Formação de esferóides da célula do ligamento periodontal humano em filmes de quitosana

Resumo

Aqui, nós apresentamos protocolos de cultivo de esferoides da pilha do ligamento periodontal humano (PDL) por películas do quitosana. A cultura de esferoides celulares tridimensionais (3D) fornece uma alternativa ao sistema convencional da cultura do poliestireno da cultura do tecido (TCPs).

Resumo

As pilhas do ligamento peridental (PDL) prendem a grande promessa para a regeneração peridental do tecido. Convencionalmente, as células PDL são cultivadas em substratos bidimensionais (2D), como poliestireno de cultura tecidual (TCPS). Entretanto, as mudanças características de pilhas de PDL foram observadas durante a cultura in vitro. Este fenômeno é provavelmente porque o 2D TCPS difere do in vivo tridimensional (3D) microambiente. Comparado às células cultivadas em substratos 2D, as células cultivadas em um microambiente 3D exibem mais semelhanças com as células in vivo. Portanto, os modelos de cultura de células 3D fornecem uma alternativa promissora para a cultura de células monocamada 2D convencional. Para melhorar os modelos convencionais da cultura de pilha de PDL, nós desenvolvemos recentemente um método da cultura da pilha 3D, que seja baseado na formação esferóide de pilhas de PDL em películas do quitosana. Aqui, nós apresentamos protocolos detalhados da cultura do esferóide da pilha baseados em películas do quitosana. O sistema da cultura 3D de esferoides celulares de PDL supera algumas das limitações relativas à cultura convencional da pilha da monocamada 2D, e pode assim ser apropriada produzindo pilhas de PDL com uma eficácia terapêutica realçada para a regeneração peridental futura do tecido.

Introdução

A periodontite, inicializada principalmente pela placa dentária¹, caracteriza-se pelo dano dos tecidos periodontais, incluindo o ligamento periodontal (PDL), o osso alveolar e o cementum. Os tratamentos atuais para o periodontite são geralmente bem sucedidos em impedir o progresso da doença ativa, mas a regeneração de tecidos peridentais perdidos permanece um desafio clínico. Recentemente, avanços importantes foram feitos em abordagens baseadas em células para a regeneração tecidual periodontal para superar as desvantagens dos tratamentos atuais^2,3,4.

Nossa revisão sistemática prévia revelou que as pilhas de PDL mostraram o grande potencial para a regeneração peridental⁵. Convencionalmente, as células PDL são cultivadas em substratos bidimensionais (2D), como poliestireno de cultura tecidual (TCPS). No entanto, alterações características das células PDL foram observadas durante a cultura in vitro⁶. Este fenômeno é provavelmente porque o 2D TCPS difere do in vivo tridimensional (3D) microambiente⁷. Comparado às células cultivadas em substratos 2D, as células cultivadas em um microambiente 3D exibem mais semelhanças com as células in vivo⁸. Portanto, os modelos de cultura de células 3D fornecem uma alternativa promissora para a cultura de células monocamada 2D convencional.

O método convencional da cultura 3D está encapsulando pilhas em biomateriais 3D. Comparado com as células encapsuladas em biomateriais 3D, os esferoides celulares imitam a situação in vivo mais de perto porque os esferóides são agregados de células que crescem livres de materiais estranhos^{9,10,11, 12}. é relatado que os esferóides celulares promoveram BIOATIVIDADES do MSC através da preservação dos componentes da matriz extracelular (ECM), incluindo fibronectina e laminina¹³. Para melhorar os modelos convencionais da cultura de pilha de PDL, nós desenvolvemos recentemente um método da cultura de pilha de 3D PDL, que seja baseado na formação esferóide de pilhas de PDL em películas¹⁴do quitosana. A formação de esferóides aumentou a autorenovação e a capacidade de diferenciação osteogênica das células de PDL¹⁴. Aqui, nós apresentamos protocolos detalhados da cultura do esferóide da pilha de PDL baseados em películas do quitosana. O sistema da cultura 3D de esferoides celulares de PDL supera algumas das deficiências relativas à cultura de pilha convencional de TCPs, e pode assim ser apropriada para produzir pilhas de PDL com uma eficácia terapêutica realçada para a regeneração peridental futura do tecido.

Protocolo

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de ética da escola e hospital de Estomatologia da Universidade de Tongji. Todos os pacientes forneceram o consentimento informado escrito.

1. isolação da pilha de PDL

1. Faça meio de proliferação para cultura de células PDL: meio α-MEM suplementado com 10% FCS e 100 U/mL Pen/Strep.
2. Prepare um recipiente com gelo para transferir terceiros molares isolados.
3. Esterilizar instrumentos cirúrgicos usando uma autoclave.
4. Extraia os terceiros molares afetados humanos normais dos adultos (18-28 anos de idade) na clínica dental da escola e do hospital da estomatologia, Universidade de Tongji.
5. Coloque os terceiros molares no meio de proliferação e transfira para o laboratório a 4 ° c.
6. Coloc o dente extraído em um prato de Petri estéril de 100 milímetros, trabalhando dentro de uma capa laminar do fluxo do Biohazard.
7. Adicionar 10 mL de PBS para lavar o dente extraído. Repita o passo de lavagem duas vezes.
8. Usando um bisturi estéril, separe suavemente o PDL da raiz.
   Nota: o PDL deve ser raspado da terceira parte média da raiz para evitar contaminações dos tecidos gengivais ou apicais.
9. Mince PDL em fragmentos de 1-2 mm com a ajuda de uma lâmina de bisturi esterilizada.
10. Coloque fragmentos de PDL em um balão de cultura T-25, preenchido com 3-4 mL de meio de proliferação.
11. Cultura as amostras em uma incubadora em 37 ° c em 5% CO₂ com ar humidificado.
12. A mudança do meio de cultura após o crescimento das células PDL foi observada. Toma geralmente 1-2 semanas para o conseqüência de pilhas de PDL. Observe o crescimento das células PDL através de um microscópio de contraste de fase inversa.
13. Mude o meio de cultura duas vezes por semana depois disso.
14. Quando as células PDL atingiram confluência, as células de subcultura na proporção de 1:4 (passagem 1).
15. Observe o crescimento celular diariamente e mude o meio de cultura duas vezes por semana.
16. Execute cada passagem subseqüente na relação de 1:4 depois que as pilhas alcançam a confluência de 80%. Use a terceira-a quinta geração de células PDL para a propagação de células.

2. preparação de filmes de quitosana

1. Para a preparação de uma solução de ácido acético a 1% (v/v), adicione 5 mL de ácido acético a 495 mL de água destilada dupla em uma taça de vidro limpo.
2. Para a preparação de 1% w/v solução de quitosana, pesar 5 g de pó de quitosana (peso molecular médio 400 kDa, 85% grau de acetilação) e adicionar a 495 mL de 1% (v/v) solução de ácido acético.
3. Mexa a solução preparada durante 24 horas com a barra de agitação e a placa de agitação magnética a 60 ° c.
4. Autoclave a solução preparada para garantir a dissolução completa da quitosana.
   Observação: o experimento pode ser pausado neste estágio.
5. Para formar filmes de quitosana, adicione 1% de solução de quitosana de p/v em pratos de poliestireno de cultura de tecidos (TCPS) a 0,25 mL/cm². Por exemplo, adicionar 0,5 mL de 1% w/v solução de quitosana para um poço de 24-placa bem.
6. Seque pratos TCPS em um forno a 60 ° c por 24 horas para formar filmes de quitosana.
7. Preparar 0,5 hidróxido de sódio N (NaOH). Mexa 10 g de NaOH, um pouco de cada vez, em um grande volume de água destilada dupla usando a barra de agitação magnética e, em seguida, diluir a solução para fazer 0,5 L.
   Nota: Adicione NaOH à água--não adicione a água ao NaOH contínuo. Não toque NaOH! Pode causar queimaduras químicas.
8. Neutralize filmes de quitosana com 0,5 N NaOH. Adicionar 0,5 mL de 0,5 N NaOH solução para um poço de 24-bem placa por 2 horas.
9. Lave os filmes de quitosana três vezes com água destilada dupla.
   Observação: o experimento pode ser pausado neste estágio.
10. Antes da semeadura de células, esterilizar as placas de 24 poços revestidas com quitosana em 70% de álcool durante a noite à temperatura ambiente.
11. Enxague as placas revestidas com quitosana três vezes com PBS à temperatura ambiente.
12. Esterilizar placas revestidas com quitosana por tratamento luz ultravioleta durante a noite à temperatura ambiente.

3. semeadura celular

1. Solução de PBS de média de proliferação pré-quente e solução de Trypsin/EDTA para 37 ° c.
2. Descarte o sobrenadante do balão de cultura celular T-75.
3. Lave as células PDL confluentes com 10 mL de solução de PBS.
4. Descarte a solução PBS.
5. Adicione 1 mL de solução de Trypsin/EDTA ao balão de cultura de células T-75.
6. Incubar células com solução de tripsina/EDTA por 3 min a 37 ° c.
7. Encerre o processo de digestão da tripsina adicionando 3 mL de meio de proliferação ao balão de cultura de células T-75.
8. Transfira a suspensão da célula preparada para um tubo de centrífuga cônico de 15 mL.
9. Centrifugue a suspensão durante 5 min a 300 x g e a temperatura ambiente.
10. Descarte o sobrenadante do tubo de centrífuga cônico de 15 mL e resuspenda o pellet celular em 500 μL de meio de proliferação.
11. Contagem de células PDL com um Hemocytometer.
12. Células de semente PDL nas densidades de 0,5 x 10⁴, 1 x 10⁴, 3 x 10⁴e 6 x 10⁴ células/cm².
13. Células de cultura PDL em filmes de quitosana em uma incubadora a 37 ° c em 5% CO₂ com ar humidificado.
14. Mude o meio de cultura duas vezes por semana depois disso.
15. Nos dias 1, 2, 3, 4 e 5, observar a morfologia celular diariamente através de um microscópio de contraste de fase inversa.

4. sobrevivência celular

1. Após 1, 3 e 6 dias de cultura, determinar a sobrevida das células usando um kit de viabilidade/citotoxicidade comercial.
2. Em um tubo de 15 ml, prepare 2 ml de uma solução fresca de 2 milímetros calcein-am e homodímero do etídio de 4 milímetros no PBS por vortexing por 5 s.
   Nota: Mantenha o processo no escuro.
3. Retire o meio de cultura e lave os esferóides em PBS.
4. Incubar esferóides em PBS contendo 2 mm de calceina-am e 4 mm de etídio homodímero por 30 min à temperatura ambiente no escuro.
5. Enxágüe esferoides duas vezes em PBS. Para esferoides de um poço da placa 24-well, use 2 ml de PBS para cada vez.
6. Observe as amostras usando um microscópio de fluorescência usando ampliação de 10x ou 20x.

Resultados

Usando o protocolo atual, os esferoides viáveis da pilha de PDL foram dados forma com sucesso. A Figura 1 mostrou que células suspensas ou esferóides em vez de células anexadas foram observadas principalmente em filmes de quitosana. Para a densidade de semeadura de 0,5 x 10⁴ Cells/cm², as pilhas PDL anexadas foram encontradas ocasionalmente no dia 1 e 3, e os esferoides da pilha de PDL foram observados raramente. Pelo contrário, para as ...

Discussão

O presente estudo introduziu um sistema de cultura de células 3D para superar algumas limitações relacionadas à cultura de células monocamada 2D convencional. De acordo com o protocolo, os esferoides celulares de PDL foram formados com sucesso cultivando pilhas em películas do quitosana. Nosso estudo prévio relatou que a formação de esferóides aumentou a autorenovação e as capacidades de diferenciação osteogênica das células PDL¹⁴. Em vez de usar uma enzima para colher células de TCPs, esferoides ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
&alfa;-MEM	Gibco	11900-073
ácido acético	Sigma-Aldrich	64197
Frasco de cultura de células 25 cm2	Corning	430639
Frasco de cultura de células 75 cm2	Corning	430641
Chitosan	Heppe Medical  Chitosan GmbH	/	peso molecular 500 kDa, grau de desacetilação 85%
FCS	Gibco	26140-079
Kit de Viabilidade/Citotoxicidade Vivo/Morto	Molecular  Sondas	L3224
NaOH	Sigma-Aldrich	1310732
PBS	KeyGen Biotech
caneta/estreptococo	Gibco	15140-122
Tripsina/EDTA	KeyGen Biotech
tubo de centrífuga cônico de 15 mL	Corning	430790
placa de 24 poços	Corning	3524

KGB5001KGM25200