Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Summary

A caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) é um tema popular na pesquisa translacional. Este protocolo descreve um ensaio semiautomático da imunofluorescência (se) para a caracterização do PD-L1 e a enumeração dos CTCs em amostras pacientes do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC).

Abstract

As células tumorais circulantes (CTCs) derivadas do tumor primário são derramadas na corrente sanguínea ou no sistema linfático. Estas pilhas raras (1 − 10 pilhas por o mL do sangue) justificam um prognóstico pobre e são correlacionadas com a sobrevivência total mais curta em diversos cancros (por exemplo, peito, próstata e colorectal). Atualmente, o sistema de captura de CTC com base em talão magnético anti-EpCAM é o teste padrão ouro aprovado pela administração de alimentos e drogas dos EUA (FDA) para enumerar CTCs na corrente sanguínea. Este teste é baseado no uso de grânulos magnéticos revestidos com os marcadores anti-EpCAM, que visam especificamente as células cancerosas epiteliais. Muitos estudos têm ilustrado que EpCAM não é o marcador ideal para a detecção de CTC. De fato, os CTCs são uma subpopulação heterogênea de células cancerosas e são capazes de sofrer uma transição epitelial-mesenquimais (EMT) associada à proliferação e invasão metastáticas. Estes CTCs são capazes de reduzir a expressão do marcador epitelial de superfície celular EpCAM, enquanto aumentam os marcadores mesenquimais como vimentina. Para abordar este obstáculo técnico, outros métodos de isolamento baseados em propriedades físicas de CTCs foram desenvolvidos. As tecnologias microfluidic permitem uma aproximação Label-Free ao enriquecimento de CTC das amostras de sangue inteiras. A tecnologia microfluídico espiral usa as forças de arrasto inercial e Dean com fluxo contínuo em canais curvados gerados dentro de um chip microfluídico espiral. As células são separadas com base nas diferenças de tamanho e plasticidade entre as células sanguíneas normais e células tumorais. Este protocolo detalha as etapas diferentes para caracterizar a expressão programada do Death-ligand 1 (PD-L1) dos CTCs, combinando um dispositivo microfluídicos espiral com o conjunto de marcador customizável da imunofluorescência (if).

Introduction

Os linfócitos T citotóxicos antígeno-específicos do tumor (CTLs) jogam um papel crucial na resposta aos cancros através de um processo sabido como o cancer "fiscalização imune". Suas funções antitumorais são reforçadas por anticorpos imunológicos de bloqueio de ponto de verificação, como inibidores da CTLA-4 e inibidores da PD-1/PD-L1. No câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), as terapias anti-PD-1/PD-L1 resultam em taxas de resposta variando de 0%-17% em pacientes com tumores PD-L1-negativos e 36%-100% naqueles que expressam PD-L1. As respostas robustas ao bloqueio PD-1/PD-L1 observadas no melanoma e no NSCLC são mostradas pela evidência da taxa de respost....

Protocol

As amostras foram coletadas prospectivamente no âmbito da coorte CIRCAN ("câncer circulante") com base no hospital universitário de Lyon, após o consentimento por escrito do paciente. Este estudo foi integrado na coorte CIRCAN_ALL. O estudo CIRCAN_ALL foi reconhecido como não intervencionista pelo CPP sudeste IV datado de 04/11/2015 a referência L15-188. Uma versão alterada foi reconhecida como não intervencionista em 20/09/2016 a referência L16-160. O estudo CIRCAN_ALL foi declarado ao IT e ao correspondente da liberdade dos Hospices civils de Lyon em 01/12/2015, a referência 15-131. A coleta de sangue foi realizada quando os médicos observaram a primeira indicação d....

Results

O primeiro pré-requisito foi a obtenção de coleções não contaminadas (sem agente infeccioso) de CTCs para cultura tecidual e evitar o fundo IF gerado. O protocolo de descontaminação permitiu a limpeza de todos os tubos e bombas, e resultou na coleta de CTCs com uma boa taxa de recuperação sem contaminação bacteriana. As amostras enriquecidas foram comparadas sem e com o fluxo de trabalho do protocolo de descontaminação do dispositivo microfluídico espiral. Para validar o protocolo de descontaminação, utilizou-se a linha .......

Discussion

Dois pontos principais foram levantados no presente estudo, o primeiro com relação ao desempenho do fluxo de trabalho para sua transferência para aplicações clínicas, e o segundo referente à diminuição da subjetividade para a análise das imagens de fluorescência obtidas.

Um fluxo de trabalho performant e aperfeiçoado para A enumeração CTC foi determinado inicialmente usando o teste customizável do If após o enriquecimento da pilha através de um sistema microfluídicos Label-Free de CTC (disposi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phé nylindole (DAPI)	Ozyme	BLE 422801	Condições de armazenamento: +4 ° C
BD Facs Clean – 5 L	BD Biosciences	340345	Agente de limpeza à base de alvejante. Condições de armazenamento: Alvejante à temperatura ambiente
1% Solução de limpeza 100 mL	Biolidics	CBB-F016012	Alvejante. Condições de armazenamento:
Albumina de soro bovino à temperatura ambiente (BSA) 7,5%	Sigma	A8412	Condições de armazenamento: +4 ° C
CD45 anticorpo monoclonal (clone HI30) Alexa Fluor 647	BioLegend	BLE304020	Condições de armazenamento: +4 ° C
Software CellProfiler	Software de análise de imagem	Broad Institute
Dispositivo de centrífuga	Hettich	4706	Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
Tubo de centrífuga 50 mL	Corning	430-829	Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
Tubo de centrífuga 15 mL	Biolidics	CBB-F001004-25	Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
ClearCell FX-1 System	Biolidics	CBB-F011002	Dispositivo microfluídico espiral. Condições de armazenamento:
Agente de limpeza Coulter Clenz à temperatura ambiente – 5 L	Beckman Coulter	8448222	Reagente de limpeza multiuso. Condições de armazenamento:
CTChip FR1S	Biolidics	CBB-FR001002	Chip microfluídico à temperatura ambiente. Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
Cytospin 4	ThermoFisher	A78300003	Condições de armazenamento:
Reagente aditivo diluente à temperatura ambiente – 20 mL	Biolidics	CBB-F016009	Condições de armazenamento: +4 ° C
EZ Cytofunnels	ThermoFisher	A78710003	Câmara de amostra com algodão. Condições de armazenamento:
Agente bloqueador FcR	Miltenyi Biotec	130-059-901	Condições de armazenamento: +4 ° C
Soro Fetal de Bezerro (FCS)	Gibco	10270-106	Condições de armazenamento: +4 ° C
Fluoromount	Sigma	F4680	Solução de montagem. Condições de armazenamento: Fungizone à temperatura ambiente
- 50 mg	Bristol-Myers-Squibb	90129TB29	Reagente antifúngico. Condições de armazenamento: +4 ° C
FX1 Canudo de entrada com tampa de bloqueio	Biolidics	CBB-F013005	Canudo. Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
KovaSlide	Dutscher	50126	Corrediça com câmara. Condições de armazenamento:
Anticorpo monoclonal PanCK à temperatura ambiente (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	53-9003-80	Condições de armazenamento: +4 ° C
Paraformaldeído 16%	ThermoFisher	11490570	Solução de fixação. Condições de armazenamento: +4 ° C
Anticorpo monoclonal PD-L1 (clone 29E2A3) - Ficoeritrina	BioLegend	BLE329706	Condições de armazenamento: +4 ° C
Placa de Petri	Dutscher	632180	Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
Tamponamento com fosfato salino (PBS)	Ozyme	BE17-512F	Condições de armazenamento: +4 ° C
Fosfato Tampolado Solução salina ultra pura 1x - 1 L	1ª Base Laboratório	BUF-2040-1X1L	Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	Solução anti-ligação. Condições de armazenamento: Lâminas
polilisina	ThermoFisher	J2800AMNZ	Condições de armazenamento:
Tubo cônico de polipropileno à temperatura ambiente 50 mL	Falcon	352098	Condições de armazenamento:
Tampão de lise RBC à temperatura ambiente - 100 mL	G Biosciences	786-649	Condições de armazenamento: +4 ° C
RBC Lysis Buffer – 250 mL	G Biosciences	786-650	Condições de armazenamento: +4 ° C
Tampão de ressuspensão (RSB)	Biolidics	CBB-F016003	Condições de armazenamento: +4 ° C
Centrífuga Shandon Cytopsin4	ThermoFisher	A78300003	Centrífuga dedicada. Condições de armazenamento: Isolador de silício à temperatura ambiente
	Grace bio-Labs	664270	Condições de armazenamento:
Água desionizada estéril à temperatura ambiente - 100 mL	1ª Base de Laboratório	CUS-4100-100ml	Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
Microscópio fluorescente reto Axio Imager D1	Zeiss		Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
Cirúrgico Estéril Saco	SPS Laboratoires	98ULT01240	Condições de armazenamento:
Seringa à temperatura ambiente BD Discardit II 20 mL estéril	BD Biosciences	300296	Condições de armazenamento:
Filtro de seringa à temperatura ambiente 0,22 µ m 33 mm estéril	ClearLine	51732	Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
Zen lite 2.3 Lite Software	Zeiss		Microscópio associado