Gene direto knock-out de células-tronco neurais da medula espinhal Axolotl via eletroporação de complexos de proteína-gRNA CAS9

Resumo

É apresentado aqui um protocolo para executar a batida-para fora do gene tempo-e espaço-restrito em cordas espinais do Axolotl injetando o complexo de CAS9-gRNA no canal central da medula espinal seguido pelo Electroporation.

Resumo

O Axolotl tem a habilidade original de regenerar inteiramente sua medula espinal. Isto é pela maior parte devido às pilhas ependymal permanecendo como pilhas de haste neural (NSCS) durante todo a vida, que proliferar para reformar o tubo ependymal e para diferenciar-se em neurônios perdidos após ferimento da medula espinal. Deciphering como estes NSCS mantêm o borne-desenvolvimento do pluripotência e proliferar em cima da lesão da medula espinal para reformar a estrutura exata do pre-ferimento pode fornecer a introspecção valiosa em como os cabos espinais mamíferos podem regenerar assim como opções potenciais do tratamento. Executar knock-outs do gene em subconjuntos específicos de NSCS dentro de um período de tempo restrito permitirá o estudo dos mecanismos moleculars atrás destes processos regenerativa, sem ser confundidos pelo desenvolvimento que perturbam efeitos. Descrito aqui é um método para realizar o knock-out do gene no NSCs da medula espinal de Axolotl usando o sistema de CRISPR-Cas9. Injetando o complexo de CAS9-gRNA no canal central da medula espinal seguido pelo Electroporation, os genes do alvo são nocauteados para fora em NSCs dentro das regiões específicas da medula espinal em um timepoint desejado, permitindo estudos moleculars de NSCs da medula espinal durante Regeneração.

Introdução

A medula espinal da maioria de vertebrados é incapaz de regenerar depois da lesão, conduzindo à inabilidade permanente. Várias salamandras, como o Axolotl, são exceções notáveis. O Axolotl pode regenerar inteiramente uma medula espinal estruturalmente idêntica e restaurar completamente a função da medula espinal. Grande parte da capacidade regenerativa da medula espinhal Axolotl é devida a células ependímicas. Estas células alinham o canal central, e ao contrário daquelas em mamíferos, as pilhas ependymal de Axolotl permanecem como pilhas de haste neural (NSCs) desenvolvimento borne-Embryonic. Após ferimento da medula espinal (por exemplo, de uma amputação da cauda), ....

Protocolo

Todos os experimentos com animais devem ser realizados de acordo com as regulamentações locais e nacionais sobre experimentação animal e com a aprovação do quadro de revisão institucional pertinente.

1. preparando a mistura de CAS9-gRNA RNP

1. Projetar e sintetizar gRNAs.
   Nota: refira outras publicações para projetar e sintetizar grnas, incluindo um exclusivamente a respeito dos axolotls^15,20,21,22.
2. Obtenha proteína CAS9-NLS preparando-se em casa ou comprando-a comercialmente.
3. Prepare....

Resultados

A injeção e o electroporation do complexo de CAS9-gRNA de encontro a Sox2 no canal central da medula espinal do Axolotl conduziram a uma perda maciça de immunoreactivity Sox2 em uma maioria de NSCS da medula espinal, com o grna de encontro ao tyrosinase (Tyr) como um controle (Figura 2 A). B3-tubulin (manchado com TUJ1) é um marcador para neurônios e não foi expressa em NSCS, e SOX2-TUJ1-células que cercam o canal central foram consideradas células abrigando SOX.......

Discussão

O protocolo descrito permite que o tempo e o espaço restringidos o gene knock-out nos NSCs na medula espinal do Axolotl. O protocolo atual permite direcionamento específico de NSCs em um tempo definido e local com alta penetrância. Evita potenciais efeitos indesejáveis originários de nocaute genético em NSCs em outras regiões, como o cérebro que ocorrem ao usar o sistema CRE-LoxP. Também evita efeitos de desenvolvimento originados de um knock-out persistente, permitindo o estudo da função gênica focada na regeneração. Al.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Benzocaína	Sigma-Aldrich	E1501-100G
Benzocaína 0,03% (peso/vol)	Misture 500 ml de 10&vezes; TBS, 500 ml de Holtfreter a 400% (peso / vol) » S e 30 ml de solução-mãe de benzocaína a 10% (p/vol). Encha o volume até 10 L com dH2O. A solução pode ser armazenada em temperatura ambiente por até 6 meses.
Benzocaína 10 % (p/vol)	Misturar 50 g de benzocaína em 500 ml de etanol a 100 % (vol/vol). A solução pode ser armazenada em temperatura ambiente por até 12 meses.
Capilares de vidro borossilicato 1,2 mm O.D., 0,94 mm I.D.	Instrumento de gagueira	BF120-94-8
CaCl2· 2H2O	Merck	102382
tampão CAS9, 10x	Misture 200 mM HEPES e 1,5 M KCl em água livre de RNase. Ajuste o pH para 7,5. Filtre esterilize, alíquota e armazene em − 20 ° C por até 24 meses
proteína CAS9-NLS	PNA Bio	CP03
, 10cm	Falcon	351029
Dumont #5 - Pinça Fina	Instrumentos Científicos Finos	11254-20
Eletroporador	Nepa Gene	NEPA21
	BEX	CUY21EDIT II
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Fast Green FCF Solution, 5x	Dissolver 12,5 mg de pó Fast Green FCF em 10 mL de 1× Pbs.
Extrator de Micropipeta Flamejante/Marrom	Instrumento de gagueira	P-97
Holtfreter' s solução 400% (wt/vol)	Dissolver 11,125 g de MgSO4· 7H2O, 5,36 g de CaCl2· 2H2O, 158,4 g de NaCl e 2,875 g de KCl em 10 L de dH2O. A solução pode ser armazenada em temperatura ambiente por até 6 meses.
KCl	Merck	104936
MgSO4· 7H2O	Pontas
Microloader	Eppendorf	5242956003
Micromanipulador	Narishige	MN-153
NaCl	Merck	106404
Pneumática PicoPump	World Precision Instruments	Pinça de Anel SYS-PV830
	Fine Scientific Instruments	11103-09
Estereomicroscópio	Olympus	SZX10;
Tris base	Sigma-Aldrich	T6066
Solução salina tamponada com Tris, 10x	Dissolver 24,2 g de base Tris e 90 g de NaCl em 990 ml de dH2O. Ajuste o pH para 8,0 adicionando 10 ml de HCl a 37% (vol/vol). A solução pode ser armazenada em temperatura ambiente por até 6 meses.
Pinças com Gap Variável 2 Eletrodos de Placa de Platina Redonda, diâmetro de 10mm	Gene Nepa

Pratos de cultura de células Gerador de pulso de pipeta Merck 105886 CUY650P10