Manipulação de padrões de cores em aranhas pulando para uso em experimentos comportamentais

Resumo

O objetivo deste protocolo é manipular os padrões de cor de aranhas saltitantes e outros artrópodes muito pequenos com tinta, a fim de estudar questões relacionadas com a seleção sexual, canibalismo sexual, predação, aposematismo, ou qualquer outro campo de coloração animal.

Resumo

No campo da ecologia comportamental, muitos experimentos são projetados para investigar os propósitos evolutivos de traços coloridos no contexto da seleção e predação sexual. Os métodos são vários, mas principalmente consistem em modificar os padrões de cores de indivíduos com diferentes corantes. Tais técnicas têm sido utilizadas em muitos táxons de vertebrados, particularmente em aves, mas permaneceram subdesenvolvidas para os invertebrados devido à dificuldade de manipular eficazmente a cor em pequenos organismos. Em vez disso, para manipular a aparência de invertebrados, os cientistas geralmente modificaram o ambiente de iluminação para filtrar certos comprimentos de onda. Entretanto, tal método afeta não somente o traço fenotípico do interesse mas a aparência inteira do indivíduo e de seu cerco. Aqui, reduzindo as técnicas utilizadas anteriormente em aves coloridas, apresentamos formas de manipular as cores de pequenos artrópodes, utilizando espécies igualmente emblemáticas mas subestudadas: as coloridas aranhas saltitantes.

Introdução

Os animais muitas vezes têm padrões de cores elaborados que eles exibem durante encontros sexuais, encontros agonísticos, ou para deter a predação. Essas características podem transmitir informações para receptores como a qualidade individual do signaler como um companheiro¹, capacidade de combate como um concorrente², ou palatabilidade como um item de presa³. Para entender os propósitos adaptativos de traços coloridos, os pesquisadores projetaram experimentos que envolvem manipular cores de várias maneiras. Alguns pesquisadores usaram estímulos de chamariz coloridos, como modelos^4,5,6,7,8, fotografias⁹ou vídeos^{10,11, 12} que são apresentados aos receptores em experimentos comportamentais. Outros, especialmente ao usar invertebrados, têm manipulado o ambiente de iluminação para afetar o aparecimento de cores de indivíduos vivos^{13,14,15,16, 17}. All estas manipulações, quando engenhoso, têm a desvantagem de remover o comportamento natural potencial importante e/ou de afetar muito mais do que a característica do interesse. Em grandes vertebrados, como aves, os pesquisadores muitas vezes manipulam a cor diretamente em animais vivos (revisado em Hill e McGraw, 2006¹⁸). Penas individuais ou bicos foram diretamente coloridos com marcadores^{2,19,20,21,22,23,24}, corantes contendo peróxido de hidrogênio usado frequentemente em isqueiros de cabelo²⁵,^26,27, ou várias tintas, incluindo unha polonês²⁸. Em invertebrados, tais estudos que manipulam padrões de cor diretamente em animais vivos são comparativamente raros, mas ainda forneceram imensa visão sobre a função e evolução da cor^{29,30,31 ,32,33,34,35,36}, 37, 38,³⁹. Mesmo os estudos de artrópodes parecem ser tendenciosos para os táxons maiores que podem ser mais facilmente manuseados e pintados, deixando padrões de cor em espécies muito pequenas relativamente subestudadas.

Aqui, nós descrevemos uma técnica delicada da manipulação da cor que seja desenvolvida para táxons animais muito pequenos. Especificamente, este método envolve manipular a coloração facial de aranhas de salto masculinas um microscópio a fim investigar a importância de tais traços coloridos no contexto da escolha do companheiro e do Cannibalism sexual. Neste caso, utilizou-se o habronattus pyrrithrix (coletado de Phoenix, AZ, EUA) como espécie-modelo (Figura 1). Nós publicamos os resultados do trabalho experimental usando algumas dessas técnicas em outros lugares^38,39, mas aqui descrevemos os métodos em mais detalhes do que foi feito anteriormente, de uma forma que deve torná-los acessíveis a outros ou adaptá-los para uso em outros táxons muito pequenos. Tais protocolos devem abrir oportunidades experimentais em animais que podem ser tão coloridos como os pássaros mais emblemáticos, mas que geralmente são subestudados.

Protocolo

1. preparação do equipamento

1. Selecione tintas apropriadas.
   1. Para aplicação bem-sucedida, use tintas que são de secagem rápida e têm uma textura que é facilmente manipulado com mais fino. Os produtos que têm sido usados com sucesso incluem não-impermeável delineadores que pode ser diluído com água, e tintas de esmalte que pode ser diluído com esmalte mais fino (tabela de materiais).
   2. Ao pintar aranhas, considere que a carapaça da maioria das espécies tem um exoesqueleto endurecido, enquanto o abdômen mole muitas vezes se estende e contrai com a alimentação⁴⁰.
      1. Tintas de esmalte produzem um revestimento sólido e endurecido na superfície pintada; Portanto, aplique-os em partes duras da cutícula (por exemplo, carapaça, pernas, pedipalps). Tais revestimentos de esmalte são menos eficazes para a aranha, porque eles descascam fora da aranha como o abdômen muda de forma com a alimentação.
      2. Em contraste, os delineadores não produzem um revestimento endurecido, mas um pouco de escoar nas escalas coloridas do corpo; como tal, usá-los em ambas as partes do corpo duro e macio (incluindo a aranha de Alice).
         Nota: nos próximos passos, a técnica mais delicada é apresentada que consiste em pintar o rosto e pedipalps das aranhas; a pintura do esmalte é usada, que é o método o mais generalizáveis devido à diversidade da cor da pintura do esmalte disponível.
   3. Antes de testar tintas em animais vivos, se possível, primeiro medir as propriedades espectrais da tinta (simplesmente aplicado a papel ou outra superfície) usando um espectrofotômetro UV-VIS reflectância para garantir que não existem quaisquer picos de UV indesejados no espectro que seria invisível para os seres humanos, mas possivelmente visíveis para as espécies estudadas.
2. Use um microscópio de dissecação conectado a uma câmera e a um computador para tirar mais facilmente fotos do resultado da manipulação para documentação e aumentar a replicabilidade (tabela de materiais).
   1. Ative o microscópio, o computador e o software que processa a entrada da câmera.
   2. Selecione o zoom relevante no qual a imagem final será tirada.
   3. Stick um inseto pino de montagem ou uma pequena unha (com a cabeça apontada para fora) em uma bola de não-endurecimento de argila de modelagem (aproximadamente o tamanho de uma uva). (A aranha viva a ser pintada será montada temporariamente à cabeça deste pino na etapa 3,1 abaixo). Coloc a argila e o pino de modelagem o microscópio para ajustar os objetivos de modo que se concentrem aproximadamente na cabeça do pino (onde a aranha deve ser montada).
   4. Certifique-se que os objetivos estão na distância certa para os olhos do pintor, e que a câmera não está obstruindo o campo de visão durante a pintura (como é o caso se a câmera é montada em um dos oculars, dificultando a percepção de profundidade).
3. Transfira a aranha para um frasco para injetáveis de plástico limpo (cerca de 12 drams, sem qualquer webbing ou presa morta).
4. Prepare equipamentos de montagem e pintura.
   1. Coloque um pino de montagem de inseto fino extra em uma bola de argila de modelagem não endurecida (além da usada na etapa 1.2.3) e coloque-as no lado esquerdo do microscópio (para pessoas destros). Este pino será usado para ajustar suavemente as posições das pernas da aranha e pedipalps (conforme necessário) durante a pintura.
   2. Obter um pequeno pedaço de papel absorvente (como uma toalha de papel), um pedaço de papel de impressora branca, as tintas para aplicar (aqui, pintura de esmalte), recipientes separados de diluente de tinta (um para cada cor mais um mantido transparente e limpo), Micro escovas individuais para cada cor (ver tabela de materiais), e um micro pincel para ser usado apenas com diluente limpo, todos posicionados de forma organizada à direita do microscópio (para pessoas destros).
   3. Usando um palito de dente, adicione uma gota de tinta em um prato de plástico aberto (como uma pequena placa de Petri ou uma tampa do frasco) e adicione diluente de tinta, por exemplo, com uma pequena seringa. Misture os dois com o palito à consistência certa (quando a tinta é completamente homogeneizada, mas não muito corrimento) testando-a no papel da impressora branca com uma escova micro.
      Nota: em certos casos, se a tinta secar rapidamente, prepare-a com um pouco mais de líquido do que o desejado para a aplicação, e deixe as escovas mergulhar no pote de diluente de tinta até o uso posterior (passo 4).
   4. Coloque uma gota de tamanho de ervilha de cola à base de água (ver tabela de materiais) em um canto do papel da impressora.
      Nota: esta deve ser a última etapa da preparação e o próximo passo precisa acontecer imediatamente após isso, de modo que a cola não secar.

2. anestesiando a aranha

1. Com a aranha no frasco e uma mão mãos colocadas sobre a abertura para impedir o escape, adicione lentamente o gás de co₂ até que o terceiro par da aranha das pernas se estende a 180 graus.
2. Use um tempo de exposição ao CO₂ de aproximadamente 20 segundos a 1,5 minutos, dependendo do tamanho médio da espécie e da aranha individual. Nós encontramos a extensão do terceiro par de pernas para ser um indicador confiável do nível adequado de anestesia em H. pyrrithrix, mas isso provavelmente varia entre as espécies. Se usar essas técnicas com uma espécie diferente pela primeira vez, primeiro teste a anestesia em alguns espécimes para avaliar sua resposta.
3. Dê aranhas tão pouco CO₂ quanto possível para conseguir o nível necessário de anestesia. Enquanto os curtos períodos de anestesia descritos aqui não produziram mortalidade (e sem diferenças comportamentais perceptíveis de aranhas não anestesiadas), dar a todos os animais em um experimento níveis iguais de anestesia (incluindo controles Sham).
4. Manter o frasco fechado após a adição de CO₂ para manter a aranha anestesia; Portanto, inclua esse tempo ao calcular quanto tempo a aranha é exposta ao CO₂.
5. Uma vez que a aranha foi removida do frasco para começar a manipulação de cor, ele vai ficar totalmente anestesiado por aproximadamente 1 a 2 minutos; Portanto, execute as seguintes etapas (seções 3-6) prontamente. Por causa desta janela de tempo limitado, tente o seguinte método da pintura com espécimes inoperantes primeiramente (para a prática) antes de tentar pintar aranhas ao vivo.

3. montagem da aranha o microscópio

1. Adicione uma quantidade muito pequena de cola na cabeça do pino de montagem ou unha na argila de modelagem preparada no campo de visão do microscópio.
   Nota: Use a menor quantidade de cola que permite manter a aranha no lugar para garantir que i) a aranha não deslizar fora da cabeça de alfinete (se demasiada cola é usado), e II) a aranha consegue libertar-se depois de acordar.
2. Deslize suavemente a aranha anestesiada do frasco para injetáveis para a mesa com o lado ventral para cima.
   Nota: porque as aranhas ' o abdômen é macio, cuidado deve ser tomado para não bater ou deixar cair as aranhas na tabela, porque esta pode causar ferimento.
3. Pressione suavemente a cabeça de alfinete (com cola) no esterno da aranha (a área central onde as pernas da aranha anexar ao corpo) de tal forma que a aranha vai levemente saltar e estender as pernas a pequena pressão aplicada. Para o controle extra da pressão aplicada, prenda a argila de modelagem com ambas as mãos, tendo ambas as mãos estabilizou firmemente de encontro à tabela.
4. Reposicione a argila de modelagem o microscópio para que a área a pintar esteja voltada para cima e em foco.

4. pintando a aranha

1. Avalie a consistência da tinta antes de tocar o pincel para a aranha.
   1. Reteste a consistência da tinta (use o papel absorvente para limpar os pincéis se eles foram mantidos no diluidor), ajuste novamente se necessário, e sempre primeiro tente aplicar tinta no papel da impressora para controlar a quantidade de tinta contida nos pêlos da escova.
   2. Com a mão direita e ao olhar através do microscópio, traga a ponta da escova no campo da visão, e certifique-se (uma segunda vez) que os cabelos da escova não contêm demasiada pintura, nesse caso limpe algum dele no papel da impressora.
2. Teste a consistência da tinta na aranha.
   1. Toque a aranha com a escova na maior área que terá de ser pintado sobre. Isto informará o pintor se a consistência e a quantidade de pintura são direitas (istoé, quando a pintura ligeiramente e embebe lentamente no cabelo/escalas da aranha).
      1. Se nenhuma pintura é aplicada, mergulhe a escova na pintura e retorne à etapa 4,1 para repetir o procedimento.
      2. Se a tinta absorve rapidamente e derrama sobre em uma área que não deve ser coberta pela pintura, e supondo que o derramamento é mínimo e que o indivíduo poderia ainda tomar parte na experimentação, limpe a escova no papel absorvente e retorne-o à etapa 4,1 para repetir o procedimento.
         Nota: este tipo de derramamento de líquido não pode ser corrigido. Se o derramamento atinge as quelíceras ou os olhos, ou outras partes que podem ser letais ou tóxicos para o indivíduo, considere colocar a aranha imediatamente no congelador para eutanizar-lo antes que ele acorda e excluindo a aranha do experimento.
3. Pinte todas as áreas que precisam de cores seguindo as etapas 4,1 e 4,2.
   1. Se pintar a face da aranha, use o pino extra fino com a mão esquerda para segurar as pernas dianteiras e pedipalps (de modo que eles vão estar fora do caminho do pincel). Isto é feito melhor ao olhar através do microscópio para evitar danificar os apêndices da aranha. Além, se pintando a cara da aranha, e dependendo das escovas usadas para pintar, considere pintar ambos os lados da cara antes de tentar pintar a parte central entre os olhos-ambas as áreas pintadas podem ser juntadas segurando a escova paralela à cara da aranha e induzindo a ação capilar.
      Nota: ao pintar a face da aranha, é mais fácil pintar primeiro o lado mais próximo da mão dominante, e depois girar a bola de barro (com a aranha montada) ao redor o microscópio para pintar o outro lado, seguido pelo meio.
   2. Ao pintar pedipalps ou pernas, certifique-se de não tocar em quaisquer articulações se a pintura é um endurecimento (como a pintura de esmalte), e certifique-se de não aplicar a tinta para os órgãos de parto do esperma do macho (na parte inferior do segmento distal do pedipalps).

5. tomando a imagem da aranha

1. Alterne o objetivo para o modo de câmera.
2. Tire uma foto usando o software de computador, certificando-se de que o zoom escolhido é o selecionado no microscópio, de modo que uma barra de escala pode ser adicionada.

6. liberando a aranha do pino ou prego

1. Quando a aranha começa a se mover, segure o pino para que as pernas dianteiras da aranha estão tocando o frasco de aranha.
2. Deixe a aranha liberar-se, e se necessário, incline suavemente o pino para ajudar a aranha puxar-se longe da cola seca.
   1. Se a aranha acordar antes que a pintura esteja terminada, permita que a aranha pelo menos 15 minutos recupere antes de ser anestesiada outra vez. Se isso for feito, assegure-se de que todos os grupos tenham os mesmos níveis de anestesia (incluindo indivíduos tratados com Sham, se aplicável).
      Nota: aranhas parecem retomar seu comportamento normal rapidamente após a manipulação (< 15min), mas recomendamos um tempo de descanso padronizar de 12 horas antes de usar a aranha em um teste comportamental.

7. análise do comportamento das aranhas

1. Compare o comportamento de indivíduos não manipulados, tratados com Sham e manipulados para avaliar a potencial toxicidade da aplicação (que pode variar de acordo com o tipo específico de tinta, cor, área de aplicação e espécies de estudo). Comportamento relevante para comparar poderia incluir taxa de atividade, tipo de atividade realizada, sucesso na realização de atividades específicas (por exemplo, capturando presas), etc.
   1. Use aranhas tratadas com Sham como parte do experimento experimental (por exemplo, recebendo a aplicação de tinta em uma área não visível ou com tintas de cor neutra aplicadas às mesmas áreas), a fim de alterar apenas a cor do indivíduo enquanto controla para outros factores (por exemplo, tempo de manuseamento, odor, textura superficial, etc.).
      Nota: se pintar pernas ou pedipalps, considere a possibilidade de que isso pode interferir com os pêlos sensoriais (prevalentes em pernas de aranha e pedipalps, ver Foelix 2010⁴⁰) e, nestes casos, os machos Sham-tratados devem ter tintas de cor neutra aplicadas ao mesmas áreas como um controle.
   2. Ao desenvolver novos métodos, compare aranhas pintadas com aranhas não manipuladas para avaliar se os indivíduos manipulados por cores ainda se comportam normalmente.

8. medindo as propriedades da reflectância da manipulação da cor no assunto pintado

1. Uma vez eutanasiada (depois que as aranhas foram envolvidas em um experimento ou especificamente eutanasiada para esse fim, veja nota abaixo), Meça as propriedades espectrais da manipulação de cores usando um espectrofotômetro portátil UV-VIS padrão (tabela de materiais ), especialmente para áreas maiores que 1 mm de diâmetro.
2. Para as áreas menores, use um microespectrofotômetro personalizado-construído (um espectrofotômetro UV-VIS distribuído através de um microscópio) para umas medidas mais fáceis e mais precisas, embora a ótica do microscópio cortou a luz UV, significando que as medidas são limitadas ao comprimentos de onda humanos-visíveis (ver Taylor et al. 2011⁴¹).
3. Nos casos em que as áreas manipuladas por cores são extremamente pequenas e os dados de reflectância UV são necessários, use microespectrofotômetros UV-VIS comercialmente disponíveis, embora sejam mais caros (ver Taylor et al. 2014⁴²).
   Nota: a fonte luminosa de espectrofotômetros UV-VIS contém luz UV e pode ser perigosa para os olhos dos animais (incluindo o nosso) para que as medidas espectrais só devam ser feitas após os animais serem sacrificados e não meramente anestesiados. Para aranhas pintadas de esmalte, isso pode ser feito depois que as aranhas têm sido usadas em experimentos, já que a tinta não se desgasta (veja os resultados representativos abaixo). Para a pintura à base de água que pode às vezes desvanecer-se após dias ou semanas, um jogo das aranhas poderia ser sacrificado para a medida na altura em que sua contraparte estaria envolvida em uma experimentação (para capturar os dados que refletem a manipulação de cor real usada no experimento). Relatar as propriedades espectrais das tintas permitirá a replicação por outros pesquisadores que podem querer replicar a manipulação de cores, mas não têm acesso aos mesmos produtos de pintura específicos.

Resultados

Eficácia da manipulação de cores

Usando essas técnicas, vários graus de manipulação de cores são eficazes, incluindo a ocultação de cores completamente ou reduzindo ou aumentando sua intensidade. Isso é evidente em ambas as fotografias e medições da reflectância espectral (figura2, Figura 3e Figura 4). Aqui nós mostramos o macho cor-manipulado pyrrithrix de habronattus comparado aos machos Red-faced naturais. As propriedades espectrais foram medidas usando um espectrofotômetro UV-VIS (ver tabela de materiais) que pode medir precisamente áreas coloridas tão pequenas como 1mm de diâmetro. As medições foram tomadas em relação a uma reflectância difusa padrão branco (ver tabela de materiais).

Em raras ocasiões (5 em 108 machos pintados com delineador preto 1 (ver tabela de materiais) em seu rosto), o delineador solúvel em água começou a desgastar as faces das aranhas depois de uma semana ou duas. Isso não foi observado para a outra marca de delineador (delineador 2; Ver tabela de materiais). Em ambos os casos, as gaiolas da aranha foram pulverizadas com água três a cinco vezes por a semana. Diferentes condições de manutenção podem afetar o desgaste da tinta à base de água. A pintura do esmalte ainda estava intacta para todos os machos manipulados (n = 221), mesmo para aqueles ainda vivos após 6 meses.

Potencial toxicidade da manipulação de cores

Deve-se evitar obter tinta sobre os olhos das aranhas, de modo a não obstruir a sua visão, nem em suas chelicerae, partes da boca e outros orifícios, e possivelmente outras partes do corpo mole para evitar a ingestão e envenenamento possível. Um deve igualmente ser cuidadoso com as junções ou as peças da pintura que contêm os cabelos sensoriais (tais como as pernas e os pedipalps) de modo a para não restringir sua mobilidade ou sistema sensorial. Entretanto, se tais manipulações da cor nestas regiões do corpo forem necessárias, ou se há alguma dúvida sobre a possibilidade de efeitos negativos sutis, é então o melhor aplicar pinturas aos indivíduos em todas as categorias do tratamento. Desta forma, evitaria acidentalmente manipular os sistemas sensoriais de indivíduos de maneiras que podem ser tendenciosos contra um dos tratamentos apenas. Por exemplo, em um experimento usando machos manipulados mostrados na Figura 4, o objetivo foi aumentar e diminuir o número de manchas vermelhas exibidas pelos machos durante o namoro. Desde que alguns machos começ suas faces vermelhas naturais escondidas com a pintura cinzenta do esmalte (para diminuir a quantidade de vermelho indicado), os outros machos para que nós quisemos manter uma cara vermelha foram pintados vermelhos sobre sua cara naturalmente vermelha com o mesmo produto que o cinzento-enfrentado Machos. Similarmente, desde que nós quisemos adicionar remendos vermelhos ao Pedipalpo em determinados machos para aumentar a quantidade de remendos vermelhos da cor indicada, a pintura cinzenta foi usada para cobrir o Pedipalpo de outros machos de modo que todos os machos fossem pintados nesta área sensível (veja Figura 4) . Embora preferível, esta estratégia pode nem sempre ser viável. Por exemplo, em outro experimento, a coloração vermelha foi removida usando um delineador preto dando a mesma propriedade espectral que a cutícula subjacente do macho, deixando as outras cores masculinas intactas e naturais (Figura 2). Neste caso, para machos de aparência natural, a mesma quantidade de delineador foi aplicada à área no topo de sua carapaça logo atrás de seus olhos mediana anterior (uma área que não é claramente visível para as fêmeas), para controlar o odor potencial ou toxicidade global do Produto. No entanto, o local onde a pintura é aplicada pode afetar as aranhas de forma diferente. Portanto, para avaliar diferenças sutis no caminho ou no local onde a tinta foi aplicada pode ter sobre a integridade da aranha, o comportamento de ambos os tipos de machos em um contexto que foi relevante para nossas hipóteses (em relação à escolha de acasos e canibalismo sexual) foi comparada. Os machos foram colocados dois por dois na presença de uma fêmea, e comparamos o seu atraso para tornar-se ativo, o seu atraso para cortegar, e a duração total que passaram corteando com modelos de efeito misto linear geral (usando a função lmer com o pacote R lme4⁴³ na versão R 3.5.2⁴⁴ com a identidade feminina como um efeito aleatório, e usando o critério de máxima verossimilhança para obter valores-p). Neste caso, todas as comparações não revelam diferenças entre os tratamentos (ver tabela 1) e, portanto, concluiu-se que não introduzimos um viés em favor de uma ou outra categoria de tratamento.

Em ambos os casos, quando se apresentam categorias de tratamento muito semelhantes (Figura 4), ou apenas indivíduos tratados com Sham (figura2 e Figura 3), os pesquisadores devem avaliar como suas espécies-modelo são afetadas pela tinta que usam e garantir que Eles ainda se comportam de forma semelhante e ecologicamente relevante. Pode-se registrar dados para avaliar os possíveis efeitos da toxicidade, tanto quanto possível, por exemplo, comparando as taxas de atividade entre indivíduos tratados e não manipulados. Nossas aranhas pintadas com tinta de esmalte como na Figura 4 foram comparadas com machos não manipulados em um contexto de outra forma idêntico. Especificamente, os machos foram introduzidos isoladamente em uma gaiola fêmea e seu atraso para deixar o frasco, demora para cortegar e cortegar a taxa (antes da copulação, e antes de ser atacada ou canibalizada) foram comparados. Não foram encontradas diferenças (quando se utilizam modelos de efeito misto linear semelhantes como acima) e, portanto, concluímos que nossos machos pintados se comportaram naturalmente (tabela 2).

Finalmente, é importante notar que qualquer aranhas nos experimentos (geralmente fêmeas) que canibalizados cor-manipulados machos nunca apareceu a sofrer de efeitos negativos. As aranhas digerem suas presas externamente, geralmente deixando as áreas pintadas da cutícula para trás. No entanto, se adaptar este método para outros sistemas onde os animais manipulados por cores serão consumidos, deve-se avaliar os riscos potenciais de toxicidade.

Figura 1 . Macho adulto do habronattus pyrrithrix que ilustra como minúsculo suas regiões coloridas do corpo são. Fotografado por Lyle Buss. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 . Manipulação de cor experimental usada para esconder a coloração facial vermelha em habronattus pyrrithrix. (A) a coloração facial vermelha intacta antes da manipulação da cor. (B) a coloração facial do mesmo macho após a ocultação da coloração vermelha natural com delineador preto 1. (C) espectros de reflectância representativos para a face vermelha natural, a cutícula preta subjacente natural, e a face vermelha pintada com delineador preto 2. Modificado de Taylor e McGraw 2013³⁹. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 . Manipulação de cor experimental usada para reduzir o tamanho e vermelhidão do remendo facial vermelho do macho habronattus pyrrithrix. (A) a coloração facial vermelha intacta antes da manipulação da cor. (B) a coloração facial do mesmo macho depois de aplicar delineador preto diluído (Urban Decay) para a parte dianteira da face, e delineador preto não diluído ao longo das bordas do adesivo facial para reduzir o tamanho da área vermelha. (C) curvas espectrais médias de machos controle Sham-tratados (n = 21) e machos cor-manipulados (n = 21), comparados com a média da população (n = 57) e os 10 machos drabbest de um estudo precedente⁴¹. Figura reproduzida de Taylor et al. 2014³⁸. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 . Manipulação de cor experimental usada para modificar a cor do remendo facial vermelho do macho Habronattus pyrrithrix. Homens de habronattus pyrrithrix pintados com (A) vermelho, (B) vermelho e cinzento, e (C) pintura cinzenta do esmalte sobre sua cara vermelha natural e pedipalps naturalmente creme-coloridos. (D) curvas espectrais médias para machos não manipulados (n = 9) e machos com a face coberta com tinta de esmalte vermelho (n = 9). Aplicando um vermelho mais brilhante sobre a cara da aranha, nós realçou eficazmente sua coloração facial vermelha. Porque a pintura do esmalte cobre inteiramente as escalas subjacentes, a cor poderia igualmente ser mudada inteiramente, como é o caso com o esmalte cinzento. (E) neste experimento, tintas de esmalte vermelho e cinza foram escolhidas para serem combinadas para o brilho total (reflectância total sobre a faixa de comprimentos de onda visíveis para essas aranhas). As diferenças na escala dos eixos Y em D e e são devidas a diferentes técnicas (como distância da amostra e tamanho das áreas medidas) para medir amostras de cor em papel (e) versus medições diretas de cores na face da aranha (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

N	Variável dependente	P	T	Encarnado	± SE	Preto-enfrentou	± SE	o nFID
202b	Atraso masculino para deixar o prato	0,35	-0,93	140,0	23,9	109,8	23,9	102
179c	Atraso masculino à corte	0,74	0,33	983,4	127,1	1031,0	126,5	95
204a	Esforço masculino do namoro	0,52	0,63	181,2	24,4	203,0	24,4	102
204a	Esforço masculino do namoro antes de todo o ataque	0,41	0,68	89,0	15,7	97,5	15,7	102

Tabela 1. Efeito da manipulação da cor da face masculina no comportamento, quando pintado com delineador preto versus Sham Tratado (Figura 2). A estrutura de cada modelo é dada, bem como as estimativas médias em segundos (± SE) para cada grupo de tratamento. N = número de machos, p e t = valor-p e t-valor para o tratamento masculino, nFID = o número de níveis na identidade feminina de efeito aleatório. ^um Dos 104 testes masculinos realizados, 102 foram registrados com sucesso, levando a 204 machos únicos observados. ^b2 machos foram canibalizados pela fêmea antes de sempre sair da placa de Petri. ^c25 machos foram canibalizados pela fêmea antes de cortejá-lo.

N	Variável dependente	P	T	Pbpcs	± SE	Pintado	± SE
32a	Atraso masculino para deixar o prato	0,87	-0,17	380,8	143,1	345,4	152,4
31 deb	Atraso masculino à corte	0,93	-0, 9	502,6	105,8	488,1	116,6
31 deb	Esforço masculino do namoro	0,74	-0,33	2324,3	455,0	2102,1	484,4
31 deb	Esforço masculino do namoro antes de todo o ataque	0,68	0,42	1495,1	450,8	1770,1	479,9

Tabela 2. Efeito da manipulação da cor da face masculina no comportamento, quando pintado com tinta de esmalte vermelho ou cinza (n = 15, Figura 4) versus machos não manipulados (n = 17). A estrutura de cada modelo é dada, bem como as estimativas médias em segundos (± SE) para cada grupo de tratamento. N = número de machos, p e t = valor-p e t-valor para o tratamento masculino. ^um17 machos não manipulados foram comparados a um subconjunto de todos os machos pintados em nosso experimento (n = 221). Especificamente, foram comparados a 15 machos pintados (5 vermelho (Figura 2a), 5 vermelho e cinza (Figura 2b) e 5 cinza (Figura 2C)) testados no mesmo contexto (na presença de uma fêmea) e no mesmo período de tempo específico. Isso é importante porque os machos não manipulados foram testados no final do experimento (em agosto e setembro de 2018), o que corresponde ao final de sua época de reprodução natural e onde os machos são geralmente menos ativos. Manter todas essas outras variáveis iguais nos permite comparar o tratamento da pintura sem a introdução de outras vieses. ^b Um macho (todo cinzento) foi canibalizado antes de sempre cortejá-lo.

Discussão

Aqui, mostramos que as cores de pequenas partes do corpo de artrópodes podem ser efetivamente manipuladas usando corantes como tintas de maquiagem e esmalte.

O primeiro passo crítico para conseguir tal manipulação delicada é ser capaz de imobilizar pequenos animais que geralmente não podem ser contidos na mão. Aqui, para ser capaz de pintar áreas sensíveis, como o rosto de aranha pulando, nós anestesiados indivíduos com CO₂ e montados-los na cabeça de um alfinete. Isto permite que o trabalho perto dos olhos da aranha com menos stress do que a aranha provavelmente experimentaria se estivesse acordado (com a luz do microscópio brilhando em seus rostos durante o processo de pintura).

O método também requer a obtenção de micro escovas de boa qualidade, e, mais criticamente, substâncias corantes apropriadas. A etapa a mais difícil em aplicar a pintura sem derramamento mas com boa cobertura é começ a consistência direita. Conseqüentemente, as substâncias da coloração precisam de ser diluídas facilmente com um diluidor, e secado facilmente para fora para engrossar. Diferentes tipos de tintas podem ser usados; aqui, os resultados são apresentados com a água-solúvel (não-impermeável) delineadores e tintas de esmalte. Não-impermeável delineadores têm a vantagem de ser facilmente liquefeito quando misturado com água. No entanto, este negocia com a diluição da pigmentação (que pode não ou pode ser desejável (ver, por exemplo, Figura 3)). Tintas de esmalte têm uma consistência que pode ser facilmente controlada pela adição de esmalte mais fino, enquanto ainda proporcionando cobertura total. Entretanto, esta característica negocia fora com a possibilidade de manter a estrutura do cabelo ou da escala da peça do corpo pintada. Além disso, tintas de esmalte são duradouros. A desvantagem é que a pintura do esmalte e diluente emitem odores fortes durante a aplicação e antes de secar. Uma dificuldade adicional a respeito das substâncias da coloração pode ser encontrar a máscara direita, com as propriedades espectrais direitas. É por exemplo difícil de obter delineador vermelho para usar em paralelo com delineador preto, como delineadores são muitas vezes mais rosa do que vermelho. É igualmente duro começ o pó da composição (ou os pigmentos) que não contêm nenhum glitter (que pode às vezes ser somente visível o microscópio). Muitos produtos da composição igualmente refletem a luz UV que, quando invisível aos experimentadores, pôde ser conspícuo aos animais estudados.

Manipular a coloração de artrópodes através da aplicação direta de corantes em suas partes do corpo vem com vantagens e inconvenientes quando comparado a outros métodos. Sua principal limitação é que não se pode absolutamente descartar a possibilidade de alguns efeitos sutis de toxicidade. No entanto, pode-se garantir não introduzir vieses contra um grupo de tratamento aplicando tinta a todas as categorias de tratamento, e/ou pode-se testar se a aplicação de tinta interfere com comportamentos de interesse. Com os métodos aqui apresentados, coletamos evidências suficientes para sugerir que a aplicação da tinta levou a um efeito insignificante ou negativo (tabela 1 e tabela 2). A principal vantagem desse método é que pequenas manchas de cor podem ser direcionadas, sua cor ' removida ' (veja a Figura 2), feita mais maçante (Figura 3) ou mais brilhante (Figura 4), isoladamente do resto da coloração do corpo e do indivíduo Ambiente. Isso contrasta com o método alternativo mais comum que consiste em manipular as condições de iluminação e, assim, modificar a aparência visual de todo o indivíduo e seu entorno. Na verdade, mesmo quando não especificamente manipular condições de iluminação, pode-se manipular com êxito a cor e ver limitado ou nenhum efeito desta manipulação se o ambiente de iluminação não é apropriado³⁹. Portanto, é importante medir e considerar o ambiente de luz onde quaisquer experimentos serão conduzidos (ou seja, medir a irradiância) e certifique-se de combiná-lo de perto com condições de iluminação natural (por exemplo, usando lâmpadas de espectro completo que imitam luz natural quando em cativeiro). Global, usando Micro escovas e um microscópio, este protocolo permite a manipulação mais precisa de remendos minúsculos da cor do que a maioria outros de métodos diretos da coloração que foram usados previamente em invertebrates. A maioria dos estudos anteriores usaram animais com manchas de cor que são relativamente grandes em comparação com as faces de aranhas pulando (por exemplo, manipulação de cores asa borboleta^29,34,35, os corpos de adulto hemípteros (' bugs verdadeiros ')^30,36 e gafanhotos³¹, ou as pernas de lobo relativamente grande aranhas^32,33,37). Os métodos aqui apresentados abrem oportunidades para estudar a incrível diversidade de manchas de cor em táxons que são subestudadas devido ao seu pequeno tamanho.

Técnicas semelhantes poderiam ser aplicadas a outros artrópodes que podem ser imobilizadas ou anestesiados e para áreas onde a tinta não afetaria a mobilidade ou a saúde do indivíduo (ou seja, excluindo áreas como articulações, estruturas como cabelo ou arolia que são necessárias para a locomoção apropriada, partes da boca, ou outros orifícios tais como estruturas de respiração). Essas técnicas também podem ser estendidas para incluir uma paleta maior de corantes, tintas e maquiagens que estão amplamente disponíveis.

Finalmente, estas técnicas delicadas podiam ser usadas não somente para manipular a cor em organismos pequenos, mas para manipular igualmente testes padrões (tais como listras) em organismos relativamente maiores. Isso deve ser benéfico para uma grande variedade de pesquisadores que podem adaptar nossos métodos para seus próprios estudos de seleção sexual, comunicação, sinais de presa aposemática, e outros contextos em que os animais usam a cor.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tanque de CO2	AirGas (Radnor, PA)	#CD 50	para aranhas anestesiadas
Diluente de tinta esmalte	Testors (Vernon Hills, IL)	75611792569	para tinta esmalte fina
Tinta esmalte plana	Testors (Vernon Hills, IL)	vermelho: 075611115009, preto: 075611114903, branco: 075611116808	pode ser diluído com diluente de tinta esmalte
Microscópio leve	Zeiss (Jena, Alemanha)	stemi 508	para pintar pequenas áreas com precisão
Câmera de microscópio de luz	Zeiss (Jena, Alemanha)	Axiocam 105 cor	para tirar foto antes e depois da manipulação para documentação
Software de câmera de microscópio de luz	Zeiss (Jena, Alemanha)	Zen 2 edição azul	para processar fotos tiradas antes e depois da manipulação
Delineador líquido, sombra " Perversão"	Urban Decay (Costa Mesa, CA)	(descontinuado)	delineador não impermeável que pode ser diluído com água; delineador 2
MegaLiner delineador líquido, preto	WetnWild (Los Angeles, CA)	SKU# 871A	delineador não à prova d'água que pode ser diluído com água; delineador 1
Micro pincéis	MicroMark (Berkeley Heights, NJ)	# 84648	para permitir a pintura precisa de pequenas áreas
Modelagem não endurecedora argila	Van Aken International Claytoon (North Charleston, SC)	18165	para colar um pequeno pino de prego ou inseto e ajustar de forma flexível seus ângulos
Pequenos pinos de montagem de pregos ou insetos	BioQuip (Rancho Dominguez, CA)	#1208B7	para colar aranhas, bem como afastar aranhas ' s apêndices na frente da área para pintar
Pequenos recipientes de plástico, como as tampas de frascos de coleta de insetos com tampa de pressão	BioQuip (Rancho Dominguez, CA)	# 8912	para misturar tinta e diluente até a consistência certa
Seringa pequena	Fisher Scientific	1482910F	para transferir pequena quantidade de diluente de esmalte
Spectralon branco padrão	Labsphere Inc. (North Sutton, NH)	WS-1-SL	para medir as propriedades espectrais das cores
Espectrofotômetro UV-VIS	Ocean Optics (Dunedin, FL)	USB 2000 (espectrofotômetro) com PX-2 (fonte de luz)	para medir as propriedades espectrais das cores
Cola escolar solúvel em água	Elmer's (High Point, NC)	#E304	para montar as aranhas em um prego/alfinete
Palitos de madeira	Up& Up, Target Corporation (Minneapolis, MN)	# 253-05-0125	para transferir gotas de tinta esmalte