Devido à sobreposição espectral dos comprimentos de onda da excitação e da emissão de análogos de NADH e de fura-2, a interferência do sinal de ambos os produtos químicos em pilhas vivos é inevitável durante a medida quantitativa de [Ca2 +]. Assim, um novo método de correção on-line de interferência de sinal NADH para medir [Ca2 +] foi desenvolvido.
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Artigo de método
Uma novela nicotinamida adenina dinucleotídeo método de correção para CA intracelular2 + medição com fura-2-analógico em células ao vivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Para medir quantitativamente [Ca2 +], os análogos fura-2, que são fluorosondas ratiométricas, são freqüentemente usados. Entretanto, o uso da tintura é limitado intrinsecamente em pilhas vivos por causa da interferência do autofluorescence, principalmente do dinucleotídeo do adenina do nicotinamida (NADH). Mais especificamente, este é um grande obstáculo ao medir a mitocondrial [Ca2 +] quantitativamente usando análogos fura-2 porque a maioria de NADH está na mitocôndria. Se a concentração de corante fluorescente é a mesma, uma certa intensidade de excitação deve produzir a mesma intensidade de emissão. Conseqüentemente, a relação da intensidade de emissão de dois comprimentos de onda diferentes da excitação deve ser constante. Com base neste princípio, um novo método de correção on-line de interferência de sinal NADH para medir [Ca2 +] foi desenvolvido, e a intensidade do sinal real de NADH e fura-2 pode ser obtida. Mais, uma equação nova para calcular [Ca2 +] foi desenvolvida com excitação ou excitação espécies em 400 nanômetro. Com este método, as mudanças no [Ca2 +] mitochondrial podiam com sucesso ser medidas. Além disso, com um conjunto diferente de comprimentos de onda de excitação e emissão, múltiplos parâmetros, incluindo NADH, [Ca2 +] e pH ou potencial de membrana mitocondrial (m), podem ser medidos simultaneamente. Mitocondrial [Ca2 +] em ou pH foram medidos usando fura-2-FF e éster etílico de tetrametilrhodamina (tmre) ou carboxi-seminaphtorhodafluor-1 (CARBOXI-SNARF-1).
Introdução
O papel significativo do CA2 + intracelular é amplamente conhecido1. A quantificação de [Ca2 +] é essencial para compreender os processos das funções fisiológicas celulares. Os análogos de fura-2 são bastante úteis porque estão excitados na escala UV (< 400 nanômetro), e o método ratiométrico pode ser aplicado para a medida quantitativa. Conseqüentemente, outros parâmetros fisiológicos tais como o pH, o potencial da membrana, etc., podem ser medidos com outras tinturas fluorescentes. A escala mitochondrial de CA2 + concentração ([Ca2 +]m) era declaradamente 0.08 − 20 μm2,3,4,5. Entre os análogos de fura-2, fura-2-FF é apropriado para medir esta escala de [Ca2 +]. No entanto, as células ao vivo, infelizmente, contêm NADH/NADPH para seus processos metabólicos, e NADH gera interferência de sinal por causa da sobreposição de excitação e espectros de emissão com o fura-2 analógico. Esta interferência limita extremamente o uso de análogos de fura-2. Especificamente, se o analógico é aplicado para medir mitocondrial [Ca2 +], esta interferência é o maior obstáculo porque a maior quantidade de NADH está na mitocôndria. Isto é ainda mais complicado por NADH alterações sendo relacionadas com o potencial de membrana mitocondrial (m) e a mudança deh afeta [Ca2 +]m6,7,8 , 9. Além disso, para estudar [Ca2 +]m dinâmica, é essencial conhecer o estado de outros parâmetros MITOCONDRIAL, tais como NADH,m, e pH.
As emissões a 450 nm e 500 nm com excitações a 353 nm, 361 nm e 400 nm contêm os sinais de NADH e fura-2-FF, e as equações são as seguintes. Nisto, 353 nm e 361 nm são os pontos espécies de fura-2-FF para emissões em 450 nanômetro e em 500 nanômetro, respectivamente.
F361.450 = f361450, NADH + f361450, fura equação 1
F353.500 = f353500, NADH + f353500, fura equação 2
F400.500 = f400500, NADH + f400500, fura equação 3
onde Fx, y é a intensidade de emissão medida no y-nanômetro pela excitação de x-nm, Fx, y, NADH representa a intensidade pura da emissão NADH-dependente, e Fx, y, fura representa a intensidade pura da emissão de fura-2-FF-dependente. a mesma concentração do corante fluorescente, uma certa intensidade de excitação deve produzir a mesma intensidade de emissão. Conseqüentemente, a relação da intensidade de emissão de dois comprimentos de onda diferentes da excitação deve ser constante. CA2 + e fura-2 não afetaram as características de fluorescência NADH; Conseqüentemente, a relação da emissão em 450 nanômetro e em 500 nanômetro de NADH era constante em todo o comprimento de onda da excitação. A mesma regra pode ser usada para fura-2-FF com base na suposição de que NADH ou [Ca2 +] não afeta os espectros de emissão e excitação de fura-2-FF. No entanto, CA2 + causou uma mudança espectral da emissão fura-2-FF. Conseqüentemente, para remover o efeito de CA2 +, a excitação espécies, que é independente de CA2 +, precisa de ser usada. Cada comprimento de onda da emissão (isto é, 450 nanômetro e 500 nanômetro) tem um ponto espécies diferente, e de nossa instalação experimental, 353 nanômetro em 500 nanômetro e 361 nanômetro em 450 nanômetro foram escolhidos. A partir destes, as seguintes equações são válidas10.
Rf = f361450, fura/F353500, fura equação 4
RN1 = f400500, NADH/F361450, NADH equação 5
RN2 = f353500, NADH/F361450, NADH equação 6
Com essas constantes, as seguintes equações de (equação 1) (equação 2) e (equação 3) são válidas.
F361.450 = f361450, NADH + Rf × f353500, fura equação 7
F353.450 = RN2 × f361450, NADH + f353500, fura equação 8
F400.500 = RN1 × f361450, NADH + f400500, fura equação 9
A partir dessas equações, se o Rf, rN1e rN2 forem conhecidos, os sinais puros de NADH e fura-2 podem ser obtidos da seguinte forma.
F361450, NADH = (f361.450 -rf × f353.500)/(1 − rf × rN2) equação 10
F353500, fura = (rn2 × f361.450 − f353.500)/(rf × rN2 − 1) equação 11
F400500, fura = f400.500 − RN1 × f361450, NADH equação 12
Rfura = f353500, fura/F400500, fura equação 13
A forma de CA2 +-Bound de fura-2-FF foi praticamente não-fluorescente no comprimento de onda de excitação de 400 nm. Com base nesta propriedade, a seguinte equação de calibração nova pode ser derivada.
[Ca2 +] = Kd ∙ (f400500, Max/f353500, Max) × (rfura − rmin) equação 14
onde Kd é uma constante de dissociação, f400500, Max e f353500, Max são os valores máximos dos sinais emitidos em 500 nm com excitações a 400 nm e 353 nm, respectivamente, e rmin é o mínimo rfura em CA2 +-condição livre. Desde que as excitações espécies foram usadas, a equação pode ser simplificada mais mais como segue.
[Ca2 +] = Kd ∙ (1/rmin) ∙ (rfura − rmin) equação 15
Portanto, somente os valores de Kd e Rmin são necessários para calcular [Ca2 +].
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Protocolo
Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê institucional local de cuidado e uso de animais.
1. preparação da solução
- Prepare únicos miócitos cardíacos recém-isolados11.
Nota: cada laboratório pode ter uma solução de armazenamento de células diferente. Aqui, os miócitos são armazenados em meio de cultura (DMEM). - Prepare 100 mL de CA2 +-solução livre (tabela 1).
- Prepare 50 mL de meio de cultura em um copo de 50 mL. Aliquot 5 mL e coloque-o num banho de água a 37 ° c. Mantenha a solução restante à temperatura ambiente.
- Prepare 50 mL da solução de saponina adicionando 5 mg de saponina a 50 mL de CA2 +-solução livre.
Nota: a saponina é utilizada para permeabilizar os miócitos cardíacos, para remover os compartimentos citosónicos e para visualizar apenas a fluorescência mitocondrial. - Prepare 16 μL de 1 mM de fura-2-FF-AM dissolvidos em dimetil sulfóxido (DMSO).
Nota: fazer 1 mM de solução de estoque de fura-2-FF-AM dissolvido em DMSO e alíquota 16 μL em um tubo de 2 mL. Guarde-os a-20 ° c até o uso. - Prepare 50 ml de NADH-livre CA2 +-solução livre (tabela 1) e 50 ml de NADH-livre CA2 +-solução saturada (tabela 1) quando os pontos espécies devem ser medidos. Ajuste o pH para 7,0 com KOH.
Nota: a solução livre de NADH-CA2 +-Free (tabela 1) contém 10 μm de FCCP e 100 μm de ADP sem qualquer substrato mitocondrial para minimizar NADH nas mitocôndrias. - Prepare 50 mL de CA2 +-solução livre, 50 ml de solução de malato, 50 ml de solução de piruvato, 50 ml de solução de malato-piruvato e 50 ml de solução de rotenona a ser utilizado para medições de fator de correção de NADH (tabela 1).
2. procedimento de carregamento de fluoroprobe na mitocôndria
- Prepare a solução de carga de corante adicionando 2 mL do meio de cultura a 16 μL de 1 mM de fura-2-FF-AM.
Nota: o corante fluorescente é frágil a luz. Prepare a solução pouco antes de usar. Mantenha a solução que contém o corante fluorescente em um lugar escuro. A concentração final de fura-2-FF-AM é de 8 μM. Se for utilizado carboxi-SNARF-1, prepare a solução de carga de corante com 2 μM de carboxi-SNARF-1-AM. - Tomar 2 mL das células isoladas e colocar num tubo de ensaio de 5 mL numa posição vertical.
- Aguarde 15 min para os miócitos para afundar para o fundo e remover o sobrenadante.
Nota: o sobrenadante pode conter detritos celulares. Não centrifugue o tubo para evitar danos celulares. - Adicione 2 mL da solução de carga de corante.
- Incubar a solução de carga de corante com células para 60 min a 4 ° c.
- Em seguida, coloque o tubo de ensaio num banho de água de 37 ° c durante 30 min numa posição vertical.
- Retire o sobrenadante e adicione 4 mL do meio de cultura pré-aquecido de 37 ° c. Incubar as células por 60 min em um banho de água de 37 ° c.
- Finalmente, retire o sobrenadante, adicione 4 mL de meio de cultura à temperatura ambiente e mantenha o tubo à temperatura ambiente.
3. introdução do sistema de medição Multiparamétrico
Nota: a Figura 1 mostra um diagrama de todo o sistema.
- Para uma fonte luminosa da excitação, use um monocromador rápido (Polychrome II) que possa mudar a luz dentro de 3 ms.
- Use uma lente de imersão de óleo (40x, NA 1,3) com um microscópio invertido para aumentar a intensidade do sinal.
- Use um filtro infravermelho próximo e uma câmera de dispositivo acoplado a carga (CCD) para monitorar o campo de objeto sem interferência de sinal fluorescente.
- Capture a imagem do campo do objeto para obter a área.
- Ajuste o campo de objeto na tela do monitor com um diafragma de campo apenas para mostrar a célula para reduzir o plano de fundo.
- Use quatro tubos fotomultiplicadores com cada filtro passa-banda (450, 500, 590 e 640 nm) para detectar comprimentos de onda de emissão com o método de contagem de fótons. Use os espelhos dichroic apropriados para rachar e para redirecionar a luz da emissão.
Nota: a luz de excitação é muito forte em comparação com a luz de emissão. Assim, escolha o filtro passa-banda com as mais altas características de bloqueio para reduzir o plano de fundo. Um sistema de contagem de fótons compreende uma combinação de PMTs, unidades de contador de fótons e um contador de alta velocidade. Para controlar o sistema e para provar os dados, um software de condução feito-à-medida foi usado. É necessário encontrar uma maneira de aplicar esse método com outros sistemas.
4. métodos de correção de NADH com um sistema de medição Multiparamétrico
- Identificação dos pontos espécies de fura-2-FF in situ.
Nota: muitos relatórios afirmaram que as características fluorescentes são alteradas nas células. Portanto, execute todos os procedimentos para obter os parâmetros para corrigir a interferência in situ.- Monte a célula corante-carregada no microscópio e aguarde 3 min para afundar as células para o fundo.
Nota: ajuste números de célula para ver em torno de uma célula por um campo objetivo com lente objetiva de 40x. - Perfuse o NADH-livre CA2 +-solução livre em 37 ° c.
- Após direcionar a célula, meça o fundo sem célula e a área da célula, conforme mostrado na seção 4,1. Calcule o fundo da célula da área da célula.
Observação: ambos os sinais de plano de fundo precisam ser corrigidos em cada experimento. - Perfuse a solução saponina para 60 s e retorne à solução livre de NADH-CA2 +.
- Meça os sinais fura-2-FF-emitidos em 450 nanômetro e 500 nanômetro simultaneamente pela varredura da excitação de 350 nanômetro a 365 nanômetro com a etapa de 0,1 nanômetro.
- Perfuse o NADH-livre CA2 +-solução saturada e repita a etapa 4.2.5.
- Subtrair os sinais na CA2 +-solução saturada dos sinais no CA2 +-condições livres.
- Repita os procedimentos de 4.2.2 a 4.2.7 com outros únicos myocytes cardíacos.
Nota: se a intensidade do sinal se tornar mais fraca, repita de 4.2.1. Repita o procedimento para, pelo menos, 5 células diferentes. - De todos os sinais obtidos, calcule os desvios padrão da emissão em cada excitação e escolha o comprimento de onda da excitação que mostra o valor mínimo do desvio padrão (SD) como um ponto espécies.
Nota: os valores representativos são mostrados na Figura 2.
- Monte a célula corante-carregada no microscópio e aguarde 3 min para afundar as células para o fundo.
- A detecção do sinal de fundo e os métodos de correção com a área celular
Observação: há dois tipos de planos de fundo. Um vem das pilhas e o outro vem da reflexão no deslizamento de tampa (o fundo Cell-Free). Ambos os fundos precisam ser corrigidos em cada experimento.- Monte as células livres de corante no banho no microscópio e aguarde 3 min para afundar as células para o fundo. Perfuse NADH-Free CA2 +-solução gratuita para cerca de 5 minutos.
Nota: toda a taxa de perfusão da solução é 2-3 mL/min a 37 ° c.
Nota: ajuste números de célula para ver em torno de uma célula por um campo objetivo com lente objetiva de 40x. - Defina o campo de objeto para cobrir a célula de destino.
- Depois de mover a célula para fora do campo, meça os sinais de fundo da janela sem célula e defina-os como deslocamentos.
Nota: o sinal significa o sinal de luz a ser detectado no sistema de contagem de fótons. - Retorne a célula para a posição inicial e meça os sinais de fundo da célula e a área da célula.
Nota: mesmo que a luz de excitação é filtrada com o filtro passa-banda, ele ainda contém quantidade bastante grande da luz filtrada. Esta luz é dispersa quando atinge as células e provoca um sinal de fundo considerável porque o sistema de contagem de fótons é altamente sensível. Ele precisa ser corrigido.
Nota: a área da célula pode ser calculada com uma imagem de célula capturada e um software de imagem disponível. A unidade da área da pilha pode ser toda a unidade que inclui a contagem do pixel. Apenas a padronização é necessária. - Repita de 4.1.1 para 4.1.4 por 10 vezes para obter a relação entre a área da célula e os sinais de fundo da célula.
Nota: mais tarde, os sinais de fundo da célula podem ser calculados a partir da área da célula a partir da relação. Desde que a ampola da excitação se torna envelhecendo, este procedimento precisa de ser repetido, pelo menos, cada mês.
- Monte as células livres de corante no banho no microscópio e aguarde 3 min para afundar as células para o fundo. Perfuse NADH-Free CA2 +-solução gratuita para cerca de 5 minutos.
- Medição de fatores R
- Calcule o RF com a equação 4 dos sinais obtidos na seção 4,2.
- Monte as células livres de corante no microscópio e perfuse a solução CA2 +-livre.
- Meça os sinais tais comof 361, 450, nadh, f400, 500, NADH,f 361, 450, NADH, e f353, 500, Nadh.
- Perfuse a solução de malato e repita 4.3.3. e medir os sinais.
- Perfuse a solução de piruvato e repita 4.3.3. e medir os sinais.
- Perfuse a solução de malato-piruvato e repita 4.3.3. e medir os sinais.
- Perfuse a solução de rotenona e repita 4.3.3. e medir os sinais.
Nota: o exemplo do sinal NADH gravado em piruvato de 5 mM, malato de 5 mm mais piruvato de 5 mm e adição de rotenona a 10 μM é mostrado na Figura 3. - Calcule cada inclinação de F361, 450, nadh vs. f400, 500, NADH e f361, 450, NADH vs. f353, 500, NADH. Como mostrado na Figura 3. Cada inclinação indica RN1 e rN2.
5. seleção da excitação e da luz de emissão para TMRE ou carboxy-SNARF-1
- Se TMRE para medir o potencial mitochondrial foi usado além, use o comprimento de onda da excitação de 530 nanômetro e o comprimento de onda da emissão de 590 nanômetro.
- Se carboxy-SNARF-1 para medir o potencial mitochondrial foi usado além, use o comprimento de onda da excitação de 540 nanômetro e comprimentos de onda da emissão de 590 nanômetro e de 640 nanômetro12.
6. seleção do valor de Kd de fura-2-FF
- A mudança de pH pode afetar os valores de Kd para CA2 + Binding no fura-2-FF10. Use o valor Kd de 5,28 a pH 7,5 para a mitocôndria.
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Resultados
CA mitocondrial2 + alterações devido à correção10
A Figura 4 mostra as alterações em [Ca2 +]m antes e depois da correção. Os resultados mostraram claramente as mudanças substanciais em [Ca2 +]m. A concentração de cálcio de repouso mitocondrial sem citosólico CA2 + ([Ca2 +]c) foi de 1, 3 ± 0,13 μm (média ± S.E., n = 32), e o máximo [Ca2 +]m a 1 μm [Ca2 +]...
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Discussão
O método de correção de interferência foi desenvolvido com sucesso para medir os sinais dos análogos NADH e fura-2. A medida exata dos sinais é essencial para a correção exata. Entretanto, a natureza inerente do dispositivo fluorescente produz um sinal do fundo não relacionado àquele de NADH de fura-2. O filtro da faixa-passagem da mais alta qualidade pode somente passar até 10− 8 dos comprimentos de onda indesejados da luz. No entanto, o sinal fluorescente de uma única célula é muito pequeno, e o reflexo da l...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo programa de pesquisa científica básica através da Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) financiado pelo Ministério da educação (2018R1A6A3A01011832), pelo Ministério da ciência, TIC & planejamento futuro (NRF-2016M3C1A6936606) e pelo Ministério do comércio, indústria & energia (10068076).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL |
| TubeAD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipamento, 640± |
| Filtro de passagem > banda 11nm | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590± 15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500± 20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipamento, 450± 30nm |
| Solução de cloreto de cálcio | Sigma-aldrich | 21114 | Produtos químicos |
| carboxi-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Espelho dicróico | Fornecedor:Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipamento, Espelho dicróico multibanda, Reflexão: < 400nm, 490± 10, 560± 10, Transmissão: 460± 15, 510± 20, >580nm |
| Espelho dicróico | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipamento, Reflexão: < 560nm, Transmissão: > 580 nm |
| Espelho dicróico | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipamento, Reflexão: < 470nm, Transmissão: > 490 nm |
| Espelho dicróico | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipamento, Espelho dicróico multibanda, Reflexão: < 405nm, 470± 30, transmissão: 430nm~520nm, > 640 nan |
| sulfóxido de dimetilo (DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 Chemicals | |
| DMEM, Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio | Sigma-aldrich | D5030 | Produtos Químicos |
| EGTA, Ácido Egtázico, Ácido etileno-bis(oxietilenoenitrilo)tetracético, Éter glicol diamina ácido tetracético | Sigma-aldrich | E4378 | Produtos Químicos |
| FCCP, Mesoxalonitrila 4-trifluorometoxifenilhidrazona | Sigma-aldrich | 21857 | Produtos Químicos |
| forte | Equipamento Nikon | 86506 | |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | produtos químicos |
| tubo verde | DWM | ||
| HEPES, Ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico, N-(2-Hidroxietil)piperazina-N′-(ácido 2-etanossulfônico)) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| Contador de alta velocidade | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipamento, 50:50 |
| Microscópio invertido | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | Equipamento D750/100X | , 750± |
| Lente de imersão em 100nmÓleo | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipamento |
| Unidade contrária de fótons | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Cloreto de potássio | Merck | 1.04936 | Produtos químicos |
| Solução de hidróxido de potássio | Sigma-aldrich | P4494 | Produtos químicos |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponina | Sigma-aldrich | S4521 | Produtos químicos |
| TMRE, tetrametilrodamina, éster etílico | Molecular sondas | T669 | Chemicals |
Referências
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Reimpressões e permissões
