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Artigo de método

Caracterizar Mutants relacionados à doença da família da RAF kinases usando um conjunto de métodos práticos e viáveis

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DOI:

10.3791/59795

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17 de julho de 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program, Duke-NUS Medical School

Neste artigo

Resumo

Neste artigo, nós apresentamos um jogo de métodos práticos e viáveis para caracterizar mutantes doença-relacionados de kinases da família do RAF, que incluem o ensaio in vitro da quinase, o ensaio da coativação do RAF, e o ensaio rachado complementar do luciferase.

Resumo

O fibrosarcoma ràpida acelerado (RAF) quinases da família jogam um papel central na biologia de pilha e sua deficiência orgânica conduz aos cancros e às desordens desenvolventes. Uma caracterização de mutantes da RAF relacionados à doença nos ajudará a selecionar estratégias terapêuticas apropriadas para o tratamento dessas doenças. Estudos recentes mostraram que as cinases familiares da RAF têm atividades catalíticas e aloestericas, que são fortemente reguladas por dimerização. Aqui, construímos um conjunto de métodos práticos e viáveis para determinar as atividades catalíticas e aloestericas e a afinidade/estabilidade do dímero relativo das cinases familiares da RAF e seus mutantes. Em primeiro lugar, alteramos o ensaio de quinase in vitro clássico, reduzindo a concentração de detergente em buffers, utilizando um procedimento de lavagem rápida suave, e empregando uma fusão de glutationa S-transferase (GST) para evitar que os dímeros da RAF se dissociem durante Purificação. Isto permite-nos de medir apropriadamente a atividade catalítica de mutantes constitutivamente ativos da RAF. Em segundo lugar, nós desenvolvemos um ensaio novo da coativação do RAF para avaliar a atividade alostérico de mutantes da RAF da quinase-inoperante usando proteínas truncadas do RAF do N-terminal, eliminando a exigência de Ras ativas em protocolos atuais e conseguindo desse modo um mais elevado Sensibilidade. Finalmente, nós geramos um único ensaio complementar da luciferase da separação para medir quantitativamente a afinidade/estabilidade do dímero relativo de vários mutantes do RAF, que é mais de confiança e sensível comparado ao ensaio tradicional da co-imunoprecipitação. Em resumo, esses métodos têm as seguintes vantagens: (1) fácil de usar; (2) capaz de realizar eficazmente sem equipamento avançado; (3) custo-eficaz; (4) altamente sensível e reprodutível.

Introdução

As quinases da família RAF são um componente chave da cascata de sinalização Ras/Raf/MEK/Erk, que transmitem um sinal de RAS para ativar a proteína quinase ativada por mitogen (MEK)1,2,3,4. Esta família de quinases desempenha um papel crucial no crescimento celular, sobrevivência e diferenciação, e suas alterações induzem muitas doenças, notadamente o câncer5,6,7,8. Recentemente, os sequenciamentos de Genomic identificaram muitos mutantes doença-relacionados do RAF que exibem propriedades diferentes na transmissão do sinal de Ras/Raf/MEK/Erk cascata9,10,11. Uma caracterização cuidadosa dos mutantes da RAF nos ajudará a entender os mecanismos moleculares de como os mutantes da RAF alteram a saída de sinal da cascata RAS/RAF/MEK/ERK, eventualmente selecionam abordagens apropriadas para o tratamento de várias doenças movidas por mutantes da RAF.

As quinases da família RAF incluem três membros, CRAF, BRAF e Araf, que têm estruturas moleculares semelhantes, mas diferentes habilidades para ativar a sinalização a jusante1,2,3,4. Entre estes paralogs, braf tem a atividade a mais elevada em virtude de seu Motif constitutivamente fosforilada NTA (N-tirtual umcidic)12,13,14, quando Araf tiver o mais baixo atividade decorrente de seu motivo não canônico APE15. Isto pode explicar as freqüências diferentes da mutação de de do RAF nas doenças: BRAF > CRAF > Araf. Além disso, dentro do mesmo paralog do RAF, as mutações em locais diferentes podem provocar a sinalização a jusante em maneiras distintas, que adiciona uma outra camada de complexidade à regulação de kinases da família do RAF. Estudos recentes demonstraram que todas as cinases da RAF têm atividades catalíticas e alopestericas13,14,16,17,18. Mutantes constitutivamente ativos da RAF giram sobre a sinalização a jusante diretamente pela fosforilação MEK, enquanto os mutantes da RAF quinase-Dead podem transacionar seus homólogos do tipo selvagem através da dimerização lado a lado e ativar a sinalização de MEK-ERK16 ,19,20. A afinidade/estabilidade do dímero é um parâmetro-chave que não só determina a atividade alostômica de mutantes da RAF de quinase morta, mas também afeta a atividade catalítica de mutantes da RAF constitutivamente ativos15,21, 22. a quinase-mortos RAF mutantes com alta afinidade de dímero/estabilidade pode transacionar o Wild-Type endógena rafs diretamente15, enquanto aqueles com intermediário dímero afinidade/estabilidade requer uma coordenação de Ras ativas ou um nível elevado de moléculas de RAF do tipo selvagem para funcionar13,15,20,21,23. Similarmente, mutantes constitutivamente ativos do RAF fosforilar MEK em uma maneira dímero-dependente, e aqueles com baixa afinidade/estabilidade do dímero perdem sua atividade catalítica in vitro em cima da imunoprecipitação que quebra os dímeros fracos do RAF15, 21,22. A afinidade/estabilidade do dímero também determina a sensibilidade dos mutantes da RAF aos seus inibidores e correlaciona-se positivamente com a resistência dos inibidores da RAF24. Portanto, para caracterizar os mutantes da RAF relacionados à doença, é necessário medir suas atividades catalíticas e aloestericas e afinidade/estabilidade de dímero.

Nos últimos anos, nosso laboratório e outros desenvolveram vários métodos para caracterizar as cinases da família RAF e seus mutantes. De acordo com o nosso laboratório e a experiência dos outros, pensamos que os três ensaios seguintes têm vantagens na definição de mutantes da RAF relacionados com a doença: (1) o ensaio in vitro quinase que pode ser realizado com facilidade para detectar a atividade catalítica de constitutivamente mutantes ativos da RAF15; (2) o ensaio da co-ativação do RAF que é um método confiável e conveniente para medir a atividade alostérico de mutantes da quinase-inoperante RAF13,15,21,22,23, de 25; (3) o ensaio de luciferase de divisão complementar que tem sensibilidade muito maior na medição da afinidade/estabilidade do dímero relativo dos mutantes da RAF em contraste com o ensaio de co-imunoprecipitação tradicional, e é capaz de realizar sem equipamentos avançados em contraste com os métodos analíticos quantitativos como a análise de SPR (Surface Plasmon Resonance)15,22. Combinando estes três ensaios, nós podemos compreender facilmente como um mutante doença-relacionado da RAF altera a sinalização a jusante e utiliza desse modo uma estratégia terapêutica apropriada para tratar a doença causada por esta mutação do RAF.

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Protocolo

1. ensaio in vitro quinase para medir a atividade catalítica de mutantes da RAF

  1. Construa vetores codificando mutantes da RAF (Figura 1a) com tag Flag (dykddddk) no C-Terminus usando o conjunto Gibson ou métodos tradicionais de clonagem molecular.
    1. Introduza o Tag e as mutações da bandeira nas seqüências de codificação do RAF por PCRs, e insira então seqüências inteiras no vetor do pCDNA 3.1 (+) usando o conjunto de Gibson ou a ligadura do ADN T4 e seguindo os protocolos da manufatura. Use as seguintes condições para reações de PCR: (1) 95 ° c, 2 min; (2) 95 ° c, 30 s; (3) 59 ° c, 30 s; (4) 68 ° c, 3 min; (5) 20 ciclos de (2 a 4); (6) 4 ° c de retenção.
      Nota: Os primers de PCR para clonagem: 5-AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 e 5-CAGCGGGTTTAAACGGGCCCTCTA-3.
    2. Insira a sequência de codificação GST a montante de sequências de codificação de mutantes da RAF para gerar vetores que codificam mutantes da RAF fundidos por GST usando os mesmos métodos descritos na etapa 1.1.1.
    3. Valide todos os vetores por seqüenciamentos de DNA antes da transfecção.
  2. Placa 293T células em 6-bem placas em uma densidade de 5 x 105 células/bem um dia antes do transfection. Quando a densidade da célula atinge 80 ~ 90% confluência no segundo dia, transfecção com vetores de codificação Flag-Tagged RAF quinases ou seus mutantes da etapa 1,1 em células, seguindo o protocolo de fabricação de reagentes de transfecção (tabela de materiais).
  3. Substitua o meio de cultura 24 h após a transfecção.
  4. Aspirar o meio de cultura 48 h após a transfecção e adicionar 400 μL/poço de tampão de lise (25 mM TRIS · HCl, 150 milímetros NaCl, 1 milímetro de ácido ethylenediaminetetraacético (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) suplementado com os inibidores da protease e da fosfatase às pilhas do lyse no gelo.
    Nota: A concentração de NP-40 no tampão do lysis é crítica para detectar a atividade catalítica de mutantes do RAF com afinidade/estabilidade moderadas do dímero in vitro. Uma alta concentração de detergente ou um detergente forte no tampão de Lise pode quebrar dímeros da RAF e, assim, matar a atividade catalítica de cinases RAF ou seus mutantes.
  5. Transfira os lysates da pilha a um tubo de 1,5 mL, e gire para baixo por 12.000 x g por 10 minutos em 4 ° c para esgotar restos da pilha.
  6. Transfira 300 μL por amostra de lisados de células inteiras limpas para tubos de 1,5 mL, adicione 20 μL por amostra de grânulos de afinidade ANTIBANDEIRA e gire em uma sala fria (4 ° c) por 1 h. Igualmente tome 40 μl por a amostra do lisado inteiro limpo da pilha de lado para detectar a expressão e a atividade (phospho-ERK1/2) de mutantes do RAF por immunoblots como descrito abaixo.
  7. Lave os grânulos da anti-bandeira uma vez com tampão do lysis, então uma vez com tampão da reação da quinase (20 milímetros HEPES, 10 milímetros MgCl2, 0,5 mm na3vo4, 0,5 mm DTT, pH 7,2), e adicione 20 μl da mistura da reação da QUINASE (2 μg de MEK1 (K97A) e 100 μm ATP em 20 μL de buffer de ação) por amostra.
    Nota: A lavagem do grânulo deve ser terminada delicadamente e rapidamente, o amortecedor residual deve ser aspirado completamente antes de adicionar a mistura da reação da quinase, e todas as operações nesta etapa devem ser executadas em 4 ° c em uma sala fria.
  8. Incubar as reações da quinase à temperatura ambiente (25 ° c) durante 10 min, e vire os tubos contendo reações quinase com os dedos a cada minuto durante a incubação.
  9. Adicionar 5 μL de tampão de amostra de 5x SDS (375 mM TRIS · HCL, 9% Dodecil sulfato de sódio (SDS), 50% glicerol, 0, 3% bromophenol azul) por amostra para interromper as reações da quinase e, em seguida, aquecer as amostras a 90 ° c por 5 min.
  10. Execute as amostras na electroforese do gel do poliacrilamida 9 ~ 12% (página) com 0,1% SDS, transfira as proteínas à membrana do nitrocelulose, e detecte os níveis de mutantes de Phospho-MEK e de RAF nas amostras por immunoblots.
    Nota: O phospho-MEK também pode ser quantificado usando a incorporação de γ32P-ATP. Resumidamente, 10 μM γ32P-ATP é adicionado ao tampão de reação da quinase, e a quantidade de MEK fosforilado é então quantificada após a separação de página usando autoradiografia padrão, fosfoimagem ou técnicas de contagem de cintilação líquida como Apropriado.

2. ensaio de co-ativação da RAF para avaliar a atividade alopática da quinase-mutantes mortos da RAF

  1. Construa vetores que codificam o receptor do RAF (domínio da quinase de CRAF com motivo unphosphorylatable de NTA, aaff) ou os ativadores quinase-inoperantes do RAF (domínio da quinase do RAF com motivo da fosforilação-mimicked NTA, SSDD, ddee ou DGEE) (Figura 1A) como descrito na etapa 1,1.
  2. Transfect 293T Cells com dois vetores que codificam o receptor do RAF e o ativador da RAF da quinase-inoperante ou um único vetor que codifica uma das proteínas como descrito nas etapas 1,2 e 1,3.
  3. Substitua o meio de cultura em 24 h após o transfection, e ACTHR da colheita 293T em 48 h para preparar os lysates inteiros da pilha como descrito nas etapas 1,4 e 1,5.
  4. Misture o lisado inteiro limpo da pilha com o amortecedor da amostra de 5x SDS rapidamente na temperatura ambiente (° c 25) e ferva então em 90 ° c por 5 minutos.
  5. Execute as amostras de lisado de células inteiras fervidas em 9 ~ 12% PAGE com 0,1% SDS, transfira as proteínas para a membrana de nitrocelulose e detecte os níveis de Phospho-ERK1/2 e controle as proteínas por immunoblots.

3. ensaio Split luciferase de cortesia para medir a afinidade de dímero relativo/estabilidade de mutantes da RAF

  1. Construir vetores que codificam mutantes marcados com FLAG RAF fundidos no N-Terminus de nluc (N-Terminus de Firefly luciferase, Aa2-416) ou no C-Terminus de cluc (C-Terminus de Firefly luciferase, aa398-550) conforme descrito na etapa 1,1.
  2. Transfect 293T Cells com um par de vetores que codificam mutantes diferentes de nluc-RAF e mutantes de cluc-RAF como descrito em etapa 1,2.
  3. Em 24 h após o transfection, mas os ACTHR da pilha 293T em placas pretas da imagem de Krystal na densidade da pilha de 2x105 por bem com meio cor-livre (isto é, DMEM sem o vermelho do phenol).
  4. 24 h mais tarde, adicione D-luciferin (0,2 mg/mL) aos transfectants da pilha 293T, incubar por 30 minutos, e meça os sinais do luciferase usando um multi sistema da deteção (tabela dos materiais).
  5. Após a medição dos sinais de luciferase, aspirar os transfectantes médios e de lyse 293T com tampão de Lise para preparar os lisados de células inteiras, conforme descrito nas etapas 1,4 e 1,5.
  6. Execute as amostras inteiras do lisado da pilha em 9 ~ 12% Page com 0,1% SDS e detecte os níveis da expressão de mutantes de nluc-RAF e de mutantes de cluc-RAF pelo immunoblot da anti-bandeira como descrito na etapa 2,5. Os níveis relativos da expressão do mutante de nluc-RAF e do mutante de cluc-RAF em ACTHR 293T são quantificados usando a imagem J de seus immunoblots.
  7. Normalize os sinais da luciferase de ACTHR da pilha 293T de acordo com os níveis da expressão de mutantes de nluc-RAF e de mutantes de cluc-RAF. Momentaneamente, isto é conseguido dividindo o sinal cru do luciferase pelos níveis relativos da expressão de mutantes de nluc-RAF e de mutantes de cluc-RAF da etapa 3,6.

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Resultados

As quinases da família RAF têm atividades catalíticas e aloestericas, que permitem que seus mutantes relacionados à doença ativem a sinalização a jusante através de diferentes mecanismos13,14,16,17 ,18. Os mutantes da RAF constitutivamente ativos fosforilar diretamente seus substratos, enquanto os mutantes da RAF quinase-Dead cumprem sua função através da tra...

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Discussão

Neste artigo, nós apresentamos três métodos para caracterizar Mutants doença-relacionados do RAF, que incluem o ensaio in vitro da quinase, o ensaio da coativação do RAF, e o ensaio rachado complementar do luciferase. Uma vez que a RAF quinases tem atividade catalítica e atividade alostômica, vários mutantes da RAF podem ativar a sinalização a jusante através de dois mecanismos distintos13,14,16,17

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores gostariam de reconhecer a bolsa de leucemia de células peludas para o apoio de Yuan Jimin. Este trabalho foi apoiado pela Ásia fundo Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge financiamento Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF Bridging Grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF Pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), e SHF medicina acadêmica Subvenção à investigação (AM/TP011/2018).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
anti-phosphoERK1/2Cell Signaling Technologies4370
anti-phosphoMEK1/2Cell Signaling Technologies9154
anti-ERK1/2AB clonalA0229
anti-MEK1/2Cell Signaling Technologies9124
anti-FLAG (mouse)Sigma-AldrichF3165
anti-HANovus BiologicalsMAB6875
anti-FLAG (Coelho)Cell Signaling Technologies14793
anti-β-actinaSigma-AldrichA2228
contas anti-FLAG (M2)Sigma-AldrichA4596
HRP-conjugado anti-mouse IgGJackson Laboratories115-035-003
HRP-conjugado IgG anti-coelhoJackson Laboratories111-035-144
pcDNA3.1(+)In vitrogenV79020
Gibson Assembly Cloning  KitNew England BiolabsE5510
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
Fugene 6Roche11 814 443 001
DMEM sem vermelho de fenolInvitrogen21063-029
D-luciferina GoldBioLUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  preparado em nossos estudos anterioresN.A.Referência 15.
Sistema de detecção GloMax-Multi.PromegaE7041

Referências

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