Método ex vivo para avaliar a motilidade espontânea do trato reprodutivo do mouse e um algoritmo de rastreamento de movimento do útero baseado em MATLAB para análise de dados

Como um órgão fêmea principal, o útero é crucial para a reprodução e essencial para a nutrição do feto¹. O útero consiste em três camadas: o perimetrium, o miométrio e o endométrio. O miométrio é a camada contrátil principal do útero e joga um papel chave na entrega do feto. O endométrio é a camada mais interna que reveste a cavidade uterina e é essencial para a implantação do embrião. Em fêmeas não gestantes em idade reprodutiva, a camada endometrial é vertida mensalmente no início do ciclo menstrual. O miométrio auxilia neste processo de derramamento, mantendo as contrações miometrial espontâneas necessárias para limpar o tecido endometrial necrótico do útero¹.

Infelizmente, aumento da contratilidade miometrial pode resultar em efeitos colaterais negativos, tais como dismenorreia, ou cãibras menstruais dolorosas. Isto é especialmente observado em fêmeas jovens e mulheres nulíparas². No entanto, a dismenorreia é diferente para cada mulher e depende da força de suas contrações miometrial; as contrações mais fortes são frequentemente associadas com a sensação de cãibras severas³. A contratilidade miometrial pode ser visualizada usando ultrassonografia uterina e muitas vezes é reconhecida como ondas endometriais. A liberação aumentada das prostaglandinas durante a menstruação⁴ em um útero que submete-se a descamação endometrial é acreditada para contribuir ao hypercontractility myometrial aumentado, tendo por resultado a isquemia e o hipóxia do músculo uterine e aumentado assim dor³.

Dismenorreia severa pode dificultar a atividade do dia-a-dia de algumas mulheres e 3 a 33% das mulheres têm dor muito severa, o que poderia causar uma mulher a ser acamados por 1 a 3 dias cada ciclo menstrual⁵. A dismenorreia é a principal causa de morbidade ginecológica em mulheres em idade reprodutiva, independentemente da idade, nacionalidade e status econômico⁵. A prevalência estimada de dismenorreia é alta e variável, variando de 45% a 93% em mulheres em idade reprodutiva⁵.  A dor associada à dismenorreia tem efeito no cotidiano das mulheres e pode resultar em mau desempenho acadêmico em adolescentes, menor qualidade de sono, restrição de atividades diárias e alterações de humor⁵.

Muitas mulheres que experimentam dismenorreia grave recorrer a medicamentos over-the-counter para aliviar a sua dor. Tais medicamentos de balcão contêm inibidores da ciclooxigenase (COX) que impedem a formação de prostaglandinas⁶. No entanto, os inibidores da COX estão associados a eventos cardiovasculares adversos, e cerca de 18% das mulheres com dismenorreia não respondem a esses inibidores⁷. Portanto, há uma necessidade de novos medicamentos para reduzir as cólicas menstruais. Desde que sobre o contratilidade do útero contribui à patogénese do dysmenorrhea, uma estratégia possível pode ser o uso de relaxants uterine.

É benéfico quantificar os efeitos de drogas relaxantes potenciais em um modelo de ocorrência natural myometrial espontâneo-como contrações de onda. Entretanto, assim distante, nenhum método ex vivo eficiente para testar drogas músculo-relaxando no útero intacto foi descrito. Atualmente, medições de tensão isométrica são usadas para avaliar os efeitos de drogas relaxantes. Durante tais medidas, uma tira do músculo uterine é mantida em um comprimento constante a pré-carga em um banho do tecido quando a força de contrações do músculo uterine for gravada antes e depois da estimulação do ocitocina na presença ou na ausência de uma droga relaxante. Embora esta aproximação seja muito útil, exige o equipamento caro. Além disso, as contrações isométricas não se assemelham às contrações myometrial espontâneas da onda-como que ocorrem naturalmente no útero intacto. Excepcionalmente, as ondas myometrial uterine nos roedores podem ser visualizadas como a motilidade uterine do chifre quando o intervalo reprodutivo inteiro (ovários, oviducts, útero, e vagina) é mantido em uma solução do amortecedor. Aqui, nós apresentamos um método ex vivo para monitorar a motilidade espontânea do útero intacto do rato coloc em um prato de Petri que contem o amortecedor oxigenado de Krebs. Também descrevemos um algoritmo de quantificação da motilidade utilizando o rastreador de movimento MATLAB. Esta nova abordagem fornece uma alternativa fácil e menos dispendiosa para testar o potencial relaxante de remédios que ocorrem naturalmente e compostos sintéticos.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina da Universidade de Indiana (Indianapolis, IN). 2-5 mês-velho F2-129S-C57BL/6 ratos fêmeas sexualmente maduros foram utilizados no estudo.

Atenção: Assegure a segurança desgastando um revestimento, uma máscara, e umas luvas do laboratório ao trabalhar com animais e materiais bioperigosos.

1. preparação da solução

1. Prepare o tampão Krebs, que contém: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,2 mm NaH₂po₄, 0,56 mM MgCl₂, 25 mm NaHCO₃e 5 mm glicose, pH 7,4. Oxigenar continuamente o tampão Krebs com uma mistura de gases compridos contendo 5% CO₂ e 95% o₂ , mantendo a temperatura tampão a 37 ° c usando um banho de água circulante.
2. Prepare a solução salina tamponada por fosfato de Dulbecco (DPBS), que contém: 2,68 mm kcl, 1,47 mm KH₂po₄, 136,89 mm NaCl e 8,1 mm na₂HPO₄, pH 7,4.

2. preparação animal

1. Anestesiando camundongos usando inalação de isoflurano (3%) com a eliminação de gases residuais. Assegure a anestesia adequada avaliando reflexos da retirada. Aperte o dedo traseiro para afirmar que não há movimentos são eliciados, indicando a perda de respostas reflexas. Após a anestesia profunda é alcançada, eutanizar o animal por decapitação.
   Nota: Isoflurano pode causar dilatação do músculo liso. Portanto, a preparação do trato reprodutivo deve ser extensivamente lavada e incubada no tampão Krebs por pelo menos 15-30 min antes de iniciar os experimentos ex vivo. O isoflurano pode causar irritação e desconforto quando está em contacto com a pele, por isso proceda com precaução.
2. Coloc o corpo em um grande barco do pesar alinhado com uma toalha de papel.
   Nota: O pessoal de laboratório feminino grávida não deve estar envolvido em experimentos com isoflurano, pois pode diminuir o peso fetal, diminuir a ossificação esquelética fetal e aumentar o risco de aborto espontâneo^8,9. A inalação de CO₂ pode ser usada como um substituto para eutanizar camundongos.

3. determinação da fase de ciclo estral

1. Com fórceps pequeno, levante o clitóris para ganhar o acesso ao óstio vaginal e insira lentamente uma ponta da micropipeta que contem 10 μL de dpbs no vagina.
   1. Assegure-se de que a ponta da micropipeta seja inserida através do óstio em um ângulo de 10-30 ° para evitar perfurar a parede vaginal. O líquido ainda deve ser visível na ponta após a inserção. Se o líquido não é visível, a ponta foi inserida demasiado distante no vagina, e a área paracervicais do vagina pôde ter sido perfurada.
   2. Puxe levemente para baixo nos músculos do óstio vaginal com a ponta da micropipeta para permitir que o ar saia da vagina.
2. Lave lentamente a cavidade vaginal pipetando para cima e para baixo 2-3 vezes com 10 μL de DPBS e coloque a suspensão de células desenhadas numa lâmina de vidro.
3. Use um microscópio de contraste de fase invertida para determinar o estágio de ciclo estral através da análise citológica. O procedimento é feito conforme descrito em outros^10,11. Assegure-se de que a suspensão celular não seque antes que a análise citológica possa ser realizada. A suspensão pode ser diluída com DPBS fresco, se necessário.

4. Ddissecção do trato reprodutivo do rato

1. Arranje o rato em uma posição supina e espalhe suas extremidades para expor a região abdominopelvic.
2. Spray com 70% de etanol para umedecer e desinfectar a área abdominopélvica.
3. Usando fórceps, levante cuidadosamente a pele localizada superior ao clitóris. Fazer pequenas incisões transversais nos aspectos laterais da área abdominal inferior, até as extremidades superiores para expor o peritônio (Figura 1a). Durante este processo, uma aleta externa formarão. Porque as incisões pequenas são feitas continuamente, a aleta aumentará no tamanho.
4. Corte cuidadosamente o peritônio para expor o trato gastrointestinal (Figura 1B). É importante notar que os chifres uterinos podem muitas vezes ser localizado diretamente o peritônio, para fazer incisões cautelosamente e não tocar os chifres, pois isso pode afetar a motilidade uterina.
5. Usando fórceps, retire a fáscia e tecido adiposo cobrindo o trato gastrointestinal. Remover os seguintes segmentos do trato gastrointestinal da cavidade abdominal: o duodeno, jejuno, íleo, cálio, cólon ascendente e transverso (Figura 1C).
6. Para localizar os órgãos reprodutivos, primeiro identifique a bexiga urinária (Figura 1C, "4"), que pode ter uma aparência deflacionada devido à micção após a eutanásia. A vagina estará bem embaixo da bexiga urinária.
7. Localize a sínfise púbica na confluência dos ossos púbica (caudally à bexiga).
8. Usando tesouras, retire a sínfise púbica, fazendo incisões cuidadosamente em seus lados laterais através do tecido fibrocartilaginoso interpúbica para obter acesso e fornecer uma rota para a extração da vagina (Figura 1D).
9. Corte através do períneo localizado entre o ânus e a parte inferior da vulva.
10. Usando fórceps, levante a vagina e retire lentamente o reto.
11. Identifique dois chifres uterinos que se bifurcam em um garfo, rostralmente para a vagina. Localize um oviduto e um ovário complicado no fim de cada chifre, que pode ser escondido os segmentos restantes do aparelho gastrointestinal. Use tesouras de dissecação pequenas para remover todos os ligamentos que conectam e suportam os chifres, os oviducts, e os ovários dentro da cavidade abdominal.
12. Retire o trato reprodutivo, que inclui a vagina, útero, ovidutos e ovários, a partir da cavidade abdominal.
13. Transferir o trato reprodutivo isolado (Figura 1E) para um prato de Petri de 100 mm preenchido com 10 ml de dpbs. Não comprima os chifres uterinos para evitar danificar o miometrium.
14. Use fórceps e tesoura cirúrgica para remover qualquer tecido conjuntivo e adiposo em torno dos chifres uterinos e vagina, bem como qualquer pele na região Púnica que poderia dificultar a qualidade da imagem. Retire o ligamento largo para permitir a motilidade dos chifres uterinos.
15. Lave o trato reprodutivo isolado com o DPBS fresco duas vezes e transfira-o para um prato de Petri de 35 mm preenchido com 3 mL de solução de Krebs oxigenada.

5. imagem latente do tecido

1. Coloque a placa de Petri contendo o trato reprodutivo no tampão de Krebs oxigenado em uma superfície preta. Mantenha o prato à temperatura ambiente.
   Nota: É possível usar uma almofada de aquecimento infravermelha para manter o tecido em 37 ° c.
2. Aguarde 15-30 min para que as contrações espontâneas comecem. Grave a motilidade uterina espontânea por 10 min de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.
3. Transfira a preparação para uma placa de Petri contendo o tampão de Krebs oxigenado suplementado com um composto de teste. Grave a motilidade uterina espontânea por cerca de 10 min de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.
4. Lave todo o trato reprodutivo em 100 mm prato de Petri com 10 mL de DPBS para avaliar a reversibilidade do tratamento.
5. Transfira a preparação para uma placa de Petri com o tampão Krebs recém-oxigenado. Grave a motilidade uterina espontânea por cerca de 10 min de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.
6. Transfira a preparação para outro prato de Petri de 35 mm preenchido com tampão de Krebs oxigenado suplementado com o veículo para o composto de teste para garantir que não haja alterações induzidas mecanicamente na motilidade uterina espontânea. Este é um controle importante.
7. Transfira a gravação de vídeo para um disco rígido do computador.

6. análise de dados

1. Faça clipes usando qualquer software de edição de vídeo da filmagem original contendo o controle, tratamento e episódios de lavagem.
2. Use o software MATLAB e o script fornecido (consulte o material complementar on-line) para quantificar a motilidade uterina espontânea.
   Nota: O complemento Computer Vision Toolbox para MATLAB deve ser instalado para que o script seja totalmente funcional.
   1. Abra o script MATLAB, vá para a guia Editor e clique em executar.
   2. Selecione o primeiro arquivo de vídeo e clique em abrir.
   3. Insira um rótulo para o arquivo de vídeo na caixa de diálogo pop-up e clique em OK.
   4. Insira o (s) intervalo (es) de tempo necessário para calcular a taxa de movimento do chifre (distância Δ euclidiana/ΔS).
   5. Use o cursor do mouse para selecionar dois pontos no primeiro quadro do vídeo. Uma janela pop-up pedirá para confirmar que os pontos selecionados devem ser usados para o rastreamento. Clique em Iniciar para iniciar o processo de rastreamento em tempo real que será exibido na janela pop-up. Como alternativa, clique em selecionar pontos para selecionar novamente os dois pontos.
   6. Monitore a precisão do processo de rastreamento na janela pop-up.
   7. Observe um gráfico de dispersão de taxa versus tempo e distância versus gráfico de dispersão de tempo em uma nova janela pop-up. Salve as duas figuras selecionando arquivo | Salvar como na mesma janela para documentar os dados.
   8. Localize uma pasta denominada Pointtrackerdata, criada automaticamente pelo MATLAB, no mesmo diretório onde o script MATLAB está localizado. Identifique um arquivo do Excel denominado label_Data contendo pontos de dados coletados do vídeo em duas guias de planilha separadas.
      Nota: qualquer software de rastreamento de movimento alternativo pode ser usado para quantificar a motilidade espontânea do útero.
3. Use um software apropriado (por exemplo, Excel ou SigmaPlot 13) para realizar a análise estatística.

A Figura 1 mostra imagens representativas tiradas durante todo o procedimento de isolamento do trato reprodutivo descrito neste protocolo. Para evitar contaminar o tampão com pêlo, o que diminuiria a qualidade do vídeo, umedecido o corpo do mouse com 70% de etanol. A principal referência para a seção de dissecção do protocolo é encontrar a bexiga urinária. O útero ea vagina será localizado inferior à bexiga urinária.

Para testar o protocolo, tratamos todo o trato reprodutivo com epinefrina. A epinefrina é bem conhecida por causar relaxamento do músculo liso uterino. Este hormônio é produzido endogenamente na medula adrenal e serve como um hormônio do estresse em mamíferos. Nós usamos epinefrina de 1 μM em nossos experimentos. Esta é uma concentração saturando conhecida para causar a resposta máxima12. Uma série de quatro experimentos foi realizada. Em todos os ensaios, 1 μM de epinefrina reversivelmente inibiu a motilidade uterina espontânea (Figura 2).

Para quantificar a motilidade espontânea do trato reprodutivo, projetamos um algoritmo que nos permite avaliar a taxa média de mudança na distância euclidiana entre dois pontos selecionados no trato reprodutivo do camundongo. As posições de ponto são rastreadas usando o módulo de rastreamento de movimento do software MATLAB. O roteiro correspondente para o MATLAB, que usamos para calcular as distâncias euclidianas, é fornecido no material suplementar online. A posição dos pontos é fundamental para um procedimento de rastreamento de movimento bem-sucedido. A consideração cuidadosa deve ser tomada a respeito da qualidade dos vídeos porque as reflexões claras da parede da placa de Petri podem distrair o perseguidor de movimento, e pode parar de seguir o movimento do chifre ao re-atribuindo o ponto a um da luz Reflexões. Optou-se por colocar um dos pontos no meio de um chifre para garantir que era longe o suficiente das reflexões parede prato de Petri. O segundo ponto foi selecionado geralmente no vagina desde que não exibiam a motilidade espontânea. A Figura 3 fornece uma amostra de análise de dados e a Figura complementar 1 mostra as imagens representativas adquiridas durante o acompanhamento de movimento.

Figura 1 : Etapas de isolação inteira do intervalo reprodutivo. (A) uma incisão na pele foi feita e a região abdominopélvica foi exposta acima do peritônio (1). (B) a membrana serosa foi lentamente aberta para expor o trato gastrointestinal (2). (C) o trato gastrointestinal foi movido para expor os chifres uterinos (3). A bexiga urinária (4) pode ser visualizada perto da conjunção dos chifres. (D) os chifres uterinos foram liberados e os cortes foram feitos nos lados laterais da sínfise púbica (5) para expor a vagina (6). (E) remoção do trato reprodutivo isolado e colocação em solução de dpbs. Qualquer excesso de pele ou tecido conjuntivo foi removido. (F) um recuo profundo pode ser visto na vagina (direita) após a remoção do reto (esquerda, 7). (G) o tecido conjuntivo circundante é removido. Uma câmera digital e software Application Suite (versão 3.7.0) foi usado para adquirir imagens em tempo real durante a dissecção (configuração da câmera: Hue 20/Saturation 80). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Um experimento representativo com todo o trato reprodutivo isolado é mostrado. As imagens foram realizadas 15 s separadas antes (a), durante (B), e após (C) a aplicação de epinefrina 1 μm. A preparação do trato reprodutivo exibiu alta motilidade nos painéis A e C na ausência de epinefrina, mas é quiescente no painel B com a presença de epinefrina a 1 μM. A gravação de vídeo não editada é fornecida como vídeos complementares 1-3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Análise de dados no experimento ex vivo descrito em Figura 2. (A) um curso do tempo da taxa euclidiana da mudança da distância é mostrado. Os pontos de referência entre os quais a distância foi determinada durante a motilidade uterina espontânea são mostrados como pontos verdes no Inset. Os pontos foram selecionados na parte proximal do vagina e no segmento médio de um chifre uterine como representado. Os círculos cheios azuis mostram os valores espontâneos da taxa da motilidade antes de adicionar a epinefrina, os círculos vermelhos mostram as taxas espontâneas da motilidade na presença da epinefrina de 1 μM, e os círculos cheios verdes mostram as taxas espontâneas da motilidade após um washout. (B) uma comparação das taxas médias de mudança de distância euclidiana (pixels/s) antes da adição de epinefrina (barra azul), na presença de 1 μm de epinefrina (barra vermelha), e após um washout (barra verde). O software MATLAB foi utilizado para quantificar a motilidade uterina. O intervalo Δt foi fixado em 5 s. "ΔDistance" é calculado como a diferença entre a distância do quadro inicial e a distância do quadro 5 s mais tarde. A análise estatística foi realizada utilizando-se a análise de variância One Way de Kruskal-Wallis em fileiras seguidas de todos os procedimentos de comparação múltipla emparelhando de acordo com o método de Dunn usando SigmaPlot 13. O asterisco indica o conjunto de dados que foi significativamente diferente dos outros conjuntos de dados experimentais (P = < 0,001). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme suplementar 1: clipe de vídeo Time-Lapse mostrando motilidade uterina espontânea antes de adicionar 1 μm de epinefrina. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)

Filme suplementar 2: clipe de vídeo Time-Lapse mostrando motilidade uterina espontânea quando o tampão de Krebs foi suplementado com epinefrina a 1 μm. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)

Suplementar filme 3: Time-Lapse clipe de vídeo mostrando motilidade uterina espontânea após washout. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)

Complementar Figura 1: imagens representativas tiradas a cada 15 s durante o rastreamento de movimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Material suplementar: o script de algoritmo de rastreamento baseado em MATLAB. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm nada a revelar.