Este protocolo centra-se na identificação de proteínas que se ligam a fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos. Ele usa a cromatografia de afinidade com fosfatos de inositol biotinylated ou fosfoinositídeos que são imobilizados via estreptavidina para agarose ou grânulos magnéticos. Fosfato de inositol ou proteínas de ligação Fosfoinositídeo são identificados por western blotting ou espectrometria de massa.
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Artigo de método
Identificação de fosfato de inositol ou proteínas Fosfoinositídeo interagindo por cromatografia de afinidade acoplada a Western blot ou espectrometria de massas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Fosfatos de inositol e fosfoinositídeos regulam vários processos celulares em eucariontes, incluindo expressão gênica, tráfico de vesículas, transdução de sinal, metabolismo e desenvolvimento. Estes metabolitos realizam esta atividade regulamentar ligando-se a proteínas, alterando assim a conformação proteica, a atividade catalítica e/ou as interações. O método descrito aqui utiliza cromatografia de afinidade acoplada à espectrometria de massas ou western blotting para identificar proteínas que interagem com fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos. Fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos são quimicamente marcados com biotina, que é então capturado via estreptavidina conjugados para agarose ou grânulos magnéticos. As proteínas são isoladas por sua afinidade de ligação ao metabolito, então eluída e identificada por espectrometria de massas ou western blotting. O método tem um fluxo de trabalho simples que é sensível, não-radioativo, Liposome-livre, e customizável, suportando a análise da interação da proteína e do metabolito com precisão. Esta abordagem pode ser usada em métodos de espectrometria de massas quantitativas rotuladas com rótulo livre ou em aminoácidos para identificar interações proteína-metabólito em amostras biológicas complexas ou usando proteínas purificadas. Este protocolo é otimizado para a análise de proteínas do Trypanosoma brucei, mas pode ser adaptado a parasitas relacionados com protozoários, leveduras ou células de mamíferos.
Introdução
Fosfatos de inositol (IPS) e fosfoinositídeos (PIS) desempenham um papel central na biologia eucariote através da regulação de processos celulares como o controle da expressão gênica1,2,3, tráfico de vesículas 4, transdução de sinal5,6, metabolismo7,8,9e desenvolvimento8,10. A função reguladora destes metabolitos resulta da sua capacidade de in....
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Protocolo
1. análise de proteínas de ligação IP ou PI por cromatografia de afinidade e western blotting
- Crescimento celular, Lise e cromatografia de afinidade
- Cresça as células T. brucei para a fase do mid-log e monitore a viabilidade e a densidade das células. Um total de 5,0 x 107 células é suficiente para um ensaio de ligação.
- Para as formas de corrente sanguínea, cultivar células em meios HMI-9 suplementados com soro bovino fetal a 10% (FBS) a 37 ° c e 5% CO2. Manter a densidade celular entre 8,0 x 105 a 1,6 x 106 células/ml.
Nota: a densidade superior a 1,8 x 106 ....
- Para as formas de corrente sanguínea, cultivar células em meios HMI-9 suplementados com soro bovino fetal a 10% (FBS) a 37 ° c e 5% CO2. Manter a densidade celular entre 8,0 x 105 a 1,6 x 106 células/ml.
- Cresça as células T. brucei para a fase do mid-log e monitore a viabilidade e a densidade das células. Um total de 5,0 x 107 células é suficiente para um ensaio de ligação.
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Resultados
Análise da interação RAP1 e PI (3, 4, 5) P3 por cromatografia de afinidade e western blotting
Este exemplo ilustra a aplicação deste método para analisar a ligação de PIS por RAP1 de t. brucei lisado ou por t. brucei recombinante proteína RAP1. Lisados de T. brucei formas de corrente sanguínea que expressam hemaglutinina (ha)-Tagged RAP1 foram utilizados em ensaios de ligação. RAP1 é uma proteína envolvida no controle transcricional de genes de glicoproteína de superfície va.......
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Discussão
A identificação de proteínas que se ligam a IPs ou PIs é fundamental para compreender a função celular desses metabólitos. A cromatografia de afinidade acoplada ao borrão ocidental ou à espectrometria maciça oferece uma oportunidade de identificar IP ou PI que interagem proteínas e daqui obtêm introspecções em sua função regulamentar. IPs ou PIs quimicamente marcados [por exemplo, ins (1, 4, 5) P3 quimicamente ligados à biotina] e reticulados a grânulos de agarose via estreptavidina ou capturados por grânulos magnéticos .......
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Divulgações
O autor não tem nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de pesquisa de ciências naturais e engenharia do Canadá (NSERC, RGPIN-2019-04658); Suplemento de lançamento de descoberta NSERC para pesquisadores de carreira precoce (DGECR-2019-00081) e pela Universidade McGill.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acetona | Sigma-Aldrich | 650501 | Cetona |
| Acetonitrila | Sigma-Aldrich | 271004 | Solvente |
| Bicarbonato de amônio | Sigma-Aldrich | A6141 | Centrífuga de sal inorgânico |
| Avanti J6-MI | Beckman Coulter | Avanti J6-MI | Centrífuga para grandes volumes (por exemplo, 1L) |
| Garrafas de centrífuga | Sigma-Aldrich | B1408 | Frascos para centrifugação de 1L de cultura |
| Grânulos de controle | Echelon | P-B000-1ml | Reagente de cromatografia de afinidade - controle |
| D-(+)-Glicose | Sigma-Aldrich | G8270 | Açúcar, Adicionado em PBS para manter as células viáveis |
| Ditiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Agente redutor |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | ThermoFisher Scientific | 65305 | Grânulos de estreptavidina para ligação a ligantes de biotina |
| Inibidor de protease sem EDTA Cocktail | Roche | 11836170001 | Inibidores de protease |
| Eletroforese executando tampão | Bio-Rad | 1610732 | 25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS, pH 8,3 |
| Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga Cônicos | Corning Life Sciences | 430052 | Para centrifugar culturas de 10 mL |
| Ácido fórmico | Sigma-Aldrich | 106526 | Ácido |
| Glicina | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Meio de cultura de células HMI-9 | ThermoFisher Scientific | ME110145P1 | Meio de cultura de células para formas |
| de corrente sanguínea T. bruceiColoração Imperial Protein Stain | ThermoFisher Scientific | 24615 | Coomassie para detecção de proteínas em SDS/PAGE |
| Ins(1,4,5)P3 Beads | Echelon | Q-B0145-1ml | Reagente de cromatografia de afinidade |
| Instantâneo Sem gordura Seco Leite | Thomas Scientific | C837M64 | Reagente de bloqueio para Western blotting |
| Iodoacetamida | Sigma-Aldrich | I6125 | Reagente alquilante para proteínas de cisteína ou peptídeos |
| Lab Rotator | Thomas Scientific | 1159Z92 | Para ensaios de ligação |
| Tubos de Microcentrífuga LoBind | ThermoFisher Scientific | 13-698-793 | Tubos de baixa ligação de proteínas para espectrometria de massa |
| Nonidet P-40 (Igepal CA-630) | Sigma-Aldrich | 21-3277 | Detergente |
| PBS, pH 7,4 | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Tampão fisiológico |
| Substrato de peroxidase para quimioluminescência | ThermoFisher Scientific | 32106 | Substrato para detecção de Western bloting de proteínas |
| PhosSTOP Comprimidos de coquetel de inibidor de fosfatase | Roche | 4906845001 | Fosfatase inibidores |
| PI(3)P PIP Beads | Echelon | P-B003a-1ml | Reagente de cromatografia de afinidade |
| PI(3,4)P2 PIP Beads | Echelon | P-B034a-1ml | Reagente de cromatografia de afinidade |
| PI(3,4,5)P3 diC8 | Echelon | P-3908-1mg | Reagente de cromatografia de afinidade |
| PI(3,4,5)P3 PIP Beads | Echelon | P-B345a-1ml | Reagente de cromatografia de afinidade |
| PI(3,5)P2 PIP Beads | Echelon | P-B035a-1ml | Reagente de cromatografia de afinidade |
| PI(4)P PIP Beads | Echelon | P-B004a-1ml | Reagente de cromatografia de afinidade |
| PI(4,5)P2 diC8 | Echelon | P-4508-1mg | Reagente de cromatografia de afinidade |
| PI(4,5)P2 PIP Beads | Echelon | P-B045a-1ml | Reagente de cromatografia de afinidade |
| PI(5)P PIP Beads | Echelon | P-B005a-1ml | Reagente de cromatografia de afinidade |
| Solução Ponceau S | Sigma-Aldrich | P7170 | Coloração de proteína (0,1% [p/v] em ácido acético a 5%) |
| Hexacianoferrato de potássio(III) | Sigma-Aldrich | 702587 | Sal de potássio |
| PtdIns PIP Beads | Echelon | P-B001-1ml | |
| Membrana PVDF | Bio-Rad | 1620177 | para Western blotting |
| Centrífuga refrigerada | Eppendorf | 5910 R | Microcentrífuga para pequenos volumes (por exemplo, 1,5 mL) |
| Dodecil sulfato de sódio | Sigma-Aldrich | 862010 | Detergente |
| Tiossulfato de sódio | Sigma-Aldrich | 72049 | Químico |
| Concentradores de Vácuo SpeedVac | ThermoFisher Scientific | SPD120-115 | Concentração de amostra (por exemplo, para espectrometria de massa) |
| Frascos T175 para cultura de células | ThermoFisher Scientific | 159910 | Para crescer 50 mL T. brucei |
| cultura Tripsina, Grau de Espectrometria de Massa | Promega | V5280 | Tripsina para digestão de proteínas |
| Uréia | Sigma-Aldrich | U5128 | Reagente desnaturante |
| Vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | Para reações de mistura |
| Tampão de transferência de Western blotting | Bio-Rad | 1610734 | Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8,3 com 20% de metanol |
| Whatman Papel de 3 mm | Sigma-Aldrich | WHA3030861 | Papel para transferência Wester |
| 2-mercaptoetanol (14.2 M) | Bio-Rad | 1610710 | Agente Redutor |
| 2x Tampão de Amostra Laemmli | Bio-Rad | 161-0737 | Tampão de carga de proteína |
| 4– 20% Mini-PROTÉICO Géis de proteína pré-moldados TGX | Bio-Rad | 4561094 | Gel para eletroforese de proteínas |
| 4x Tampão de amostra Laemmli | Bio-Rad | 161-0747 | Tampão de carga de proteínas |
Referências
- Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
- Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D.
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Reimpressões e permissões
