertura são usadas para análises de patch clamp
24 mm x 40 mm Vidro de cobertura reto-colarSigma-AldrichCLS2975224Vidro de cobertura a ser adicionado às peças da câmara de fluxo MPP C (Figura 1)
24 mm x 50 mm Vidro de cobertura retangularSigma-AldrichCLS2975245Vidro de cobertura a ser adicionado à câmara de fluxo MPP E (Figura 1)
Agulhas de seringa de 20 GBecton Dickinson and Co305175Para uso em ruptura mecânica de artérias mesentéricas digeridas
Placa de Petri de 35 mmGenesee Scientific32-103Para uso em ruptura mecânica de artérias mesentéricas digeridas
Anfotericina B solubilizadaSigma-AldrichA9528-50MGUsado para gerar a configuração de patch de célula inteira perfurada.
Colagenase, tipo IWorthington Biochemical100 mg - LS004194Enzima usada em nosso laboratório como uma breve digestão após o coquetel inicial de protease neutra e elastase
Dimetil Sulfóxido (DMSO)Fisher Scientifc67-68-5Solvente para Anfotericina B usado em patch clamp de células inteiras perfuradas
Elastase, liofilizadaWorthington Biochemical25 mg - LS002290 Enzima utilizada em nosso laboratório em coquetel com protease/dispase neutra para iniciar a digestão das artérias para isolamento das células endoteliais.
Placa de Cultura de Tecidos Falcon, 6 poços, Fundo Plano com Tampa de Baixa Evaporação Corning 353046Para uso com estudos envolvendo células cultivadas e múltiplos tratamentos
Protease/dispaseneutra Worthington Biochemical10 mg- LS02100 50 mg - LS02104Enzima usada em nosso laboratório em um coquetel com elastase para iniciar a digestão das artérias para isolamento de células endoteliais
SylGard World Precision InstrumentsSYLG184Elastômero de silicone para aderir a lamínula retangular às peças C e E da câmara de fluxo MPP (Figura 1)
Tubulação Tygon ND 10-80Tubulação MicroboreAAQ04133: 0,05 pol., OD: 0,09 pol., tubulação de perfusão de entrada para administração do fluxo para a câmara
, ID

Referências

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