Artigo de método

Medindo a orientação e a motilidade do esperma dentro do intervalo reprodutivo hermafrodita dos elegans de Caenorhabditis

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DOI:

10.3791/59783

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6 de junho de 2019

 ,  , 
1Department of Cell, Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

Neste artigo

Resumo

O esperma deve navegar com sucesso através do oviduto para fertilizar um oócito. Aqui, nós descrevemos um ensaio para medir a migração do esperma dentro do útero hermafrodita de C. elegans . Este ensaio pode fornecer dados quantitativos sobre a distribuição de espermatozóides dentro do útero após o acasalamento, bem como na velocidade, rotação direcional e frequência de reversão.

Resumo

A fecundação bem sucedida é fundamental à reprodução sexual, contudo pouco se sabe sobre os mecanismos que guiam o esperma aos oócitos dentro do intervalo reprodutivo fêmea. Enquanto estudos in vitro sugerem que o esperma de animais internamente fertilizar pode responder a várias pistas de seu entorno, a incapacidade de visualizar seu comportamento dentro do trato reprodutivo feminino cria um desafio para a compreensão da migração de espermatozóides e mobilidade em seu ambiente nativo. Aqui, descrevemos um método usando C. elegans que supera essa limitação e aproveita sua epiderme transparente. C. elegans machos manchados com uma tintura mitocondrial são acasaladas com hermafroditas adultos, que atuam como fêmeas modificadas, e depositam o esperma rotulado cDNAs no útero hermafrodita. A migração e a motilidade do esperma etiquetado podem então diretamente ser controladas usando um microscópio da EPI-fluorescência em um Hermaphrodite vivo. No selvagem-tipo animais, aproximadamente 90% do sperm etiquetado rastejam através do útero e alcangam o local da fertilização, ou o spermatheca. As imagens do útero podem ser tomadas 1 h após o acasalamento para avaliar a distribuição do espermatozóide dentro do útero e a percentagem de espermatozóides que atingiram a spermatheca. Alternativamente, as imagens do lapso de tempo podem ser tomadas imediatamente depois do acoplamento para avaliar a velocidade do esperma, a velocidade direcional e a freqüência da reversão. Este método pode ser combinado com outras ferramentas genéticas e moleculares disponíveis para o C. elegans para identificar novos mecanismos genéticos e moleculares que são importantes na regulação do esperma orientação e motilidade dentro do trato reprodutivo feminino.

Introdução

Os mecanismos moleculares pelos quais os espermatozóides (referidos como espermatozóides) navegam pelo trato reprodutivo feminino em direção ao oócito não são bem compreendidos, mas são fundamentais para a reprodução sexual. A motilidade espermática é altamente dinâmica e depende de sinais de comunicação robustos que alteram a velocidade do espermatozóide e a motilidade direcional1,2,3,4,5,6 , 7 anos de , 8 . º , 9 anos de , 10 de , 11 anos de , 12. C. elegans tornou-se um modelo poderoso para estudar o movimento de espermatozóides in vivo porque a epiderme transparente de hermafrodita permite o rastreamento de espermatozóides vivos na resolução de célula única2,3, 8,10. A finalidade deste papel é fornecer métodos para avaliar o movimento do esperma dentro do útero hermafrodita de C. elegans .

Em espécies animais onde o esperma e oócitos se encontram no ambiente externo (ou seja, ambientes acquáticos), o esperma responde a sinais Quimiotáticos secretados por oócitos. Estes sinais orientam a direção do movimento espermático, aproximando-os da fonte de sinal4,6,11. No entanto, muito menos se sabe sobre o movimento de espermatozóides em espécies que fertilizam internamente. Um grande desafio é a arquitetura do trato reprodutivo feminino, inacessível à microscopia na maioria das espécies. Estudos in vitro em humanos, camundongos e suínos, por exemplo, fornecem evidências de que as subpopulações de espermatozóides podem responder a quimioatrativos, fluxo de fluido e gradientes térmicos1,5,7,9, doze anos. Com esses sistemas, a incapacidade de Visualizar e rastrear o movimento de espermatozóides in vivo coloca sérias limitações em estratégias para descobrir os principais mecanismos que regulam essas funções.

Para superar estas limitações, nós desenvolvemos métodos usando o nematoide C. elegans para visualizar diretamente o esperma após a inseminação, para medir parâmetros individuais da migração do esperma in vivo, e para medir a habilidade de uma população do esperma ao alvo o local da fertilização. Esses métodos, juntamente com o conjunto de ferramentas molecular e genética C. elegans , facilitam a descoberta das moléculas de sinalização química e das máquinas moleculares que regulam os comportamentos de motilidade espermática. Por exemplo, as telas genéticas podem ser conduzidas nos hermafroditas ou nos machos para identificar os genes que são essenciais para o movimento eficiente do esperma em vivo13. As moléculas podem ser injetadas na gônada hermafrodita para testar os efeitos na ativação do espermatozóide, velocidade de migração e motilidade direcional3. Adicionalmente, os métodos descritos podem ser usados para monitorar a migração desonesto do esperma em posições ectópica do corpo e para avaliar a competição do esperma10,14.

C. elegans existem na natureza como hermafroditas e machos (ver Figura 1). A gônada hermafrodita tem dois braços em forma de U que são imagens espelhadas umas das outras. Durante a fase larval L4, as células germinativas mais proximais (i.e., as células próximas à espermateca) passam por espermatogênese. Cada Espermatócito primário entra na meiose e produz quatro espermátides haploides. Estes espermátides são empurrados no espermateca junto com o primeiro oócito maduro e submetem-se ao Espermiogênese15. Adultos hermafroditas mudar de espermatogênese para oogenesis. Os oócitos amadurecem em uma forma de linha de montagem ao longo da gônada, com o oócito mais maduro na extremidade proximal da gônada, ao lado da spermatheca. Os sinais MSP do espermatozóide são necessários para desencadear a maturação meiótica e a ovulação16,17. Masculino C. elegans, por outro lado, tem uma gônada em forma de J que produzem apenas esperma. As espermátides são armazenadas na vesícula seminal. Ao acasalar com o hermafrodita ou fêmea, o macho insere os espículas perto da cauda na vulva. Spermatids são ativados durante a ejaculação, quando entram em contato com o fluido seminal18. C. elegans esperma não nadar como eles não são flagelados. Em vez disso, eles rastejam através do trato reprodutivo, usando o Pseudopod para locomoção. É poço-estabelecido que o esperma masculino, que são maiores no tamanho, tem uma vantagem do competidor sobre o esperma hermafrodita14.

Neste método, o macho C. elegans actua como o doador do esperma e é acoplado aos hermaprhodites adultos. Os machos adultos são manchados com uma tintura mitochondrial fluorescente ao esperma etiquetado produzido. Uma vez depositado através da vulva hermafrodita, o espermatozóide deve rastejar em torno dos embriões no útero para o spermatheca, ou local de fertilização. A epiderme transparente do modelo C. elegans permite a visualização direta de cada espermatozóide individual à medida que navega através do trato reprodutivo feminino. Nos últimos anos, nosso laboratório usou com sucesso este método para demonstrar a importância de uma classe de prostaglandinas da F-série em guiar o esperma da vulva ao espermateca19,20. Os mechansims moleculars que regem sua síntese pelo Hermafrodite e pela resposta pelo esperma estão ainda a investigação. Entretanto, este método para avaliar a motilidade e a migração do esperma facilita extremamente a identificação dos jogadores chaves que controlam a comunicação do esperma e do oócito em animais internamente fertilizando. O seguinte protocolo descreve passo a passo como executar este ensaio.

Protocolo

Nota: todas as etapas neste protocolo são executadas em temperatura ambiente (~ 20-22 ° c) ou em incubadoras de temperatura constante definidas para 16 ° c ou 20 ° c. Masculino e hermafrodita C. elegans são cultivados usando condições de cultura padrão e NA22 ou OP50 e. coli como fonte de alimento21,22. Selvagem-tipo N2 hermafroditas e névoa-2 (q71) machos são usados no procedimento abaixo.

1. dia 1: colheita L4 estágio hermafroditas para acasalamento

  1. Para obter resultados consistentes, todos os hermafroditas devem ser sincronizados como adultos em reprodução ativa. Escolha 20-30 L4 estágio hermafroditas a uma placa de meio de crescimento de nematódeos (NGM) de 6 cm semeada. Incubar os hermafroditas a 20 ° c por 28-30 h.
    Nota: Somente 12-15 hermafroditas serão usados para acasalamento. Os restantes hermafroditas são excedentes.

2. dia 1: coloração de machos com corante mitocondrial fluorescente (mito-corante)

  1. Faça um macho que mancha a placa coloc um ponto de E. coli (ponto do alimento) no centro de uma placa unseeded de ngm. Para fazer o ponto do alimento, use a extremidade de uma haste de agitação de vidro para raspar e. coli do gramado das bactérias de uma placa semeada e depositá-la na placa unseeded. O ponto deve ser ~ 5-7 mm de diâmetro.
  2. Misture 2 μL de 1 mM de mito-corante (ver tabela de materiais) em DMSO e 10 μL de tampão M9 (3 g de KH2po4, 6 g de na2HPO4, 5 g de NaCl, 1 ml de 1 M MgSO4, H2o a 1 L. Adicionar MgSO4 após autoclavagem). Pipeta toda a solução do mito-tintura no ponto do alimento na placa de mancha masculina. Deixe a placa secar no escuro (~ 30 min).
    Nota: Mito-corante é sensível à luz. Proteja todas as soluções, placas e vermes contendo mito-corante da luz. Armazene o estoque de 1 mM a-20 ° c.
  3. Pick ~ 100 1-3 dia velhos adultos machos23 para o mito-corante manchado ponto de alimento na placa de coloração masculina. Enrole a placa na folha de alumínio e incubar durante a noite a 16 ° c. Para acasalamento, use ~ 50-60 machos por 12-15 hermafroditas. Se mais de ~ 100 machos são necessários, fazer mais placas de coloração para evitar a superlotação de machos.
    Nota: Os machos podem igualmente ser manchados incubando em uma solução do mito-tintura de 10 μM no amortecedor M9 por 3 h em um vidro de relógio. Mantenha os vermes cobertos para evitar a evaporação e exposição à luz. Após 3 h, use um Pipet Pasteur para transferir machos para uma placa NGM de 10 cm semeada. Transfira como pouco da solução do mito-tintura como possível. Enrole a placa na folha de alumínio e incubar durante a noite em 16 ° c.

3. dia 2: acasalamento

  1. Escolha os machos manchados do dia 1 para uma placa NGM nova e semeada. Deixe a placa no escuro até o acasalamento. Esta etapa assegura-se de que o excesso mito-tintura as bactérias manchadas em torno dos machos sejam removidas. O Carryover das bactérias manchadas mito-tintura excessivas na placa de acoplamento pode manchar o tecido Hermafrodite.
  2. Faça uma placa de acoplamento deixando cair 2 μL de uma mistura grossa de E. coli em uma placa unseeded de ngm. Deixe as bactérias grossas secar para fazer o ponto de acasalamento. Machos e hermafroditas serão transferidos para este ponto para acasalar. Para fazer e. coliespessa, gire para baixo 3 ml de noite e . coli e ressuscitem a pelota das bactérias em 1 ml de M9. Esta mistura pode ser armazenada a 4 ° c e reutilizada por até 6 meses.
    Nota: A espessura da solução de E. coli pode ser ajustada. Se a solução for muito fina, os machos podem rastejar para longe do ponto de acasalamento em vez de agregar nele para acasalar. Os pontos de acoplamento feitos de um Soluton de E. coli que seja demasiado grosso podem diminuir a eficiência de acoplamento.
  3. Enquanto a placa de acoplamento de Step 3,2 está secando, misture 300 μL de 1% (w/v) tricaína (Tri), 300 μL de 0,1% (w/v) tetramisole (Tet), e 900 μL de M9.
    Nota: Armazene 1% (p/v) tricaína e 0,1% (p/v) tetramisole como alícitações a-20 ° c. Evite congelar o congelamento repetido.
  4. Transfira 600 μL da solução Tet/Tri para um vidro de relógio.
  5. Transfira 12-15 hermafroditas colhidas no dia 1 para a solução Tet/Tri no vidro de relógio. Incubar por 30 min para imobilizar os hermafroditas. Mantenha o vidro de relógio coberto para impedir que a solução de Tet/Tri evoque.
    Nota: É importante que os hermafroditas sejam anestesiados por pelo menos 30 min. menos tempo poderia resultar em um worm em movimento durante a aquisição de imagem, que pode interefere com imagem.
  6. Enquanto os hermafroditas estão incubando, escolha 50-60 machos manchados da etapa 3,1 para o ponto de acasalamento (passo 3,2). Guarde a chapa no escuro até ao passo 3,8.
  7. Após a incubação de 30 min na solução de Tet/Tri, use um Pipet de vidro Pasteur para transferir os hermafroditas imobilizados do vidro de relógio para uma placa NGM sem sementes. Retire o máximo de líquido possível e deixe o excesso de líquido secar.
    Nota: Não deixe o hermafrodites secar excessivamente. Assim que todo o líquido visível tiver evaporado, comece o próximo passo.
  8. Transfira os hermafroditas anestesiados da placa de NGM unseeded para o ponto de acasalamento com os machos corados. Incubar no escuro por 30 min para permitir que os machos acasalam com os hermafroditas.
  9. Após o acasalamento por 30 min, monte os hermafroditas imediatamente para imagens de lapso de tempo ou transfira os hermafroditas para uma placa NGM nova e semeada para descansar por 1 h antes da imagem.
    Nota: Vídeos de lapso de tempo do útero hermafrodita são usados para quantificar a velocidade do espermatozóide e a frequência de reversão. As imagens ainda do útero tomado 1 h após o acoplamento são usadas para quantificar a distribuição do esperma, ou a orientação do SPEM.

4. dia 2: montagem de worms para visualização

  1. Criando uma almofada de montagem com 2% de agarose em H2O
    Nota: o agarose de 2% pode ser feito no volume, aliquotado nos tubos de ensaio de vidro, e armazenado em 4 ° c. Quando necessário, cada alíquota pode ser microondas antes de cada uso e armazenado em um bloco de calor para impedi-lo de solidificação.
    1. Para fazer a almofada de montagem, alinhe três corrediças de vidro do microscópio lado a lado com as bordas longas que tocam. Coloque dois pedaços de fita adesiva em cima uns dos outros em ambos os slides exteriores. Estas corrediças de vidro exteriores com fita actuarão como a sustentação assim que a espessura da almofada resultante do agarose será "fita dois profundamente".
    2. Coloc ~ 75 μL do agarose derretido de 2% na corrediça Center (esta é a corrediça sem fita). Coloque imediatamente uma nova lâmina de microscópio de vidro em cima do agarose. Esta corrediça de vidro superior deve ser perpendicular aos outros slides, com cada extremidade descansando na fita dos dois slides de suporte.
    3. Deixe o agarose endurecer (~ 30 s). Remova com cuidado a corrediça de vidro superior deslizando a fora da almofada do agarose.
  2. Coloque 10-15 μL da solução Tet/Tri na almofada de agarose a 2%. Transfira os hermafroditas acoplados para a almofada. Tome cuidado para transferir o mais pequeno bactérias possível.
  3. Coloque um deslizamento de cobertura sobre os vermes na almofada de agarose.

5. dia 2: configuração de aquisição de imagem

Nota: Qualquer tunelamento vertical equipado com EPI-fluorescência, 10x e 60x objetivos, e uma câmera digital pode ser usado para adquirir imagens para distribuição de espermatozóides. Software capaz de adquirir imagens com lapso de tempo são necessários para avaliar a velocidade do esperma, velocidade direcional e freqüência de reversão.

  1. Aquisição de imagem 1 h após o acasalamento
    1. Monte o slide na fase do microscópio. Olhe através dos pedaços de olho para verificar se há vermes na almofada de agarose usando o objetivo de 10x com o filtro de emissão de fluorescência vermelha (filtro TRITC). Uma vez que um sem-fim foi encontrado, gire momentaneamente sobre a luz da fluorescência para ver se o sem-fim se acasalou. Se o esperma é visível dentro do útero, mude para o objetivo de 60x.
      Nota: A pressão criada pelo objetivo 60x na lamínula pode danificar alguns vermes frágeis, causando o intestino ou a gônada a expulsar do animal. A varredura para o acoplamento bem sucedido usando o objetivo 10x pode minimizar a exposição dos sem-fins à pressão adicionada. Não exponha os vermes acasalados a longos períodos de luz fluorescente.
    2. Usando a microscopia de contraste da interferência diferencial (DIC), posicione o sem-fim de modo que a vulva e uma espermateca estejam na vista. Concentre-se na imagem, concentrando-se no centro da spermatheca. Verifique a exposição para os canais DIC e TRITC. No DIC, as estruturas internas do sem-fim devem ser claramente visíveis. Em TRITC, o esperma individual deve ser visível como o puncta distinto.
      Nota: Cada imagem deve capturar o útero da vulva para uma das spermatheca. Se o útero é muito longo para caber em uma imagem, duas imagens separadas podem ser tomadas. Não é necessário que todas as imagens sejam tomadas no mesmo nível de exposição. Entretanto, é importante que o esperma individual possa ser distinguido e quantificado nas imagens da fluorescência.
    3. Adquira DIC e imagens de fluorescência para cada útero.
    4. Repita os passos 5.1.1-5.1.3 até que todos os hermafroditas acasalados tenham sido imaged.
  2. Capturando vídeos de lapso de tempo
    1. Escaneie a almofada de agarose e localize hermafroditas que contenham espermatozóides rotulados dentro do útero, conforme descrito na etapa 5.1.1 e 5.1.2
    2. Configure o software para adquirir imagens de lapso de tempo nos canais DIC e TRITC. Geralmente, as imagens de lapso de tempo são tomadas em intervalos de 15-30 s para 10-20 min por útero.

6. quantificação do

  1. Quantificando a distribuição do esperma em imagens do útero tomadas 1 h após o acoplamento
    1. Começando com a vulva em uma extremidade e o espermateca no outro, divida o útero em terços. Estes representarão as três zonas. A zona 1 (Z1) contém a vulva e a zona 3 (Z3) contém a spermatheca.
    2. Conte manualmente o número de espermatozóides dentro de cada terço do útero, e relate o número em cada zona como um percentual do esperma total em todo o útero. Um exemplo é fornecido abaixo.
      Fórmula de concentração de espermatozoides, equação de razão; equação para calcular a porcentagem de espermatozóides em zonas.
      Nota: às vezes, a intensidade do sinal da imagem do canal TRITC precisa ser ajustada para que todos os espermatozóides capturados na imagem possam ser visíveis e quantificados.
  2. Rastreamento de espermatozóides em imagens de lapso de tempo
    Nota: Neste artigo, utilizamos o software NIS-Elements para análise. Nas seções abaixo, damos instruções para rastreamento manual de espermatozóides usando este software (passo 6.2.1), bem como o software de código aberto ImageJ/Fiji (passo 6.2.2).
    1. Rastreamento de espermatozóides com NIS-Elements
      1. Abra o arquivo. ND2 com a série de lapso de tempo a ser rastreada. Para iniciar o rastreamento, abra o painel de controle clicando com o botão direito do mouse no software e selecionando controles de análise | A rastrear.
      2. No painel de controle, selecione definir novo ROI. Defina cada região de interesse (ROI) clicando sobre cada espermatozóide que será rastreado. Uma marca colorida aparecerá sobre o esperma selecionado. Clique em concluir quando todos os Rois foram selecionados.
      3. Uma vez identificados os ROIs, mova para o próximo quadro na série de lapso de tempo. Arraste o marcador de ROI para a nova posição do espermatozóide na imagem. Continue fazendo isso até que o esperma não pode mais ser rastreado. Linhas pontilhadas aparecerá conectando cada um dos locais que o marcador de ROI foi colocado através de todos os quadros da imagem de lapso de tempo.
        Nota: Apenas espermatozóides na zona 2 devem ser rastreados como espermatozóides nas zonas 1 e 3 tendem a se mover em um padrão circular, mesmo em animais de tipo selvagem.
      4. Exporte todos os dados quantificáveis (por exemplo, comprimento do caminho, tempo, posição XY, etc.) do espermatozóide rastreado para um documento do Excel clicando em Exportar no painel de controle.
    2. Acompanhando o esperma com Fiji
      1. Converta as imagens de canal TRITC na série de lapso de tempo para arquivos. tif. Salve todos os arquivos de uma série em uma pasta.
      2. Importe as imagens para Fiji usando a função de importação BioFormats. Importe imagens de uma série de lapso de tempo como uma hiperpilha.
      3. Open TrackMate em Fiji24 via plugins | Rastreamento | Rastreamento manual com TrackMate. Uma caixa de diálogo abrirá.
      4. Selecione a ferramenta TrackMate na barra de ferramentas Fiji. Dê um duplo clique sobre o esperma que será rastreado. Aparecerá um círculo verde com linhas tracejadas. Este círculo pode ser reposicionado clicando dentro do círculo e arrastando para a posição desejada. O tamanho deste círculo pode ser alterado ao pressionar simultaneamente a tecla ALT e rolar o mouse.
      5. Uma vez que o tamanho ea posição do rastreador foi definido, clique no círculo novamente. As linhas verdes tracejadas vão se transformar em uma linha verde sólida. Simultaneamente, aperte as teclas Shift e L para ativar o modo de rastreamento. Isto será indicado na barra de ferramentas de Fiji.
      6. Mova para o próximo quadro na série de lapso de tempo. Para definir o novo local do espermatozóide rastreado no novo quadro, passe o mouse sobre o novo ponto e pressione a tecla a. O rastreador aparecerá agora no novo local, e uma linha aparecerá conectando os locais onde o rastreador foi colocado nos quadros anteriores.
      7. Depois que os rastreamentos tiverem sido concluídos, clique em analisar na caixa de diálogo trackmate para gerar os dados necessários.
    3. Para calcular a velocidade, divida o comprimento total do trajeto do esperma pelo tempo decorrido.
    4. Para calcular a velocidade vectorial, desenhe uma linha através do útero a partir da vulva apontando para a spermatheca. Meça a distância que o esperma migrou ao longo desta linha do começo ao fim do traço. Divida essa distância pelo tempo decorrido. Os valores negativos indicam que o espermatozóide migrou para longe da spermatheca.
    5. Para gravar a frequência de reversão, conte o número de vezes durante o qual o rastreamento de espermatozóides gerou um ângulo inferior a 90 ° durante três quadros consecutivos de lapso de tempo.

Resultados

Para gerar os resultados descritos neste papel, os machos Fog-2 (q71) foram manchados com o mito-corante e acasalados ao selvagem-tipo, N2 hermafroditas. A Figura 2 fornece um esquema geral para o método, incluindo a preparação do worm, o acasalamento e a análise. Como o filme 1 mostra, o trato reprodutivo hermafrodita adulto tem dois braços que são imagens espelhadas umas das outras. Após o acasalamento, os espermatozóides rotulados são depositados no útero hermafrodita através da vulva. O esperma move-se em torno dos embriões tornando-se dentro do útero para o spermatheca, onde são armazenados até a fertilização. Como as células germinativas no adulto hermafrodita se desenvolvem em oócitos, o oócito proximal, mais maduro é empurrado para o espermateca através de contrações de células da bainha. A fertilização ocorre enquanto o oócito está na spermatheca.

Para quantificar a distribuição e migração de espermatozóides através do trato reprodutivo feminino, o útero hermafrodita é dividido em três zonas (filme 1, figura 3a). Zona 1 abrange o primeiro terço do útero, a partir da vulva. Zona 2 abrange o terço médio do útero, e zona 3 abrange o último terço do útero e inclui o spermatheca. A orientação apropriada do esperma usando o selvagem-tipo, os hermafrodites do N2 e os machos da névoa-2 (q71) devem conduzir a aproximadamente 90% do esperma etiquetado que alcanga o spermatheca, ou a zona 3 (Figura 3B).  Matings que resultam em muito poucos (Figura 3C, menos de 10-15 espermatozóides) ou muitos (Figura 3D, útero preenchido com esperma) esperma no útero não deve ser contado. Em acasalamentos que resultam em menos de 10-15 espermatozóides, 3-4 esperma desonestos pode distorcer fortemente os dados. Similarmente, quando o útero é enchido completamente com esperma, o esperma não pode migrar apropriadamente. O esperma pode parecer dispersado durante todo o úteros de alguns mutantes que exibem o phenotype pobre da orientação do esperma. No entanto, neste caso, o esperma não deve encher cada fenda do útero, como visto na Figura 3D. A quantificação de cada braço da gônada é considerada uma amostra, ou uma n.

As imagens do lapso temporal são tomadas para quantificar a velocidade do esperma e a freqüência da reversão. Apenas o espermatozóide na zona 2 deve ser rastreado (figura 4a) porque o espermatozóide nas zonas 1 e 3 (filme 1) tendem a se mover em um padrão circular mesmo dentro de animais do tipo selvagem. As imagens do tempo-laspe tomadas em intervalos de 15-30 s são usadas geralmente para controlar o esperma. Apenas espermatozóides que podem ser seguidos em quadros consecutivos por mais de 2,5-3 min são quantificados. Na Figura 4B-M, o espermatozóide marcado pelos pontos vermelho e azul satisfazem este critério, enquanto o espermatozóide marcado pelo ponto verde não. Portanto, os valores definidos na Figura 4n são quantificados para o espermatozóide marcado pelos pontos vermelho e azul (Figura 4o), enquanto aqueles para o espermatozóide marcado pelo ponto verde não foram quantificados.

Diagrama hermafrodita vs masculino da anatomia de C. elegans, incluindo linha germinativa, espermateca, vesícula seminal.
Figura 1: desenhos animados do adulto C. elegans hermafrodita e do sexo masculino. As principais estruturas reprodutivas são rotuladas na figura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fluxograma: Protocolo de acasalamento de C. elegans; corante, uso anestésico; análise de esperma por microscopia de epifluorescência.
Figura 2: diagrama esquemático da preparação da amostra e aquisição de dados. Machos manchados com o mito-corante são acasaladas com hermafroditas adultos sincronizados. As imagens do lapso temporal de hermafroditas acasaladas são tomadas imediatamente após o acoplamento para capturar dados para a velocidade do esperma e a freqüência da reversão. As imagens ainda de hermafroditas acasaladas são tomadas 1 h após o acoplamento para avaliar a distribuição do esperma dentro do útero. Consulte o texto para obter mais detalhes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise de fertilização embrionária, imagens e diagrama de microscopia, zonas de intensidade de fluorescência Z1-Z3.
Figura 3: quantificando a distribuição de espermatozóides dentro do útero hermafrodita. (A). esquemática do útero hermafrodita C. elegans . V = vulva, E = embrião, S = spermatheca, O = oócito, Z1-Z3 = zonas 1-3 utilizadas para medir a distribuição de espermatozóides. (B-D). DIC + TRITC fundiu (painéis esquerdos) e TRITC somente (painéis direito) imagens do selvagem-tipo hermafrodita úteros 1 h após o acoplamento aos machos de Fog-2 (q71) manchados com o mito-tintura. O esperma parece vermelho. Os contornos amarelos indicam a localização da spermatheca. Barra de escala: 20 μm. A quantificação de Z1, Z2, Z3 em B representa o percentual de espermatozóides em cada zona ± desvio padrão. As imagens em c e D representam acasalamentos que resultaram em muito poucos (c) ou demasiados (D) espermatozóides para quantificação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Microscopia de motilidade espermática: análise de lapso de tempo, velocidade vetorial, frequência de reversão, cálculos.
Figura 4: quantificando a velocidade do espermatozóide e a frequência de reversão durante a migração através do útero. (A). dic + TRITC fundiu a imagem de um útero hermafrodita que contem o esperma fluorescente (vermelho). V = vulva, amarelo = spermatheca, Z1-Z3 = três zonas do útero, caixa preta: zona 2. (B-M). As imagens de canal TRITC de lapso de tempo ampliadas na zona 2 (caixa preta em A). As imagens foram adquiridas em intervalos de 20 s. 3 espermatozóides individuais foram rastreados em cada imagem (pontos vermelhos, verdes e azuis). Pontos coloridos no painel M representa o caminho de cada espermatozóide de B-L. Barra de escala = 20μm. (N). equações e definições para velocidade de espermatozóides, velocidade vetorial e frequência de reversão. (O). Speed, a velocidade vectorial e a freqüência da reversão do esperma seguiram nos painéis B-L pelos pontos vermelhos e azuis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Processo reprodutivo do nematóide, diagrama mostrando contrações da bainha, ovulação; análise microscópica.
Filme 1: filme de movimento de espermatozóides e migração. Um tipo selvagem hermafrodita foi acoplado a Fog-2 (q71) machos manchados com mito-tintura. O filme é um composto de imagens de lapso de tempo tiradas em intervalos de tempo variados. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)

Discussão

A capacidade do esperma de navegar no trato reprodutivo feminino complicado e encontrar oócitos é fundamental para a reprodução sexual. Estudos recentes usando espermatozóides de animais internamente fertilizantes sugerem que eles respondem ativamente a várias pistas ambientais, incluindo sinais químicos, fluxo de fluido e gradientes de temperatura1,5,7, 9 anos de , 12. Entretanto, estas observações conduziram pela maior parte dos experimentos in vitro e pouco se sabe sobre o comportamento e a comunicação do esperma dentro do intervalo reprodutivo. Uma das principais barreiras para a aquisição de dados in vivo sobre migração de espermatozóides e motilidade é a falta de visibilidade dentro da maioria dos tratos reprodutivos femininos. O método que descrevemos aqui usando C. elegans supera essa limitação. Como os resultados representativos demonstram, a epiderme transparente permite o visualização e o seguimento diretos de cada esperma na única definição da pilha em um organismo vivo, intacto.

C. elegans tem dois sexos. Os machos, com um genótipo XO, produzem apenas espermatozóides e, neste método, são usados como doadores de espermatozóides. O hermafrodita, com um genótipo XX, são fêmeas modificadas. Suas gônadas se submetem pela primeira vez à espermatogênese durante a quarta fase larval e passam para a oogênese na idade adulta25. Este ensaio utiliza hermafroditas adultos, cujos tecidos reprodutivos fornecem um modelo para o trato reprodutivo feminino. A utilização de ambos os sexos neste ensaio nos permite identificar vias genéticas e moleculares tanto no sexo masculino quanto no feminino, que podem regular a orientação e motilidade do espermatozóide. Combinado com toda a série de técnicas genéticas e moleculares disponíveis para C. elegans, este método pode levar a novos insights sobre a migração de espermatozóides e motilidade, bem como a comunicação de espermatozóides e oócitos.

Algumas etapas críticas neste protocolo justificam uma consideração mais adicional, além do que os detalhes forneceram na seção do protocolo.

Vermes
nevoeiro-2 (q71), him-5 (e1490), ou him-8 (e1489) machos mutantes podem ser usados no lugar de machos N2. Estas mutações aumentam a frequência de machos em culturas, mas não afetam as funções masculinas de acasalamento ou espermatozóide13. Fêmeas, como as fêmeas Fog-2 (q71) , podem ser usadas no lugar de hermafroditas. No entanto, as fêmeas devem ser pré-acasaladas com machos para permitir o desenvolvimento adequado de oócitos. A presença de embriões fertilizados deste pré-acasalamento também assegura que o útero é suficientemente longo para avaliar adequadamente a distribuição de espermatozóides. Se os hermafroditas mutantes ou experimentais estiverem sendo avaliados, inclua um (s) grupo (es) de controle. Por exemplo, os hermafroditas mutantes devem ser emparelhados com hermafroditas de N2 do tipo tipo selvagem como um controle para outras variáveis no ensaio. Hermafroditas que foram alimentados com bactérias contendo plasmínicos para ensaios de interferência de RNA também devem ser alimentados com bactérias contendo controle vetorial vazio. A distância da vulva, onde os espermatozóides são inseminados, para o spermatheca, o local de fertilização, pode variar dependendo do número de ovos no útero (ou seja, o útero se expande com o aumento do número de ovos). Se as comparações entre os genótipos são feitas, selecione hermafroditas cujos úteros contêm números semelhantes de ovos. Não selecione hermafroditas contendo embriões de incubação ou larvas em movimento. Um curso do tempo pode ser executado para identificar a idade óptima em que os hermafroditas devem ser ensaiados.

Escolhendo hermafroditas e machos
É importante que os hermafroditas escolhidos para este ensaio não sejam de placas sobrecultivadas ou com fome. O alimento e as pistas do feromônio modulam a expressão de DAF-7, um homolog de tgfß. O caminho DAF-7 foi mostrado regular a síntese de prostaglandinas da série F que desempenham papéis importantes na orientação do esperma para a espermateca20. Escolhendo hermafroditas de placas superlotadas ou faminta pode resultar em má orientação do esperma não relacionada com o alvo de interesse. A densidade das placas não parece afetar o esperma masculino. Entretanto, os machos que são demasiado novos ou demasiado velhos podem conduzir à eficiência de acoplamento diminuída (isto é, o percentual de hermafroditas na placa de acoplamento que têm bastante esperma em seus úteros para quantificar). 1-3 machos adultos velhos do dia são ideais para este ensaio23.

Anestesiante hermafroditas
Em nossas mãos, a combinação de tetramisole e tricaína assegura que os vermes são imobilizados, e permanecem vivos durante o acasalamento e aquisição de imagem. Outros anestésicos, como a azida sódica, também podem ser usados. No entanto, a azida sódica é altamente tóxica e as condições precisam ser padronizadas. As técnicas da imobilização que usam microbeads, agarose, e câmaras dos microfluídica não são recomendadas enquanto interferem com o acoplamento.

Coloração masculina
O mito-corante utilizado neste manuscrito, MitoTrackerCMXRos, tem sido amplamente utilizado para a rotulagem de espermatozóides, bem como outras mitocôndrias, em C. elegans. O espermatozóide rotulado com este mito-corante é totalmente funcional, mantendo sua capacidade de ser ativada, migrar, fertilizar oócitos, e produzir progên viável26,27. Outros corantes mitocondriais, como a rhodamina 6G e a DiOC6, têm sido usados para manchar a mitocôndria28,29de C. elegans . Entretanto, as condições para estas tinturas precisam de ser estandardizadas para etiquetar o esperma neste ensaio. Além dos mecanismos de rotulagem mitocrondrial, as manchas de DNA, como a Syto17, também podem ser usadas para rotular espermatozóides para os ensaios de migração30. Quando estas técnicas de rotulagem forem relativamente fáceis e rápidas executar, as estratégias transgênicas podem igualmente ser empregadas para gerar o esperma que expressam etiquetas fluorescentes os promotores específicos do esperma31,32.

Acasalamento
Os pontos de acoplamento que são demasiado grossos podem diminuir a eficiência de acoplamento. O cuidado deve ser tomado para transferir tão pouco bactérias como possível ao transferir machos e hermafroditas anestesiados no ponto de acoplamento.

Fazer almofadas de agarose e colocar o deslizamento da tampa
As bolhas de ar podem ser geradas nas almofadas do agarose. Eles podem refract luz durante a aquisição de imagem ou, quando grande o suficiente, causar vermes a cair, tornando-se impossível adquirir a imagem (s). Similarmente, as bolhas de ar podem ser criadas ao longo dos hermafroditas quando o deslizamento de tampa é coloc sobre eles na almofada do agarose. Estas bolhas refract luz e levar a diminuição da qualidade da imagem. A prática vai ajudar a diminuir a ocorrência de bolhas de ar.

Quantificação
Ao quantificar a distribuição do esperma, os z-aviões diferentes através do útero de um sem-fim podem ter diferenças ligeiras na distribuição do esperma. Nós achamos que tomar uma única imagem focada na espermateca nos dá resultados reprodutíveis que são semelhantes aos resultados obtidos pela média de múltiplas secções z. Recomendamos focar a imagem no centro da spermatheca, mas os planos focais podem ser alterados levemente com base nas necessidades do experimentador. É crítico, no entanto, que todas as imagens são tiradas da mesma maneira. Além disso, é importante que apenas os espermatozóides que estão em foco são contados. É discrição do contador em determinar os critérios para o esperma do em-foco. No entanto, é fundamental que os critérios sejam aplicados sistematicamente a todos os vermes quantificados. Para rastreamento de espermatozóides, muitos software oferecem recursos de rastreamento automático. No entanto, achamos que o rastreamento manual supera o algoritmo de rastreamento automático do software por duas razões principais: 1) a abundância de núcleos de tamanho semelhante dentro do espaço confinado torna difícil para o software distinguir entre espermatozóides individuais e criar ROIs definidos para cada espermatozóide. 2) como o esperma vai dentro e fora do foco, suas intensidades desloc, fazendo o difícil para que o software Mantenha o controle do esperma sobre períodos de tempo prolongados.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos sinceramente ao nosso falecido mentor, Dr. Michael Miller, por sua inspiradora e altruísta mentoria e criação deste método como uma ferramenta para entender melhor a comunicação de espermatozóides e oócitos. Seu súbito falecimento tem sido uma tremenda perda para sua família, seu laboratório e a comunidade científica. Este estudo foi apoiado pela NIH (R01GM085105 para MAM e F30HD094446 para MH). O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes e Material
60 mm x 15 mm Placa de PetriFisherFB0875713A
ÁgarFisherBP1423-500
Cloreto deSódio FisherS671-3
PeptonaFisherBP1420-500
ColesterolSigma-AldrichC8667
Caldo LB, MillerFisher1426-2
Escherichia coli cepa NA22Caenorhabditis Genetics Center (CGC)NA22Tanto este quanto o OP50 E. coli podem ser usados para C. elegans manutenção e ensaio. Ambos podem ser adquiridos no CGC
N2CGCN2
fog-2(q71)CGCCB4108
Fio de platina 0,25 mm de diâmetroAlfa Aesar10288
5 3/4" Pipeta Pasteur descartávelFisher13-678-20A
Vidro de relógioFisher02-612A
5 mm dediâmetro.Fisher50-121-5269
MitoTracker CMXRos (Mito-dye)FisherM7512Escudo contra a luz, armazene a -20 ° C
Fosfato monopostássioFisherP285-500
Fosfato dissódicoFisherS374-1
Sulfato de magnésioFisherM63-500
DimetilsulfóxidoFisherBP231-1DMSO
Folha de alumínioFisher01-213-102
Etil 3-aminobenzoato metanossulfonatoSigmaE10521-10GTricaine é o nome comum. Armazene em aliquotes a -20 °C.
Cloridrato de tetramisolSigmaL9756-5GArmazenar em aliquotes a -20 ° C
AgaroseFisherBP1356-100
LamínulasFisher12-548-A18 x 18-1
Lâminas de microscópio foscoFisher12-552-3
Nome<strong>EmpresaNúmero de CatálogoComentários
Equipamento
16 ° C e 20 &graus; C incubadorasFisher97-990EMesmo modelo, ajustado em diferentes temperaturas.
Microscópio vertical com iluminador de epifluorescência, câmera e objetivas de 10x e 60xNikon
com recursos de aquisição e rastreamento de imagemNikonNIS-elements AR
Stereo-microscopeNikonSMZ800NQualquer estereomicroscópio que possa ser usado para visualizar C. elegans pode ser usado com este protocolo
Software

Referências

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