Avaliando a Prehension qualificada em camundongos usando um instrutor automático

Resumo

Método para avaliar o impacto do treinamento em habilidades motoras é uma ferramenta útil. Infelizmente, a maioria das avaliações comportamentais pode ser trabalhosa e/ou dispendiosa. Nós descrevemos aqui um método robótico de avaliar a habilidade do preensão (alcance-à-preensão) nos ratos.

Resumo

Nós descrevemos um método para introduzir ratos ingênuos a uma tarefa nova do preensão (alcance-à-preensão). Os ratos são alojados isoladamente em gaiolas com um slot frontal que permite que o mouse para alcançar fora de sua gaiola e recuperar pelotas de alimentos. Restrição alimentar mínima é empregada para incentivar os ratos a realizar a recuperação de alimentos a partir do slot. Como os ratos começam a associar vindo ao slot para o alimento, as pelotas são puxadas manualmente afastado para estimular a extensão e a pronação de sua pata para agarrar e recuperar a pelota através da ranhura frontal. Quando os ratos começam a chegar para as pelotas como eles chegam ao slot, o ensaio comportamental pode ser realizada através da medição da taxa em que eles agarram com sucesso e recuperar o pellet desejado. São introduzidos então a um auto-instrutor que automatiza o processo de fornecer pelotas do alimento para que o rato agarre, e a gravação de tentativas bem sucedidas e falhadas do alcance e do agarramento. Isso permite a coleta de dados de alcance para múltiplos camundongos com esforço mínimo, a ser utilizado na análise experimental, conforme apropriado.

Introdução

Métodos para testar experimentalmente uma habilidade motora pré e pós-lesão neurológica, bem como modulam o tempo, quantidade e tipo de treinamento motor são importantes para a pesquisa translacional. Ao longo da última década, os camundongos, por causa da facilidade de manipulação genética, tornaram-se um sistema de modelo popular para elucidar os mecanismos de aprendizagem motora pré e pós-lesão. No entanto, os ensaios comportamentais em camundongos não foram otimizados da mesma forma que tais ensaios foram para outros mamíferos (especialmente ratos). Além disso, há diferenças importantes entre o comportamento de um rato e um rato que sugerem fortemente treinar as duas espécies em diferentes maneiras^1,2.

Os movimentos hábeis do preênsil usam uma mão/pata para coloc o alimento na boca, para manipular um objeto, ou para usar uma ferramenta. De fato, chegar a apreender vários objetos na vida cotidiana é uma função fundamental dos membros superiores e o ato de alcançar-comer é uma forma de prehensão que muitos mamíferos usam. Muitas das alterações genéticas, fisiológicas e anatômicas que sustentam a aquisição da habilidade preênsil têm sido bem definidas no campo³. Em traduzir resultados pré-clínicos aos resultados clínicos, um precisa um teste relevante que seja eficiente e reprodutível. Estudos de roedores e de alcance humano demonstram que o comportamento de prehensão é semelhante em humanos e em animais⁴. Conformemente, estas similaridades sugerem que o teste do preensão possa servir como um modelo translacional para investigar a aprendizagem do motor assim como os prejuízos e os tratamentos da doença humana. Portanto, avaliar a prehensão em camundongos pode oferecer uma ferramenta poderosa na pesquisa translacional estudando Estados de saúde e doença⁴.

Infelizmente, a tarefa do preensão nos ratos, mesmo para um ajuste de laboratório em pequena escala, pode ser trabalhoso e demorado. Para aliviar este problema, nós descrevemos aqui uma versão automatizada da tarefa do preensão. A tarefa descrita exige que os ratos estendam uma única pata através da ranhura frontal da gaiola do rato, pronação a pata estendida, agarre a recompensa da pelota do alimento, e puxe a pelota de volta ao interior da gaiola para o consumo. Os dados resultantes são apresentados como um sucesso ou uma falha do preensão. Essa automação registra com êxito os dados e reduz a carga e o tempo com que os pesquisadores devem engajar a tarefa.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo ACUC (Comitê de cuidados e uso de animais) da Universidade Johns Hopkins.

1. preparando gaiolas do rato para o uso

1. Criar uma abertura com fenda com dimensões de 0,8 cm de largura e 7 cm de altura a partir da base na extremidade dianteira de cada gaiola, como ilustrado na Figura 1. Este slot serve como a abertura através da qual o animal vai chegar.
   Nota: o instrutor automático foi projetado para o uso com as dimensões padrão da gaiola do rato (como mostrado na Figura 1) fornecida pela maioria de vendedores da fonte da pesquisa animal. Mais, o auto-instrutor suportará facilmente outros gaiola-tipos.
2. Dentro de cada gaiola individual, adicione uma plataforma adjacente ao slot para permitir que os ratos fiquem de pé e alcancem as pelotas apresentadas. Certifique-se de que a plataforma está localizada acima do chão da maca da gaiola, aproximadamente 3 cm de altura. Use pratos de Petri afixados com super cola e tampado por uma folha de metal aproximadamente 10 cm x 15 cm, no entanto, qualquer superfície plana grande o suficiente para um mouse para ficar sobre a chegar a partir de será suficiente.
3. Crie um entalhe vertical através do meio da parte dianteira da gaiola que mede 0,8 cm transversalmente e 7 cm de altura que permitirá que um rato alcangue sua pata fora da gaiola.
4. A partir de uma fina folha de metal, (aproximadamente 2 mm de espessura) cortar uma porta gaiola em retângulos medindo 5 cm x 10 cm para servir como uma abertura uniforme através do qual o animal é para chegar.
   Nota: os ratos podem mastigar em gaiolas plásticas que mudariam o tamanho da abertura. O rato alcançará através deste entalhe de 0,8 cm quando a porta metálica da gaiola é coloc sobre a abertura entalhado da gaiola durante o teste usando a fita, mantendo a largura eficaz da ranhura entre gaiolas.
5. Cubra o entalhe de cada gaiola com a fita quando seu rato não está sendo testado para impedir que a maca esteja expulsa da gaiola.

2. introdução de camundongos ao movimento de alcance

1. Registre o peso inicial de cada mouse e calcule 85% desse valor para encontrar seu peso de meta, arredondando até 20 g se o resultado for menor. Dê-lhes um regime de alimentação para trazê-los e, em seguida, manter este peso objetivo.
   1. Dê a cada rato 2,5 g de Pelotas o primeiro dia e anote toda a mudança em seu peso 24 h mais tarde.
      Nota: pesar os ratos uma vez por dia e esperar uma queda de peso de 0,25-1 g por dia.
   2. Mude a alimentação diária de cada rato conforme necessário, com base nesta alteração inicial e nas alterações em curso no peso de cada rato, a fim de induzir a perda gradual de peso (menos de 0,8 g perdidos por dia) e, em seguida, manter o peso da meta resultante. Variar entre três a 6 500 mg pellets (1,5 a 3,0 g) por dia para ser eficaz.
      Nota: os ratos permanecem nesta dieta para manter seu peso do objetivo durante todo o protocolo.
2. Quando um rato atingiu o seu peso objetivo, introduzir cada rato para o conceito de chegar até o slot fechado para uma pelota de alimentos complementares. Iniciar uma sessão de treinamento, colocando uma pelota 45 mg na superfície da pelota, diretamente na frente do slot, e permitir que cada mouse para recuperá-lo. A maioria de ratos tomarão a este arranjo de alimentação dentro de 1-2 dias.
3. Uma vez que o rato associa um entalhe aberto com ser alimentado, incentive-os a alcangar com uma pata, um pouco do que a boca.
   Nota: Este é o passo mais complexo, tendo 1-2 dias, e incutir comportamento contraproducente em camundongos por engano é muito fácil; consulte a secção de discussão para mais informações e aconselhamento.
   1. Usando um par de pinças, segure um pellet na mesma posição que o mouse recuperou pelotas anteriormente. Como o rato começa a morder para a pelota, puxe-o afastado aproximadamente meio centímetro de tal forma que a pelota está fora do alcance de sua boca.
      Observação: um mouse em seu peso objetivo tentará recuperar o pellet fora de alcance. Sempre que o mouse estende uma pata através do slot, reforçar esse comportamento, permitindo-lhe comer o pellet. Alguns camundongos podem apresentar uma preferência por uma pata sobre a outra quando se estende para o alimento.
   2. Embora não seja instrumental para a experimentação, registre se a pata esquerda ou direita é preferida. Isso pode potencialmente permitir maiores taxas de sucesso global no ensaio comportamental; Alternativamente, elimine uma variável forçando cada rato a alcançar com a mesma pata.
      Nota: melhores resultados são obtidos se os ratos usam sua pata preferida.
   3. Como cada rato associa estendendo uma pata com comer uma pelota, reforça mais esse comportamento retendo a pelota em resposta às tentativas de recuperar a pelota com a boca e a lingüeta. Os ratos começarão a cumprir este arranjo sobre 2 a 3 dias.
   4. Finalize a introdução do comportamento de alcance da pata desejada, colocando o 45 mg pellet pouco menos de 1 cm da borda externa do portão da gaiola, de tal forma que o ponto mais à esquerda ou mais à direita da pelota (se é para a direita ou esquerda do slot gaiola do investigador , respectivamente) é tangente a uma linha que se estende diretamente da borda da ranhura do portão da gaiola. Permitir que o mouse para tentar recuperar o pellet, sendo vigilante para remover o pellet e evitar o seu consumo se o mouse deve tentar por algum outro método de extensão pata.
      Nota: quando um rato estende consistentemente uma pata para agarrar e é capaz de tocar a pelota fornecida, está pronto para testar usando o auto-instrutor descrito abaixo e o ensaio comportamental associado. O tempo das introduções ingênuas a ser preparada variará entre ratos; Se houver retardatários que levam mais de duas semanas para entender, eles devem ser excluídos do conjunto de dados.

3. usando o instrutor automático

Observação: consulte a Figura 1-3 e a seção de discussão para obter uma descrição completa do hardware, do software e das ações físicas do instrutor automático.

1. Prepare-se para a sessão de treinamento.
   1. Calibre o sensor da pelota da isca. Clique na seta Run na interface do LabVIEW e observe o sensor da pelota da isca lendo com e sem um pellet no lugar. Clique no botão parar para interromper essa execução de teste e alterar o alvo do sensor de pellet de isca para um valor entre essas duas leituras (Figura 3 e tabela 2). A maioria das condições de iluminação fornecem uma leitura entre 1 e 4.
   2. Coloque a gaiola do mouse modificada no instrutor automático (Figura 2). Fixe a porta da gaiola ( Figura 1) e alinhe a pelota à borda da ranhura como no procedimento manual.
2. Execute a sessão de treinamento do mouse usando a interface do LabVIEW.
   1. Informações de entrada conforme necessário para registrar dados sobre a sessão de treinamento (Figura 3 e tabela 2).
      1. Clique no campo ID do mouse e digite o nome do arquivo de cada sessão de treinamento usando o teclado do computador.
      2. Clique no campo total de pelotas para dispensar durante a rotina para controlar quantas pelotas são dispensadas para um único experimento (geralmente 20-30). Para fazer isso, clique nas setas para cima e para baixo ou insira o número usando o teclado do computador.
      3. Clique no campo Pausar após o número da pelota para definir uma pausa de 5 s depois que a pelota indicada for removida da placa de mergulho. Para fazer isso, clique nas setas para cima e para baixo ou insira o número usando o teclado do computador.
      4. Clique no campo comprimento de pausa para definir uma pausa entre o momento em que um pellet é removido da placa de mergulho e o tempo que um novo pellet é dispensado. Para fazer isso, clique nas setas para cima e para baixo ou insira o número usando o teclado do computador
         Nota: geralmente 1 s é um tempo de pausa apropriado. Se os ratos estão ansiosos após cada pellet é dispensado, é aconselhável aumentar o comprimento de pausa usando o campo de comprimento de pausa para 5 s.
      5. Registre manualmente a distância na qual o pellet é colocado no campo distância do alcance . Para fazer isso, clique nas setas para cima e para baixo ou insira o número usando o teclado do computador
         Observação: o tamanho das matrizes de aceleração e tempo é exposto para fins de depuração e pode ser ignorado.
      6. Clique no campo pasta para conter logs para selecionar o local do arquivo para salvar os dados coletados.
      7. Depois que os campos de informações tiverem sido preenchidos, clique no botão executar para iniciar a sessão de treinamento. O instrutor automático distribuirá pelotas individuais e rastreará se eles caem através do funil até que o número total de pelotas tenha sido dispensado, e a última pelota tenha sido recuperada ou descartada pelo mouse. O programa irá parar automaticamente neste momento. Se necessário, ele também pode ser interrompido prematuramente clicando no botão parar .
   2. Uma vez que o software é configurado, coloque a casa-gaiola do mouse para ser testado no pedestal e observar o mouse para que você possa medir se o mouse tem realmente aprendeu a tentar o comportamento necessário romance atingindo. Depois de clicar no botão Run , permitir que o mouse para investigar o slot e seu novo, ambiente desconhecido.
      Nota: semelhante ao quando a introdução de ratos para o conceito de alcançar, esperar alguns ratos para ser mais complacente do que outros. Camundongos que entenderam o conceito deve tentar chegar dentro de 5-10 min e irá associar o movimento do instrutor automático com o pellet apresentado, como quando eles associam um slot descoberto com alimentos nos estágios iniciais deste protocolo.

Resultados

Em geral, é recomendável que cada sessão de treinamento consista em cerca de 20-30 tentativas, que podem ser definidas pelo usuário, executadas automaticamente pelo instrutor automático e salvas em um único arquivo de log por sessão e mouse. Cada teste pode ser executado consecutivamente, logo após o outro, com 2-5 s de pausa. Os ratos treinados no auto-instrutor exibem um aumento na habilidade sobre 10 sessões de treinamento.

P...

Discussão

Nosso auto-instrutor avalia o alcance-à-preensão do membro torácico (prehension) em uma maneira automatizada. Para atingir esse EndPoint, muitos dos parâmetros projetados para a tarefa de preensão do mouse, incluindo a colocação da pelota, o tamanho da pelota e os critérios de treinamento, foram iterados ao longo de vários anos e adaptados de protocolos anteriores^{2,5 ,6}. O avanço aqui é a automação da tarefa usando um robô que ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filamento ABS	Personalizado Impresso em 3D N	/ A	utilizado para porta-pellets, estrutura, braço e funil
Folha ABS	McMaster-Carr	8586K581	3/8 "de espessura; usado para componentes de plataforma, posicionamento de guias de suporte e base
Adruino Mini	Adruino	A000087	versão nano também compatível, bem como outros microcontroladores semelhantes
Suporte de Posicionamento	McMaster-Carr	9967T43	Capacidade de carga de 35 lbs.
Tubo Redondo de Acrílico Transparente	McMaster-Carr	8532K14	ID 3/8"
Baixo-Carbono  Fio de Aço	McMaster-Carr	8855K14	0.148"  Dispensador
Pellets	de diâmetro Lafayette Instrument: Neuroscience	80209-45	com roda de tamanho de pellet intercambiável de 45 mg e suporte opcional
Photointerrupter Breakout Board	SparkFun	BOB-09322 ROHS	projetado para Sharp GP1A57HRJ00F
Sensor de Objeto Reflexivo	Fairchild Semiconductor	QRD1113	saída de fototransistor
Servo Motor	SparkFun	S8213	engrenagem de metal genérico (tamanho micro)
Fotointerruptor Transmissivo	Sharp	GP1A57HRJ00F	gap: 10 mm, fenda: 1,8 mm