Uma preparação de amostra de plasma para espectrometria de massa usando uma estação de trabalho automatizada

Summary

Aqui, apresentamos um método automatizado de digestão de proteínas plasmáticas para análise proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massa. Neste protocolo, as etapas de transferência e incubação de líquidos para desnaturação, redução, alquilação e reações de digestão de tripsina são simplificadas e automatizadas. Leva aproximadamente cinco horas para preparar uma placa de 96 poços com precisão desejada.

Abstract

A preparação da amostra para análise de espectrometria de massa em proteômica requer decote enzimático de proteínas em uma mistura de peptídeos. Este processo envolve inúmeras etapas de incubação e transferência de líquidos a fim de alcançar a desnaturação, redução, alquilação e decote. A adaptação desse fluxo de trabalho em uma estação de trabalho automatizada pode aumentar a eficiência e reduzir os coeficientes de variância, fornecendo dados mais confiáveis para comparações estatísticas entre os tipos de amostra. Descrevemos anteriormente um fluxo de trabalho de preparação de amostras proteômicas automatizada¹. Aqui, relatamos o desenvolvimento de um fluxo de trabalho mais eficiente e melhor controlado com as seguintes vantagens: 1) O número de etapas de transferência de líquidos é reduzido de nove para seis por meio da combinação de reagentes; 2) O tempo de pipetting é reduzido por pipetting de ponta seletiva usando uma cabeça pipetting de 96 posições com múltiplos canais; 3) O potencial de throughput é aumentado pela disponibilidade de até 45 posições no convés; 4) O gabinete completo do sistema proporciona melhor temperatura e controle ambiental e reduz o potencial de contaminação de amostras ou reagentes; e 5) A adição de peptídeos rotulados de isótopos estáveis, bem como proteína β-galactosidase, a cada amostra torna possível o monitoramento e o controle de qualidade durante todo o processo. Essas melhorias de hardware e processos proporcionam boa reprodutibilidade e melhoram a precisão intra-ensaio e interensaio (CV de menos de 20%) para quantificação de proteína soro baseada em LC-MS e peptídeos. Todo o fluxo de trabalho para digerir 96 amostras em uma placa de 96 poços pode ser concluído em aproximadamente 5 horas.

Introduction

A quantificação de proteínas e peptídeos à base de espectrometria de massa (MS) está sendo cada vez mais aplicada como ferramenta bioanalítica para análise plasmática em pesquisas básicas e laboratórios clínicos^2,3. A instrumentação e a informática necessárias avançaram rapidamente à medida que a ESM tornou-se o método de escolha para quantificar proteínas ou proteínas modificadas, visando seqüências específicas de peptídeos devido à sua capacidade de quantificar centenas de peptídeos em uma única corrida de MS⁴. A preparação da amostra serve como base para qualquer análise proteômica. Antes da análise de MS, as proteínas de uma amostra biológica são tipicamente desnaturadas, reduzidas, alquiladas, digeridas em peptídeos tépticos e dessalgadas⁵. Alquilation bloqueia cisteínas para evitar modificações descontroladas e garantir que todas as cisteínas tenham a mesma massa. Em seguida, a tripsina é adicionada para digerir proteínas em peptídeos. Cada uma dessas etapas requer otimização, e todo o processo é tradicionalmente realizado manualmente, permitindo a introdução de erros analíticos.

O pipeline tradicional de desenvolvimento de biomarcadores consiste em dois processos principais: proteômica de espingarda para descoberta global de proteínas para criar um inventário de proteínas em profundidade⁶ e proteômica direcionada para verificação e validação visando a quantitação de proteína de alta precisão e alto nível⁷. Independentemente da abordagem da ESM, a preparação da amostra é a mesma e centra-se no decote enzimático de proteínas em uma mistura de peptídeos. Como proposto por Van Eyk e Sobhani⁸, ter um método que permita uma análise precisa, precisa e reprodutível tanto para a descoberta quanto para ensaios direcionados é desejado para mover efetivamente os biomarcadores de descoberta para ensaios clínicos implementados. Para isso, a automação da preparação da amostra será útil e fornecerá a capacidade de aumentar a eficiência para análises de alto throughput. Os métodos manuais normalmente introduzem erros analíticos além dos limites aceitáveis especificados pela Food and Drug Administration (FDA) na orientação revisada de validação do método bioanalítico, que inclui biomarcadores e diagnósticos^2,9. O desenvolvimento de um fluxo de trabalho de preparação de amostras de proteína sem d.S. rápido, altamente preciso e mãos-livres será necessário para facilitar a pesquisa de biomarcadores, o que requer a preparação e análise de milhares de amostras biológicas. A preparação da amostra de MS tem muitas etapas onde erros podem ser introduzidos, e o processo é tedioso e demorado.

Em nosso método aprimorado, foi programado um workstation automatizado para realizar todos os procedimentos necessários de preparação da amostra de plasma em um total de 6 etapas (Figura 1) para garantir: 1) transferências líquidas precisas; 2) a reação é iniciada e interrompida em um momento consistente; 3) a reação é realizada a uma temperatura controlada (ou seja, incubadora); e 4) a reação tem mistura uniforme para todas as reações. Também implementamos a adição de proteínas exógenas de controle de qualidade e padrões internos (padrões estáveis de peptídeos rotulados por isótopos) para garantir uma qualidade e uma produção reprodutível de proteína baseada em LC-MS e quantificação de peptídeos em um formato de 96 poços. Incluindo preparação de reagente, horas de trabalho e um total de 1.000.000 etapas de pipetting seriam necessárias para processar 96 amostras em tubos individuais. A automação reduz o tempo prático e o número de interações humanas envolvidas.

Protocol

1. Programação para o manipulador de líquidoautomatizado

1. Crie um novo método a partir do menu Arquivo(Arquivo | Novo método)
   NOTA: Complete os passos na ordem dada. A fonte itálica denota texto para digitar o software Biomek. Entre em contato com os autores para obter informações sobre técnicas e modelos de pipetting.
2. Digite as variáveis de etapa iniciar e seus valores na etapa inicial conforme listado na Tabela 1.
3. Defina colunas para pipetting de ponta seletiva. Para as etapas 1.3-1.7, clique na etapa Definir Global na barra de ferramentas em Passos de Controle e arraste-a para o método.
   1. Usando a etapa Set Global, definir valor =PrimeiraColuna para variável FirstColumn_Global,valor =LastColumn para variável LastColumn_Global,valor =LastColumn-FirstColumn+1 para colunasvariáveis e valor =Colunas*8 para poçosvariáveis .
   2. Selecione a etapa Script na barra de ferramentas em Etapas de controle e arraste-a para o método. Digite o script VB como indicado na Figura 2.
4. Definindo volumes para misturas Set Global e soluções.
   1. Usando a etapa Definir Global, defina os valores correspondentes às variáveis de mixagem de volume, conforme mostrado na Tabela 2.
   2. Clique na barra de ferramentas em Se em Passos de Controle e arraste-a para o método. Em condições, digite Autosampler.
   3. Em seguida,clique na etapa Definir Global na barra de ferramentas em Passos de Controle e arraste-a para o método.
   4. Usando o passo Set Global, defina o valor =(MobilePhase*Columns))+10 para variável MobilePhaseWell.(
   5. Em Outra si, clique na etapa Definir Global na barra de ferramentas em Passos de Controle e arraste-a para o método.
   6. Usando o passo Set Global, defina o valor =0 para mobilephasewell variável
5. Configuração de configuração de labware guiado (GLS)
   1. Clique na etapa Do Editor de baralho na barra de ferramentas em Utilitários. Crie um novo deck para corresponder ao layout do deck na Figura 3 e rotule-o como Deck 1.
   2. Clique na etapa configuração guiada na barra de ferramentas em Configuração e Dispositivos e arraste-a para o método. Arraste e solte os tipos de labware nas posições do convés, conforme indicado na Tabela 3. Depois disso, preencha as guias na tabela, conforme mostrado na Tabela 3 e na Figura 4 (Configuração guiada).
6. Configuração do procedimento para contagem de gorjetas
   1. Clique na etapa Definir procedimento na barra de ferramentas em Etapas de controle e arraste-a para o método. Procedimento de nome como TipCount.
   2. Clique na etapa Script na barra de ferramentas em Passos de Controle e arraste-a para o método. Digite o script VB como indicado na Figura 5 (Script de contagem de pontas).
   3. Clique na barra de ferramentas em Se em Passos de Controle e arraste-a para o método.
   4. Em condições, tipo TL5 = 0.
   5. Em seguida,clique na etapa Mover Labware na barra de ferramentas em Setup & Device Steps e arraste-a para o método. Mova o labware de TL5 para TR3. Clique na etapa Mover Labware na barra de ferramentas, em Setup & Device Steps e arraste-a para o método. Mova o labware de TL2 para TL5. Por fim, clique na etapa Mover Labware na barra de ferramentas em Setup & Device Steps e arraste-a para o método. Mova labware de BC90 para TL2.
7. Definição de procedimento para incubadora
   1. Clique na etapa Definir procedimento na barra de ferramentas em Etapas de controle e arraste-a para o método. Procedimento de nome como Incubadora.
   2. Digite o HalfTime como Nome Variável e 1800 como Valor Padrão.
   3. Digite NextTemp como Nome variável e 22 como Valor Padrão.
   4. Digite a temperatura como Nome Variável e 60 como Valor Padrão.
   5. Clique na etapa Enhanced Move Labware na barra de ferramentas em Setup & Device Steps e arraste-a para o método. Mova labware de P11 para INHECO1.
   6. Clique na etapa Executar procedimento na barra de ferramentas em Etapas de controle e arraste-a para o método. Procedimento de nome como TipCount.
   7. Clique na etapa INHECO Incubate na barra de ferramentas em Integrações e arraste-a para o método. Digite INHECO1 para usar o dispositivo na posição, =HalfTime para Incubar para, =Temperatura para °C e 3 para °C de temperatura-alvo. Selecione a opção Shake durante a incubação e o estilo de agitação orbital(no sentido horário). Para as configurações, digite 1,00 mm lado a lado, 6,6 vezes um segundo, 1,00 mm para frente e 6,6 vezes por segundo.
      NOTA: Certifique-se de que o software inheco inheco está instalado.
   8. Clique na etapa INHECO Incubate na barra de ferramentas em Integrações e arraste-a para o método. Digite INHECO1 para usar o dispositivo na posição, =HalfTime para Incubar para, =Temperatura para °C e 3 para °C de temperatura-alvo. Selecione a opção Shake durante a incubação e o estilo de agitação Orbital (no sentido anti-horário). Para as configurações, digite 1,00 mm lado a lado, 6,6 vezes um segundo, 1,00 mm para frente e para trás a 6,6 vezes por segundo.
   9. Clique na etapa Pausa na barra de ferramentas em Setup & Device Steps e arraste-a para o método. Pause todo o sistema para 1 s.
   10. Clique na etapa Definir procedimento na barra de ferramentas em Etapas de controle e arraste-a para o método. Procedimento de nome como Incubadora.
   11. Clique na etapa INHECO Incubate na barra de ferramentas em Integrações e arraste-a para o método. Digite INHECO1 para usar o dispositivo na posição, 1 para Incubar para, =NextTemp para °C e 3 para °C de temperatura-alvo.
8. Procedimento definidor para orbital.
   1. Clique na etapa Enhanced Move Labware na barra de ferramentas em Setup & Device Steps e arraste-a para o método. Mova labware de P11 para Orbital1.
   2. Clique na etapa Executar procedimento na barra de ferramentas em Etapas de controle e arraste-a para o método. Selecione o procedimento TipCount.
   3. Clique na etapa Ação do dispositivo na barra de ferramentas em Setup & Device Steps e arraste-a para o método. Selecione Dispositivo OritalShaker0, Comando TimedShake. Digite Shaking speed 1000, Tempo para atingir a velocidade máxima 2, Tempo de agitar 30.
   4. Clique na etapa Enhanced Move Labware na barra de ferramentas em Setup & Device Steps e arraste-a para o método. Mova labware Orbital1 para P11.
9. Configurando a primeira mistura
   1. Clique na etapa 'Selecionar dica' na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arraste-a para o método. Selecione reorganizar a posição TL4.
   2. Clique na etapa INHECO Incubate na barra de ferramentas em Integrações e arraste-a para o método. Digite INHECO1 para usar o dispositivo na posição, 1 para Incubar para, 60 para °C e 3 para °C de temperatura-alvo.
   3. Clique na etapa Loop na barra de ferramentas em Passos de Controle e arraste-a para o método, dentro da etapa Selecionar ponta. Digite col como variável =PrimeiraColuna como Iniciar, =ÚltimaColuna como Fim e 1 como Incremento.
   4. Clique na etapa 'Dicas de carga' Selecionar dicas na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arraste-a para o método, dentro da etapa de loop. Selecione dicas BC90, localização TL5 e pontas de backup TL2 Localização a partir do menu suspenso. Selecione Colunaúnica e digite 1.
   5. Clique na etapa 'Selecionar dicas' Aspirar na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arraste-a para o método, dentro da etapa de loop. Selecione BCDeep96Round Labware Tipo e Posição da placa de reagente. Digite o volume =FirstMix, Aspirate na coluna 1 e na linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
   6. Clique na etapa 'Dicas selecionadas' Dispensar a barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arrastá-la para o método, dentro da etapa de loop. Selecione BCDeep96Round Labware Tipo e Posição da placa de reagente. Digite o volume =FirstMix,dispense na coluna =col e na linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
   7. Clique na etapa 'Dicas selecionadas' Descarregar a barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arrastá-la para o método, dentro da etapa de loop. Selecione Descarregar dicas para TR1.
10. Configurando as amostras
    1. Clique na barra de ferramentas em Se em Passos de Controle e arraste-a para o método. Digite SamplePlate como condição.
    2. Em seguida,clique na etapa 'Dicas selecionadas' 'Dicas' na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arraste-a para o método. Selecione dicas BC90, localização TL5 e pontas de backup TL2 Localização a partir do menu suspenso. Selecione Colunas únicas e digite colunas =pontas.
    3. Clique na etapa Selecionar dicas Aspirar na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arraste-a para o método, dentro disso. Selecione Greiner96RoundPS Labware Tipo e Posição de Amostras. Digite o volume =Amostra, Aspirar na coluna =PrimeiraColuna e linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
    4. Clique na etapa 'Dicas selecionadas' Dispensar na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arrastá-la para o método, dentro disso. Selecione BCDeep96Round Labware Tipo e Posição da placa de reação. Digite o volume =Amostra, dispense na coluna = PrimeiraColuna e na linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
    5. Clique na etapa 'Dicas selecionadas' Descarregar a barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arrastá-la para o método, dentro disso. Selecione Descarregar dicas para TR1.
    6. Após o término da etapa "Se", clique na etapa Executar procedimento na barra de ferramentas em Etapas de Controle e arraste-a para o método. Selecione o procedimento Incubadora. Digite o HalfTime como Nome Variável e 1800 como Valor Padrão. Digite NextTemp como Nome variável e 22 como Valor Padrão. Digite a temperatura como Nome Variável e 60 como Valor Padrão.
11. Configuração do Bloco Cisteína
    1. Clique na etapa Loop na barra de ferramentas em Passos de Controle e arraste-a para o método, dentro da etapa de ponta Selecionar. Digite col como variável =PrimeiraColuna como Iniciar, =ÚltimaColuna como Fim e 1 como Incremento.
    2. Em Loop,clique na etapa 'Dicas selecionadas' 'Dicas' na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arraste-a para o método. Selecione dicas BC90, localização TL5 e pontas de backup TL2 Localização a partir do menu suspenso. Selecione Colunaúnica e digite 1.
    3. Clique na etapa Selecionar dicas Aspirar na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arraste-a para o método, dentro do loop. Selecione BCDeep96Round Labware Tipo e Posição da placa de reagente. Digite o volume =CysteineMix, aspirado na coluna 2 e na linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
    4. Clique na etapa 'Dicas selecionadas' Dispensar a barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arrastá-la para o método, dentro do loop. Selecione BCDeep96Round Labware Tipo e posição da placa de reação. Digite o volume = CysteineMix, dispense na coluna = col e linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
    5. Clique na etapa 'Dicas selecionadas' Descarregar a barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arrastá-la para o método, dentro disso. Selecione Descarregar dicas para TR1.
    6. Após o fim do loop 'If', clique na etapa Executar procedimento na barra de ferramentas em Etapas de controle e arraste-a para o método. Selecione o procedimento Incubadora. Digite o HalfTime como Nome Variável e 300 como Valor Padrão. Digite NextTemp como Nome variável e 43 como Valor Padrão. Digite a temperatura como Nome Variável e 25 como Valor Padrão.
12. Configurando a segunda mistura
    1. Clique na etapa Loop na barra de ferramentas em Passos de Controle e arraste-a para o método, dentro da etapa de ponta Selecionar. Digite col como variável =PrimeiraColuna como Iniciar, =ÚltimaColuna como Fim e 1 como Incremento.
    2. Em loop, clique na etapa 'Dicas selecionadas' Dicas de carga na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arraste-a para o método. Selecione dicas BC90, localização TL5 e pontas de backup TL2 Localização a partir do menu suspenso. Selecione Colunaúnica e digite 1.
    3. Clique na etapa Selecionar dicas Aspirar na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arraste-a para o método, dentro do loop. Selecione BCDeep96Round Labware Tipo e Posição da placa de reagente. Digite o volume =SecondMix, Aspirar na coluna 3 e na linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
    4. Clique na etapa 'Dicas selecionadas' Dispensar a barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arrastá-la para o método, dentro do loop. Selecione BCDeep96Round Labware Tipo e Posição da placa de reação. Digite o volume = SecondMix, Dispense na coluna = col e linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
    5. Clique na etapa 'Dicas selecionadas' Descarregar a barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arrastá-la para o método, dentro disso. Selecione Descarregar dicas para TR1.
    6. Após o término do loop Se o loop, clique na etapa Executar procedimento na barra de ferramentas em Etapas de controle e arraste-a para o método. Selecione o procedimento Orbital.
    7. Clique na etapa Pausa na barra de ferramentas em Setup & Device Steps e arraste-a para o método. Pause todo o sistema para 1 s.
13. Configurando a adição de Trypsin
    1. Clique na etapa Loop na barra de ferramentas em Passos de Controle e arraste-a para o método, dentro da etapa de ponta Selecionar. Digite col como variável =PrimeiraColuna como Iniciar, =ÚltimaColuna como Fim e 1 como Incremento.
    2. Em Loop,clique na etapa 'Dicas selecionadas' 'Dicas' na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arraste-a para o método. Selecione dicas BC90, localização TL5 e localização de backup TL2 no menu suspenso. Selecione Colunaúnica e digite 1.
    3. Clique na etapa Selecionar dicas Aspirar na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arraste-a para o método, dentro do loop. Selecione BCDeep96Round Labware Tipo e Posição da placa de reagente. Digite o volume =Trypsin, Aspirar na coluna 4 e na linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
    4. Clique na etapa 'Dicas selecionadas' Dispensar a barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arrastá-la para o método dentro do loop. Selecione BCDeep96Round Labware Tipo e Posição da placa de reação. Digite o volume =Tripsina, Dispense na coluna = col e linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
    5. Clique na etapa 'Dicas selecionadas' Descarregar a barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arrastá-la para o método, dentro disso. Selecione Descarregar dicas para TR1.
    6. Após o fim do loop 'If', clique na etapa Executar procedimento na barra de ferramentas em Etapas de controle e arraste-a para o método. Selecione o procedimento Incubadora. Digite o HalfTime como Nome Variável e 3600 como Valor Padrão. Digite NextTemp como Nome variável e 25 como Valor Padrão. Digite a temperatura como Nome Variável e 43 como Valor Padrão.
    7. Clique na etapa INHECO Incubate na barra de ferramentas em Integrações e arraste-a para o método. Certifique-se de que o software inheco inheco está instalado. Digite INHECO1 para usar o dispositivo na posição, 1 para Incubar para, 25 para °C e 5 para °C de temperatura-alvo.
14. Configurando a saciedade
    1. Clique na etapa Loop na barra de ferramentas em Passos de Controle e arraste-a para o método, dentro da etapa Selecionar ponta. Digite col como variável =PrimeiraColuna como Iniciar, =ÚltimaColuna como Fim e 1 como Incremento.
    2. Em Loop,clique na etapa 'Dicas selecionadas' 'Dicas' na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arraste-a para o método. Selecione dicas BC90, localização TL5 e pontas de backup TL2 Localização a partir do menu suspenso. Selecione Colunaúnica e digite 1.
    3. Clique na etapa Selecionar dicas Aspirar na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arraste-a para o método, dentro do loop. Selecione BCDeep96Round Labware Tipo e Posição da placa de reagente. Digite o volume =Saciar, Aspirar na coluna 5 e na linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
    4. Clique na etapa 'Dicas selecionadas' Dispensar a barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arrastá-la para o método, dentro do loop. Selecione BCDeep96Round Labware Tipo e posição da placa de reação. Digite o volume =Sacie,Dispense na coluna = col e linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
    5. Clique na etapa 'Dicas', descarregue a barra de ferramentas em Etapas de manuseio líquido e arraste-a para o método, em Then. Selecione Descarregar dicas para TR1.
    6. Após o término do loop Se o loop, clique na etapa Executar procedimento na barra de ferramentas em Etapas de controle e arraste-a para o método. Selecionar procedimento Orbital.
    7. Clique na etapa Pausa na barra de ferramentas em Setup & Device Steps e arraste-a para o método. Pause todo o sistema para 1 s.
    8. Clique na etapa Pausa na barra de ferramentas em Setup & Device Steps e arraste-a para o método. Selecione Pausar todo o sistema e exibir esta mensagem. Digite a mensagem 'Continuar após a centrifugação'.
15. Configuração da placa para Autosampler
    1. Clique na barra de ferramentas Em 'Passos de controle' e arraste-a para o método, dentro da etapa Selecionar ponta. Digite Autosampler como condição.
    2. Em seguida,clique na etapa Loop na barra de ferramentas em Passos de Controle e arraste-a para o método. Digite col como variável =PrimeiraColuna como Iniciar, =ÚltimaColuna como Fim e 1 como Incremento.
    3. Em Loop,clique na etapa 'Dicas selecionadas' 'Dicas' na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arraste-a para o método. Selecione dicas BC230, localização TL6 e pontas de backup TL2 Localização a partir do menu suspenso. Selecione Colunaúnica e digite 1.
    4. Clique na etapa Selecionar dicas Aspirar na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arraste-a para o método, dentro do loop. Selecione BCDeep96Round Labware Tipo e posição da placa de reagente. Digite o volume =MobilePhase, Aspirate na coluna 6 e na linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
    5. Clique na etapa 'Dicas selecionadas' Dispensar a barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arrastá-la para o método, dentro do loop. Selecione Bio_RadPCR96 posição de placa de tipo de labware e de autoamostrar. Digite o volume =MobilePhase, Dispense na coluna = col e linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
    6. Clique na etapa 'Dicas', descarregue a barra de ferramentas em Etapas de manuseio líquido e arraste-a para o método, em Then. Selecione Descarregar dicas para TR1.
    7. Após o fim do loop 'If', clique na etapa Executar procedimento na barra de ferramentas em Etapas de controle e arraste-a para o método. Selecione o procedimento TipCount.
    8. Clique na etapa 'Dicas selecionadas' Dicas de carga na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arraste-a para o método. Selecione dicas BC90, localização TL5 e localização de backup TL2 no menu suspenso. Selecione Colunas únicas e digite colunas =pontas.
    9. Clique na etapa Selecionar dicas Aspirar na barra de ferramentas em Etapas de Manuseio Líquido e arraste-a para o método dentro do loop. Selecione BCDeep96Round Labware Tipo e posição da placa de reação. Digite o volume =DigestTransfer, Aspirar na coluna =primeira coluna e linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
    10. Clique na etapa 'Dicas selecionadas' Dispensar a barra de ferramentas em Etapas de Manuseio líquido e arrastá-la para o método, dentro do loop. Selecione Bio_RadPCR96 posição de placa de tipo de labware e de autoamostrar. Digite o volume =MobilePhase, Dispense na coluna =PrimeiraColuna e na linha 1. Selecione uma técnica otimizada no menu suspenso da técnica.
    11. Clique na etapa 'Dicas', descarregue a barra de ferramentas em Etapas de manuseio líquido e arraste-a para o método em Then. Selecione Descarregar dicas para TR1. A etapa de dicas selecionadas termina aqui.
    12. Salve e nomeie o método.

2. Prepare amostras, labware e reagentes

1. Transfira 5 μL de plasma humano saudável agrupado para um polipropileno, placa de poço profundo de 96 rodadas.
   NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para reagentes e suprimentos utilizados neste protocolo. TPCK Treated Trypsin foi comprado e trippsina para substrato razão e tempo de incubação foi otimizado especificamente. Se for utilizado um grau diferente de tripsina, como a trippsina recombinante de grau seqüencial, a relação enzima para substrato e tempo de incubação deve ser testada e otimizada.

3. Procedimento operacional

1. Clique duas vezes no ícone do software.
2. Na guia Método, selecione Home All Axes para orientar e preparar o manipulador de líquidoautomatizado. Certifique-se de que todas as seringas da estação de trabalho não contenham bolhas de ar visíveis.
3. Em Arquivo,selecione Abrir | Método.
4. Selecione o método(Figura 6).
5. Inicie o método clicando no ícone de Execução em forma de triângulo verde.
6. Para ter uma placa autosampler preparada no final do método, digite o valor 'true' no Digite um valor para usar no prompt 'Autosampler' e clique em OK. Se uma placa autosampler não estiver sendo preparada, digite o valor 'falso', e clique em OK.
7. Digite o valor '1' no Digite um valor para usar para 'primeira coluna' e, em seguida, clique em OK.
8. Digite o valor '12' no Digite um valor para usar para 'lastcolumn' prompt e, em seguida, clique em OK.
   NOTA: Esta etapa e o passo 4.7 informam a estação de trabalho para realizar uma digestão em 12 colunas de uma placa de 96 poços, resultando em todos os poços da placa sendo usados para digestão
9. Se uma placa de amostra estiver sendo usada com volumes de amostra de pelo menos 20 μL, digite o valor 'true' no Digite um valor para usar no prompt 'SamplePlate' e clique em OK. Se uma placa de amostra não estiver sendo usada, digite o valor 'falso', e clique em OK.
   NOTA: Se uma placa de amostra não estiver sendo utilizada, adicione 5 μL de amostra a cada poço correspondente da placa de reação.
10. Siga as instruções na janela Configuração guiada do Labware e clique em Continuar.
    NOTA: A próxima janela descreve o layout para a "Placa de Reagente" a ser preparada(Figura 7, Tabela Suplementar 1). Os seguintes volumes serão alicitados em cada um dos 8 poços de uma única coluna na placa de 1 mL Deep Round 96-well:
    Coluna 1: 540 μL de Reação Mix 1.
    Coluna 2: 50 μL de Bloco Cisteínse.
    Coluna 3: 730 μL de Reação Mix 2.
    Coluna 4: 130 μL de Tripsina.
    Coluna 5: 130 μL de Solução de Saciedade.
    Coluna 5: 1090 μL de Solução de Fase Móvel (Se o usuário digitou 'true' na etapa 6).
11. Clique em 'Avançar' e a janela seguinte descreve o volume mínimo (20 μL) necessário para ser alicitado na placa Amostra. Se o usuário inseriu o valor 'falso' para o prompt envolvendo a Placa de Amostra (etapa 9), o usuário será solicitado a adicionar amostra de 5 μL à Placa de Reação.
12. Clique em Next.
    NOTA: A próxima janela mostra que uma caixa de ponta vazia de 90 μL deve ser colocada no baralho do manipulador líquido automatizado.
13. Clique em Next novamente, colocando o deck do manipulador de líquido automatizado conforme especificado e ilustrado (Figura 8) incluindo a placa de reagente, a placa de reação, a placa de amostra, a placa autosampler, 6 caixas de ponta completas de 90 μL, uma caixa de ponta vazia de 90 μL e uma caixa de gorjeta de 230 μL completa.
14. Clique em Terminar para iniciar o método.
    NOTA: Após clicar em Concluir,o usuário não pode entrar no manipulador de líquidos automatizado. Isso irá "quebrar a cortina de luz" da máquina e parar o manipulador líquido como precaução de segurança.
15. No Continue após o aviso de centrifugação, recupere a placa de reação e centrífuga-a por 30 minutos a 3.000 rpm.
16. Depois que a centrifugação estiver concluída, retorne a placa de reação ao manipulador líquido automatizado para a posição em que estava antes da centrifugação e clique em Continuar.
    NOTA: O manipulador de líquidoautomatizado pára novamente quando o método estiver concluído. Se o usuário inseriu 'true' para a etapa 6, a placa autosampler pode então ser removida da estação de trabalho e colocada no autosampler de um instrumento de cromatografia líquida para análise.

4. LC-MSMS

1. Resolver peptídeos em um HPLC de alto fluxo composto por um C18 2,1 mm x 100 mm, coluna de 3,5 μm com uma vazão de 0,25 mL/min e analisada inline em um espectrômetro de massa quadrúpole triplo.
   NOTA: Após a digestão dos peptídeos, o método LC-MSMS direcionado para quantificar peptídeos de amostras preparadas robóticas é descrito em detalhes^1, seguindo uma breve descrição de LC-MSMS.
2. Coloque a temperatura do forno da coluna para 40 °C. Use tampão A (2% ACN, 98% água, 0,1% ácido fórmico) e tampão B (95% ACN, 5% água, 0,1% ácido fórmico) como as duas fases móveis.
3. Equilibre a coluna com 5% B por 5 minutos após o carregamento. Eluir os peptídeos ao longo de 30 minutos com um gradiente linear de 5% a 35% do tampão B.
   1. Recicle a coluna antes de carregar a próxima amostra lavando com 98% B por 10 minutos e depois 5% B por 5 minutos.
   2. Para o desvio on-line, desvie o eluente pós-coluna para o resíduo antes de entrar na fonte de íon usando uma válvula de comutação em duas fases.
4. Processe os dados do MRM.

Results

O fluxo de trabalho automatizado de preparação da amostra de proteômica na estação de trabalho automatizada foi adaptado do nosso protocolo automatizado anterior com um robusto método de aquisição LC-SRM-MS¹ para albumina, a proteína plasmática selecionada e β-galactosidase (β-gal), uma proteína exógena usada para controle de qualidade. Após o processamento, as amostras foram executadas em um quadrúpole triplo LC-MS em um ensaio SRM direcionado à albumina de soro, β-galactosidase. O coeficiente de variação (CV) do sinal SRM para cada transição foi utilizado para monitorar a reprodutibilidade do protocolo de digestão automatizada.

Automatizamos as etapas de adição e mistura de reagente para uma digestão de amostras de plasma de 5 μL com uma incubação de tripstrips de 2 horas no convés. Para determinar a reprodutibilidade, 5 μL de uma piscina de plasma foi pipetado em vários poços de uma placa de reação com uma cabeça multicanal (96 pinos). Para monitorar a consistência, adicionamos proteína β-gal antes das reações de redução e alquilação. O fluxo de trabalho automatizado de preparação da amostra de proteômica foi testado com um método robusto de aquisição LC-SRM-MS, incluindo albumina, a proteína plasmática de maior abundância e proteína β-gal, usada para controle de qualidade. Três peptídeos β-gal e dois peptídeos de albumina foram monitorados a partir de proteínas de albumina de plasma processado e proteína β-gal cravada(Tabela 4).

Em um esforço para economizar tempo e simplificar o procedimento, reduzimos as etapas de transferência líquida de adição/mistura/incubação de reagente e mistura de reação com a estação de trabalho de um fluxo de trabalho de nove etapas para um fluxo de trabalho de seis etapas(Figura 1). O fluxo de trabalho proteômico total foi composto por dois componentes experimentais: preparação automatizada da amostra e LC-MS/MS. Em primeiro lugar, avaliamos a precisão da aquisição de dados LC-MS/MS SRM por oito injeções consecutivas do mesmo poço de digestão da placa autoamostradora. A precisão do fluxo de trabalho automatizado de preparação da amostra foi calculada pelo percentual de coeficiente de variância (%CV) do fluxo de trabalho total do SRM proteômico menos%CV da LC-MS/MS (Figura 9B). Com o procedimento de digestão plasmática simplificado na estação de trabalho automatizada, a precisão experimental da preparação automatizada de amostras foi inferior a 11,4% para proteínas β-gal exógenas cravadas (10,0% como média), e menos de 14,9% para a albumina de soro humano mais abundante (9,9% como média)(Figura 9). Foram observadas boas intensidades de sinal tanto para as proteínas sérgica humana quanto para as proteínas β-gal como esperado (Figura 9C).

Para cada etapa de pipetting e transferência de líquidos, as técnicas foram especificamente otimizadas. Para monitorar a precisão das etapas de transferência de líquido, aumentamos os padrões de peptídeos estáveis com rótulo de isótopos (SIL) para proteína de albumina de soro humano endógeno e proteína β-gal exógena em três etapas de transferência independentes: Reaction Mix 1, Cysteine Blocker e Reaction Mix 2(Figura 10). Os sinais MRM desses cinco peptídeos SIL foram adquiridos para monitorar a precisão das etapas de transferência de líquido automatizado. A média %CV para peptídeos, DDNPNLPR^e GDFQFNISR^ (^ representa o aminoácido rotulado N15) do Reaction Mix 1 passo variou de 1,8% a 11,2%. A média %CV de um peptídeo (IDPNAWVER^) da etapa do Bloqueador cisteínse variou de 6,6 a 8,8%. A média %CV de dois peptídeos (WVGYGQDSR^ e LVNEVTEFAK^) variou de 6,2% a 11,9%(Figura 10).

Para validar o fluxo de trabalho automatizado de preparação da amostra proteômica, avaliamos a reprodutibilidade em múltiplas proteínas e vários dias para albumina de soro humano, β-gal exógeno e 40 proteínas plasmáticas adicionais. Processamos 21 amostras de réplica (plasma humano normal) agrupado), localização bem mostrada na Figura 11A,em três dias diferentes. Os CVs intradiários foram calculados a partir de 21 poços preparados no mesmo dia. Os %CVs médios intradiários para 40 proteínas variaram de 4% a 20%(Figura 11B). Para avaliar o efeito de borda do fluxo de trabalho automatizado baseado em placa, %CV foi calculado a partir de poços específicos dentro de colunas e linhas designadas(Figura 12A para coluna e mapa de linha). As intensidades dos sinais mrm foram semelhantes em todas as configurações de coluna e linha com %CV variando de 3% a 22%(Figura 12B).

Em resumo, o fluxo de trabalho automatizado otimizado produz 96 amostras processadas uniformemente em menos de cinco horas com excelente precisão experimental. Para compatibilidade com um fluxo de trabalho automatizado, selecionamos reagentes que têm reações laterais não específicas insignificantes, são estáveis em luz ambiente, são compatíveis com LC-MS/MS e podem ser armazenados como alíquotas congeladas.

Figura 1: Esquema do fluxo de trabalho de preparação da amostra. As 6 principais etapas de transferência de líquidos estão listadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Script de carregamento de ponta. Os detalhes do Script VB são mostrados aqui. O script especifica condições de carregamento de ponta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Layout automatizado do deck da estação de trabalho. O deck é composto por 1x1 ALPs, ALPs de Carregamento de Ponta, Lixo, Lavagem de Ponta, Peltier e uma incubadora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Propriedades da placa de reagente. São mostradas as propriedades necessárias para o labware da placa de reagente quando acessadas usando a configuração de labware guiado. Selecione a coluna correspondente e digite as variáveis indicadas na figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Script de contagem de pontas. Este script ajuda a acompanhar o número de dicas no deck. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Visão geral do método para digestão e cotação de amostras de plasma. Etapas para cálculos de reagentes, configuração de labware e manipulações líquidas no método do manipulador líquido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Layout da placa de reagente. São mostrados os reagentes químicos necessários para a digestão plasmática e preparação do autosampler e distribuídos através do labware da placa reagente. Esta figura foi modificada a partir de uma nota técnica¹⁰. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Layout para o labware no convés da estação de trabalho automatizada. Mostrado é o layout do convés para o método de digestão de plasma para o manipulador líquido. Esta figura foi modificada a partir de uma nota técnica¹⁰. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: A precisão do fluxo de trabalho proteômico total é composta por CV de estação de trabalho e CV LC MS/MS direcionado.
Foram monitorados cinco peptídeos de β-gal e albumina, o tempo de retenção de cromatogramas e peptídeos para cada peptídeo(A),A precisão foi determinada a partir de 30 poços/amostras processando experimento representativo, CVs% para fluxo de trabalho proteômico total, análise lc MS/MS e processamento automatizado de amostras(B). No geral, os peptídeos digeridos mostraram bons sinais variando de 1x10⁵ até 1x10⁸. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Determinação de precisão para etapas de transferência de líquidos. Os peptídeos sintéticos foram cravados em reagentes específicos da etapa, e a transferência automatizada de líquidos foi determinada por total%CV. A partir de 30 poços/amostras experimentem menos% CV LC MSMS (determinado por 8 injeções de MSMS LC repetidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Reprodutibilidade de vários dias do fluxo de trabalho automatizado de preparação da amostra proteômica com análise de 42 proteínas MRM. (A)O mapa da placa de reação para cada um dos três dias é exibido aqui, 5 μL de plasma foi adicionado a cada um dos 21 poços. 3 poços recebidos 5 ul água foram utilizados como controles negativos/em branco. (B) As intensidades médias de 190 transições compreendem 75 peptídeos e 42 proteínas (esquerda) e%CV para cada transição mrm foi calculada a partir de 21 poços de digestão para cada dia (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12: Reprodutibilidade de locais específicos de poços (posição de colunas e linhas). (A)A localização de colunas e linhas com um mapa de placa são mostradas aqui. (B) Localização de coluna e linha sinais msrs específicos de intensidades médias de poços especificados (esquerda) e cv% (direita) a partir de uma única digestão da placa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 13: Captura de tela do editor da técnica. Para cada modelo pipetting, defina as propriedades de sensoriamento de nível líquido, detecção de coágulos, Piercing, Tipo Líquido, Geral, Aspirado, Dispense, Mix e Calibração. O modelo e as técnicas utilizadas neste protocolo são mostrados na Tabela Suplementar 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Variável	Variável	Valor	Descrição
Autosampler	Boolean	Verdade	Use autosampler
Betagal	Inteiro	5	Volume betagal
BG1	Inteiro	0.8	Volume BG1
BG2	Inteiro	0.8	Volume BG2
BG3	Inteiro	0.8	Volume BG3
CysteinBlocker	Inteiro	1.25	Volume do bloqueador de cisteína
CisteínaTamp	Inteiro	0.45	Volume de tampão de cisteína
Desnaturante	Inteiro	5	Volume desnaturante
DigestTransfer	Inteiro	10	Volume de transferência de digestão
Primeiro Buffer	Inteiro	25.9	Primeiro volume de buffer
Primeira Coluna	Inteiro	1	Primeira Coluna
HSA1	Inteiro	0.8	Volume de HSA1
HSA2	Inteiro	0.8	Volume HSA2
últimacoluna	Inteiro	12	Última Coluna
MobilePhase	Inteiro	90	Volume de fase móvel
Saciar	Inteiro	10	Coluna de saciedade
ReduçãodeAgente	Inteiro	5	Coluna de agente redutor
Amostra	Inteiro	5	Coluna de amostra
Placa de amostra	Boolean	Verdade	Use a placa de amostra
SegundoBuffer	Inteiro	58.4	Segundo volume de buffer
Tripsina	Inteiro	10	Coluna de tripsina

Tabela 1: Iniciar variáveis de etapa

Valor	Variável
=FirstBuffer+Denaturant+ReducingAgent+Betagal+BG1+HSA1	FirstMix
=CysteineBlocker+CysteineBuffer+BG2	CysteineMix
=SecondBuffer+BG3+HSA2	SegundoMix
=(FirstMix*Colunas)+30	FirstMixwell
= (CisteínaMix*Colunas)+20	Cisteína
=(SecondMix*Colunas)+10	SecondMixwell
=(Tripspsin*Colunas)+10	TrypsinWell
=(Quench*Colunas)+10	QuenchWell
=(FirstMixwell*8)+100	FirstMixstock
=CysteineWell*8+20	CysteineMixStock
=(SecondMixwell*8)+100	SecondMixStock

Tabela 2: Variáveis de mixagem de volume

Tipo	Nome	Posição	Profundidade	Propriedades	Usar?
BCDeep96Round	Placa de reagente	P5	1 (topo)	#	=não Amostradeplaca
BCDeep96Round	Placa de reagente	P5	1 (topo)	#	=SamplePlate
BCDeep96Round	Placa de Reação	P11	1 (topo)		Verdade
Bio_RadPCR96*	Amostras	P9	1 (topo)		=SamplePlate
Bio_RadPCR96*	Placa de autoamostrar	P10	1 (topo)		=Autosampler
BC90	Vazio		1 (topo)		Verdade
BC90			1 (topo)		Verdade
BC90			1 (topo)		Verdade
BC230			1 (topo)		=Autosampler
BC90			1 (topo)		=Colunas>1
BC90			1 (topo)		=Colunas>3
BC90			1 (topo)		=Colunas>5
BC90			1 (topo)		=Colunas>7
BC90			1 (topo)		=Colunas>9
Nota: *: Corresponde à placa Bio-Rad de 96 poços. #: Clique em propriedades e, em seguida, insira as variáveis de volume indicadas na Figura 6.

Tabela 3: Configuração da configuração guiada

Proteína ID	Sequência de peptídeos	Missa Q1 (Da)	Massa do Q3 (Da)	Tempo (min)	Íon fragmento	Potencial de desagrupamento	Energia de colisão	Potencial de saída da célula de colisão
sp| P00722| BGAL_ELOCI	GDFQFNISR	542.3	262.1	19.7	+2y2	61	21	8
		542.3	636	19.7	+2y5	61	25	12
		542.3	764.2	19.7	+2y6	61	25	18
	IDPNAWVER	550.3	436.1	18.1	+2y7+2	61	23	8
		550.3	871.2	18.1	+2y7	61	25	18
		550.3	774.2	18.1	+2y6	61	33	8
	WVGYGQDSR	534.3	782.1	12.1	+2y7	51	25	6
		534.3	562.1	12.1	+2y5	51	27	6
		534.2	505.2	12.1	+2y4	90	25	8
sp| P02768| ALBU_HUMAN	DDNPNLPR	470.8	596.2	9.2	+2y5	61	27	16
		470.8	499.3	9.2	+2y4	61	27	18
		470.8	710.4	9.2	+2y6	61	27	18
	LVNEVTEFAK	575.3	694.4	18.2	+2y6	73.1	29.6	18
		575.3	937.5	18.2	+2y8	73.1	29.6	18
		575.3	823.4	18.2	+2y7	73.1	29.6	18

Tabela 4: Parâmetros de MRM

Tabela suplementar 1: Placa de reagente Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela Suplementar 2: Modelo de protocolo Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

O processamento amostral para espectrometria de massa requer desnaturação, redução e alquilação de proteínas para bloquear cisteínas, e digestão de tripsina para fixar proteínas em peptídeos. Cada reação química ou enzimática precisa ser iniciada em um horário designado e realizada a uma temperatura controlada, e cada etapa do processo envolve várias etapas de transferência de líquido onde a variação experimental pode ser introduzida. O processamento automatizado de amostras fornece uma solução para este dilema. Os sistemas de manuseio de líquidos atualmente disponíveis têm a capacidade de transferir reagentes para placas de 96 poços com precisão e precisão inferior a 5%, dependendo do tipo de cabeça e ponta utilizada, e de incubar amostras, com agitação, se desejar, sob temperaturas controladas variando de 14 °C a 70 °C. Usamos um manipulador de líquido automatizado para processar plasma para ensaios SRM em um formato de 96 poços.

Existem milhares de locais de decote sérica dentro das complexas misturas de proteínas em soro, plasma e outras amostras biológicas; e cada uma dessas proteínas tem propriedades únicas que afetam a acessibilidade do local do decote e a estabilidade dos peptídeos resultantes. É, portanto, impossível projetar um procedimento de processamento de amostra que seja ideal para cada proteína. A melhor alternativa é ser o mais consistente possível.

Para obter consistência, otimizamos cada etapa de pipetting realizada pelo manipulador líquido automatizado. Primeiro consideramos o volume necessário e as restrições impostas pelo tipo do líquido (plasma, aquoso ou orgânico) e propriedades correspondentes (viscosidade, coesão e volatilidade), hardware (braços pipetting-head e plate-grabbing da estação de trabalho) e labware. Em seguida, variou a velocidade e a abertura do ar para aspiração, a velocidade e o volume de sopro para dispensação, e a força e duração da mistura, ao mesmo tempo em que incorporamos um toque de ponta após aspiração e/ou dispensando, se necessário, para eliminar a adesão líquida à parte externa das pontas(Figura 13, Tabela Suplementar 1). Um peptídeo SIL único, pré-selecionado para estabilidade, foi cravado em cada reagente para permitir monitorar a precisão de cada etapa de manuseio de líquidos. Após a otimização, os CVs do processo para a maioria das transições foram inferiores a 10%, demonstrando boa reprodutibilidade com a estação de trabalho automatizada (Figura 9, Figura 10, Figura 11 e Figura 12).

O fluxo de trabalho automatizado aqui apresentado prevê uma digestão enzimática consistente com melhor reprodutibilidade e throughput em comparação com os métodos manuais(Figura 9, Figura 10). Esta abordagem promete melhorar a precisão e a confiabilidade da descoberta e validação de biomarcadores por espectrometria de massa.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Um plasma humano saudável agrupado	Bioreclamation Inc.		plasma humano testado no manuscrito
Acetonitrila, HPLC Grau	Thermo Fisher Scientific	A998SK1	LC MS/MS solvente
B-Galactosidase Recombinante de E.Coli	Sigma-Aldrich	G3153-5MG	proteínas de controle exógenas.
Estação de trabalho automatizada Biomek i7	Beckman Coulter, Inc.		A estação de trabalho de preparação de amostras proteômicas: As estações de trabalho automatizadas Biomek não se destinam ou são validadas para uso no diagnóstico de doenças ou outras condições
Biomek i-Series Tips 230µ L Não estéril	Beckman Coulter, Inc.	B85903	Pontas, consumíveis i7
Pontas Biomek i-Series 90µ L Não estéril	Beckman Coulter, Inc.	B85881	Pontas, consumíveis i7
FG, Kit Tripsina TPCK	Sciex	4445250	Tripsina usada na digestão
Placas PCR de 96 Poços de Casca Dura, perfil baixo, parede fina, saia, verde/transparente	Bio-Rad	#hsp9641	placa de amostrador automático
Octyl B-D-Glucopyranoside	Sigma-Aldrich	O9882-5G	detergente usado na digestão
Polipropileno, placas de poços profundos de 96 rodadas estéreis	Beckman Coulter, Inc.	267007	Reagente e placa de digestão
Proeminência UFLCXR Sistema HPLC	Shimadzu, Japão		Sistema LC de alto fluxo
QTRAP 6500	SCIEX		Espectrômetro de massa
Água, HPLC Grau	Thermo Fisher Scientific	W54	LC MS/MS solvente
Xbridge BEH30 C18 2,1 mm x 100 mm	Águas	186003564	LC Coluna MSMS