Na síntese de Vesiculo de precursores de membrana peptídica para crescimento de vesículas autônomas

Resumo

Apresentamos aqui os protocolos para a criação de pequenas vesículas unilamelares à base de peptídeos capazes de crescimento. Para facilitar na produção do vesicobolhosas do peptide da membrana, estas vesículas são equipadas com um sistema da transcrição-Tradução e o plasmídeo da peptide-codificação.

Resumo

A compartimentação das reações bioquímicas é um aspecto central das células sintéticas. Para esta finalidade, os compartimentos peptídicos da reação servem como uma alternativa atrativa aos lipossomas ou aos vesicles ácidos gordos-baseados. Externamente ou dentro das vesículas, os peptídeos podem ser facilmente expressos e simplificar a síntese de precursores de membrana. Fornecido aqui é um protocolo para a criação de vesículas com diâmetros de ~ 200 nm com base no anfífilo elastina-como polipeptídeos (ELP) utilizando desidratação-reidratação de grânulos de vidro. Também são apresentados protocolos para a expressão e purificação de ELP bacteriana através de ciclagem de temperatura inversa, bem como a sua funcionalização covalente com corantes fluorescentes. Além disso, este relatório descreve um protocolo para permitir a transcrição de dbrócolos do aptâmeros do RNA dentro dos vesículas de ELP como um exemplo menos complexo para uma reação bioquímica. Finalmente, um protocolo é fornecido, que permite na expressão do vesicobolhosas de proteínas fluorescentes e do peptide da membrana, visto que a síntese do último conduz ao crescimento do vesícula.

Introdução

A criação de sistemas celulares vivos sintéticos é geralmente abordada a partir de duas direções diferentes. No método de cima para baixo, o genoma de uma bactéria é reduzido aos seus componentes essenciais, em última análise, levando a uma célula mínima. Na aproximação bottom-up, as pilhas artificiais são montadas de novo dos componentes moleculars ou dos subsistemas celulares, que precisam de ser integrados funcionalmente em um sistema cell-like consistente.

Na abordagem de de novo, a compartimentação dos componentes bioquímicos necessários é geralmente alcançada usando membranas feitas de fosfolipídios ou ácidos graxos^1....

Protocolo

1. expressão de polipeptídeos semelhantes à elastina

1. Dia 1: preparação de uma cultura inicial e suprimentos para a expressão peptídica
   1. Preparar e autoclave expressão frascos de cultura (4 x 2,5 L) e 3 L de LB médio. Para 1 L de meio LB, adicione 25 g de pó LB a 1 L de água ultrapura.
   2. Prepare uma cultura inicial com 100 mL de meio LB, 50 μL de solução de cloranfenicol (filtro de 0,22 μm) estéril-filtrada (25 mg/mL em EtOH) e 50 μL de solução de carbenicilina filtrada (filtro de 0,22 μm) estéril (100 mg/mL em 50% EtOH e 50% de água ultrapura).
   3. Adicione uma pequena raia de um estoque bacteriano pré-fabricado cont....

Resultados

Produção de vesículas
A Figura 1 mostra imagens de microscopia eletrônica de transmissão (Met) de vesículas preparadas com diferentes soluções de inchaço e o método de grânulos de vidro (ver também VOGELE et al.¹¹). Para a amostra na Figura 1a, apenas a PBS foi utilizada como solução de inchaço para comprovar a formação de vesículas e determinar seu tamanho. Quando a TX-TL foi utilizada como solução de inchaço (

Discussão

A reidratação do filme é um procedimento comum para a criação de pequenas vesículas unilamelares. A principal fonte de falha é o manuseio incorreto dos materiais utilizados no procedimento.

Inicialmente, os ELPs são produzidos por células de E. coli . O rendimento após a purificação de ELP pode variar significativamente dependendo de como o protocolo é conduzido com cuidado durante suas etapas cruciais. Estes são a et.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2xYT	MP biomedicals	3012-032
3-PGA	Sigma-Aldrich	P8877
5PRIME Phase Lock GelTM tubo	VWR	733-2478
Sigma-Aldrich	conjugado com	alcina
conjugado com alina Cy5	Sigma-Aldrich	777358
ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Benzamidina	Carl Roth	CN38.2
BL21 Rosetta 2 E. coli cepa	Novagen	71402
Bradford BSA Kit de Ensaio de Proteína	Bio-rad	500-0201
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501
Carpenicilina	Carl Roth	6344.2
Cloranfenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Cloranfenicol	Carl Roth	3886.3
Clorofórmio	Carl Roth	4432.1
CoA	Sigma-Aldrich	C4282
CTP	USB	14121
CuSO4	Carl Roth	P024.1
DFHBI	Lucerna Technologies	410
DMSO	Carl Roth	A994.1
DNase I	NEB	M0303S
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Etanol	Carl Roth	9065.2
Ácido folínico	Sigma-Aldrich	F7878
Contas de vidro, lavadas com ácido	Sigma-Aldrich	G1277
GTP	USB	16800
HEPES	Sigma-Aldrich	H6147
IPTG (β-isopropil tiogalactosídeo)	Sigma-Aldrich	I6758
KCl	Carl Roth	P017.1
K-glutamato	Sigma-Aldrich	G1149
LB Caldo	Carl Roth	X968.2
Lisozima	Sigma-Aldrich	L6876
Metanol	Carl Roth	82,2
MgCl2	Carl Roth	KK36,3
Mg-glutamato	Sigma-Aldrich	49605
Micro Bio-Spin Colunas de Cromatografia	Bio-Rad	732-6204
NAD	Sigma-Aldrich	N6522
Ligante NHS-azida (éster oxissuccinimida do ácido y-azidobutírico)	Baseclick	BCL-033-5
PEG-8000	Carl Roth	263.2
Listras de pH	Carl Roth	549.2
Fluoreto de fenilmetilsulfonila	Carl Roth	6367.2
Solução salina tamponada com fosfato	VWR	76180-684
Ácido	fosfóricoSigma-Aldrich	W290017
Polietilenoimina	Sigma-Aldrich	408727
Solução dibásica de fosfato de potássio	Sigma-Aldrich	P8584
Solução monobásica de fosfato de potássio	Sigma-Aldrich	P8709
Qiagen Miniprep Kit	Qiagen	27106
Tampão de reação RNAPol	NEB	B9012
Inibidor de RNase murino	NEB	M0314S
Toalhetes RNaseZap	ThermoFisher	AM9788
rNTP	NEB	N0466S
Roti-Fenol/Clorofórmio/Álcool Isoamílico	Carlroth	A156.1
RTS Amostrador de Aminoácidos	5 Prime	2401530
Slide-A-Lyzer de Diálise, 10k MWCO (Kit)	Thermo-Scientific	66382
Cloreto de sódio	Carl Roth	9265.1
Hidróxido de sódio	Carl Roth	8655.1
Espermidina	Sigma-Aldrich	85558
Filtrado estéril (0.22 µ filtro m)	Carl Roth	XH76.1
T7 polimerase	NEB	M0251S
TBTA (tris (benziltriazolilmetil) amina)	Sigma-Aldrich	678937
TCEP (cloridrato de tris (2-carboxietil) -fosfina)	Sigma-Aldrich	C4706
Tris base	Fischer	BP1521
tRNA (de E. coli)	Roche aplicado Ciência	MRE600
UTP	USB	23160

Cy3 777331