Artigo de método

Identificação de fosfato de inositol ou proteínas Fosfoinositídeo interagindo por cromatografia de afinidade acoplada a Western blot ou espectrometria de massas

DOI:

10.3791/59865

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26 de julho de 2019

1Institute of Parasitology, McGill University

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo centra-se na identificação de proteínas que se ligam a fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos. Ele usa a cromatografia de afinidade com fosfatos de inositol biotinylated ou fosfoinositídeos que são imobilizados via estreptavidina para agarose ou grânulos magnéticos. Fosfato de inositol ou proteínas de ligação Fosfoinositídeo são identificados por western blotting ou espectrometria de massa.

Resumo

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Fosfatos de inositol e fosfoinositídeos regulam vários processos celulares em eucariontes, incluindo expressão gênica, tráfico de vesículas, transdução de sinal, metabolismo e desenvolvimento. Estes metabolitos realizam esta atividade regulamentar ligando-se a proteínas, alterando assim a conformação proteica, a atividade catalítica e/ou as interações. O método descrito aqui utiliza cromatografia de afinidade acoplada à espectrometria de massas ou western blotting para identificar proteínas que interagem com fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos. Fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos são quimicamente marcados com biotina, que é então capturado via estreptavidina conjugados para agarose ou grânulos magnéticos. As proteínas são isoladas por sua afinidade de ligação ao metabolito, então eluída e identificada por espectrometria de massas ou western blotting. O método tem um fluxo de trabalho simples que é sensível, não-radioativo, Liposome-livre, e customizável, suportando a análise da interação da proteína e do metabolito com precisão. Esta abordagem pode ser usada em métodos de espectrometria de massas quantitativas rotuladas com rótulo livre ou em aminoácidos para identificar interações proteína-metabólito em amostras biológicas complexas ou usando proteínas purificadas. Este protocolo é otimizado para a análise de proteínas do Trypanosoma brucei, mas pode ser adaptado a parasitas relacionados com protozoários, leveduras ou células de mamíferos.

Introdução

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Fosfatos de inositol (IPS) e fosfoinositídeos (PIS) desempenham um papel central na biologia eucariote através da regulação de processos celulares como o controle da expressão gênica1,2,3, tráfico de vesículas 4, transdução de sinal5,6, metabolismo7,8,9e desenvolvimento8,10. A função reguladora destes metabolitos resulta da sua capacidade de in....

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Protocolo

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1. análise de proteínas de ligação IP ou PI por cromatografia de afinidade e western blotting

  1. Crescimento celular, Lise e cromatografia de afinidade
    1. Cresça as células T. brucei para a fase do mid-log e monitore a viabilidade e a densidade das células. Um total de 5,0 x 107 células é suficiente para um ensaio de ligação.
      1. Para as formas de corrente sanguínea, cultivar células em meios HMI-9 suplementados com soro bovino fetal a 10% (FBS) a 37 ° c e 5% CO2. Manter a densidade celular entre 8,0 x 105 a 1,6 x 106 células/ml.
        Nota: a densidade superior a 1,8 x 106 ....

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Resultados

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Análise da interação RAP1 e PI (3, 4, 5) P3 por cromatografia de afinidade e western blotting
Este exemplo ilustra a aplicação deste método para analisar a ligação de PIS por RAP1 de t. brucei lisado ou por t. brucei recombinante proteína RAP1. Lisados de T. brucei formas de corrente sanguínea que expressam hemaglutinina (ha)-Tagged RAP1 foram utilizados em ensaios de ligação. RAP1 é uma proteína envolvida no controle transcricional de genes de glicoproteína de superfície va.......

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Discussão

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A identificação de proteínas que se ligam a IPs ou PIs é fundamental para compreender a função celular desses metabólitos. A cromatografia de afinidade acoplada ao borrão ocidental ou à espectrometria maciça oferece uma oportunidade de identificar IP ou PI que interagem proteínas e daqui obtêm introspecções em sua função regulamentar. IPs ou PIs quimicamente marcados [por exemplo, ins (1, 4, 5) P3 quimicamente ligados à biotina] e reticulados a grânulos de agarose via estreptavidina ou capturados por grânulos magnéticos .......

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Divulgações

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O autor não tem nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de pesquisa de ciências naturais e engenharia do Canadá (NSERC, RGPIN-2019-04658); Suplemento de lançamento de descoberta NSERC para pesquisadores de carreira precoce (DGECR-2019-00081) e pela Universidade McGill.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AcetonaSigma-Aldrich650501Cetona
AcetonitrilaSigma-Aldrich271004Solvente 
Bicarbonato de amônioSigma-AldrichA6141Centrífuga de sal inorgânico
Avanti J6-MIBeckman CoulterAvanti J6-MICentrífuga para grandes volumes (por exemplo, 1L)
Garrafas de centrífugaSigma-AldrichB1408Frascos para centrifugação de 1L de cultura
Grânulos de controleEchelonP-B000-1mlReagente de cromatografia de afinidade - controle
D-(+)-GlicoseSigma-AldrichG8270Açúcar, Adicionado em PBS para manter as células viáveis
Ditiotreitol (DTT) Bio-Rad1610610Agente redutor
Dynabeads M-270 StreptavidinThermoFisher Scientific65305Grânulos de estreptavidina para ligação a ligantes de biotina
Inibidor de protease sem EDTA CocktailRoche11836170001Inibidores de protease
Eletroforese executando tampãoBio-Rad161073225 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS, pH 8,3
Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga CônicosCorning Life Sciences430052Para centrifugar culturas de 10 mL
Ácido fórmicoSigma-Aldrich106526Ácido
GlicinaSigma-AldrichG7126
Meio de cultura de células HMI-9ThermoFisher ScientificME110145P1Meio de cultura de células para formas
de corrente sanguínea T. bruceiColoração Imperial Protein StainThermoFisher Scientific24615Coomassie para detecção de proteínas em SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 BeadsEchelonQ-B0145-1mlReagente de cromatografia de afinidade 
Instantâneo Sem gordura Seco  LeiteThomas ScientificC837M64Reagente de bloqueio para Western blotting
IodoacetamidaSigma-AldrichI6125Reagente alquilante para proteínas de cisteína ou peptídeos
Lab  RotatorThomas Scientific1159Z92Para ensaios de ligação
Tubos de Microcentrífuga LoBindThermoFisher Scientific13-698-793Tubos de baixa ligação de proteínas para espectrometria de massa
Nonidet  P-40 (Igepal CA-630)Sigma-Aldrich21-3277Detergente
PBS, pH 7,4ThermoFisher Scientific10010031Tampão fisiológico
Substrato de peroxidase para quimioluminescênciaThermoFisher Scientific32106Substrato para detecção de Western bloting de proteínas
PhosSTOP Comprimidos de coquetel de inibidor de fosfataseRoche4906845001Fosfatase inibidores
PI(3)P PIP BeadsEchelonP-B003a-1mlReagente de cromatografia de afinidade 
PI(3,4)P2 PIP BeadsEchelonP-B034a-1mlReagente de cromatografia de afinidade 
PI(3,4,5)P3 diC8EchelonP-3908-1mgReagente de cromatografia de afinidade 
PI(3,4,5)P3 PIP BeadsEchelonP-B345a-1mlReagente de cromatografia de afinidade 
PI(3,5)P2 PIP BeadsEchelonP-B035a-1mlReagente de cromatografia de afinidade 
PI(4)P PIP BeadsEchelonP-B004a-1mlReagente de cromatografia de afinidade 
PI(4,5)P2 diC8EchelonP-4508-1mgReagente de cromatografia de afinidade 
PI(4,5)P2 PIP BeadsEchelonP-B045a-1mlReagente de cromatografia de afinidade 
PI(5)P PIP BeadsEchelonP-B005a-1mlReagente de cromatografia de afinidade 
Solução Ponceau SSigma-AldrichP7170Coloração de proteína (0,1% [p/v] em ácido acético a 5%)
Hexacianoferrato de potássio(III)Sigma-Aldrich702587Sal de potássio 
PtdIns PIP BeadsEchelonP-B001-1ml 
Membrana PVDFBio-Rad1620177para Western blotting 
Centrífuga refrigeradaEppendorf5910 RMicrocentrífuga para pequenos volumes (por exemplo, 1,5 mL)
Dodecil sulfato de sódioSigma-Aldrich862010Detergente
Tiossulfato de sódioSigma-Aldrich72049Químico 
Concentradores de Vácuo SpeedVacThermoFisher ScientificSPD120-115Concentração de amostra (por exemplo, para espectrometria de massa)
Frascos T175 para cultura de células ThermoFisher Scientific159910Para crescer 50 mL T. brucei
cultura Tripsina, Grau de Espectrometria de MassaPromegaV5280Tripsina para digestão de proteínas
UréiaSigma-AldrichU5128Reagente desnaturante
VortexFisher Scientific02-215-418Para reações de mistura
Tampão de transferência de Western blottingBio-Rad1610734Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8,3 com 20% de metanol
Whatman  Papel de 3 mmSigma-AldrichWHA3030861Papel para transferência Wester
2-mercaptoetanol (14.2 M)Bio-Rad1610710Agente Redutor
2x Tampão de Amostra LaemmliBio-Rad161-0737Tampão de carga de proteína
4– 20% Mini-PROTÉICO  Géis de proteína pré-moldados TGXBio-Rad4561094Gel para eletroforese de proteínas
4x Tampão de amostra LaemmliBio-Rad161-0747Tampão de carga de proteínas
de aminoácidos Reagente de cromatografia de afinidade

Referências

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  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D.

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