Derivação e tratamento de tumorsphere de células tumorais primárias isoladas de rabdomiossarcoma de camundongo

Resumo

Este protocolo descreve um método reprodutível para a isolação de pilhas preliminares do rabdomiossarcoma do rato, da formação e do tratamento do tumorsphere, e da transplantação do aloenxerto que partem das culturas dos tumorspheres.

Resumo

O rhabdomyosarcoma (RMS) é o sarcoma macio o mais comum do tecido nas crianças. Embora esforços significativos permitiram a identificação de mutações comuns associadas ao RMS e permitiram a discriminação de diferentes subtipos de RMS, ainda existem grandes desafios para o desenvolvimento de novos tratamentos para melhorar ainda mais o prognóstico. Embora identificada pela expressão de marcadores miogênicos, ainda há controvérsia significativa sobre se o RMS tem origens miogênicas ou não miogênicas, já que a célula de origem ainda é pouco compreendida. No presente estudo, um método confiável é fornecido para o ensaio de tumorfera para o mouse RMS. O ensaio é baseado em propriedades funcionais de pilhas do tumor e permite a identificação de populações raras no tumor com funções tumorigênico. Também são descritos procedimentos para testar proteínas recombinantes, integrando protocolos de transfecção com o ensaio de tumorfera e avaliando genes candidatos envolvidos no desenvolvimento e crescimento tumoral. Descrito mais é um procedimento para a transplantação do aloenxerto de tumorspheres em ratos destinatários para validar a função tumorigênico in vivo. Globalmente, o método descrito permite a identificação e o teste confiáveis de populações tumorigênicas de RMS raras que podem ser aplicadas a RMS que surgem em diferentes contextos. Finalmente, o protocolo pode ser utilizado como plataforma para triagem de fármacos e desenvolvimento futuro da terapêutica.

Introdução

O câncer é uma doença heterogênea; Além disso, o mesmo tipo de tumor pode apresentar mutações genéticas diferentes em pacientes diferentes, e dentro de um paciente um tumor é compor por populações múltiplas das pilhas¹. A heterogeneidade apresenta um desafio na identificação de células responsáveis pelo início e propagação do câncer, mas sua caracterização é essencial para o desenvolvimento de tratamentos eficientes. A noção de pilhas de propagação do tumor (TPC), uma população rara das pilhas que contribuem ao desenvolvimento do tumor, foi revista previamente extensivamente². Apesar do fato de que os TPCs têm sido carac....

Protocolo

A habitação, o tratamento e o sacrifício de camundongos foram realizados seguindo o protocolo IACUC aprovado do Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute.

1. preparação do reagente

1. Prepare 100 mL de meio de isolamento celular: F10 médio suplementado com 10% de soro de cavalo (HS).
2. Preparar 50 ml de solução de colagenase tipo II: dissolver 1 g de pó de colagenase tipo II em 50 ml de meios de isolamento celular (Observe as unidades da enzima por 1 ml de mídia, uma vez que o número de unidades muda dependendo do lote). Aliquot a solução e armazene-o em um congelador de-20 ° c até que esteja pronto para o uso.
   No....

Resultados

Detecção de tumorspheres
O isolamento celular foi otimizado para obter a máxima heterogeneidade das populações celulares presentes no tecido tumoral. Em primeiro lugar, uma vez que os tecidos isolados apresentavam áreas morfologicamente dissimilares, para aumentar as chances de isolar populações de células raras uniformes, a amostragem foi realizada a partir de múltiplas áreas do tumor (Figura 1a, primeiro painel à esquerda). Segundo, a di.......

Discussão

Os métodos múltiplos foram empregados para a isolação e a caracterização dos TPCs das populações heterogêneas da pilha do tumor: ensaios ensaios do tumor, isolação de FACS, e ensaio da formação do tumorsphere. O ensaio clonogénico do tumor foi descrito primeiramente em 1971, usado para estudos da pilha de haste, e aplicado somente subseqüentemente à biologia do cancer^29,30. Este método é baseado na propriedade intrínseca das pilhas de haste do cancro a expandir s.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente de dissociação celular Accutase	Gibco	A1110501	Separar células aderentes e dissociar tumoresferas Celigo
	Nexcelom	Citômetro	imagem baseado em placa Celigo Microwell para células aderentes e em suspensão
Colagenose, Tipo II	Life Technologies	17101015	Enzima de digestão de tecidos
Dispase II, protease	Life Technologies	17105041	Enzima de digestão tecidual
DMEM meio de alta glicose	Gibco	11965092	Componente do meio de células tumorais
Meio DMEM / F12 Gibco		11320033	Componente do meio da tumosfera
EDTA	ThermoFisher	S312500	Componente do tampão FACS
EGF proteína de camundongo recombinante	Gibco	PMG8041	Componente do meio
da tumosferaFACSAria II Citometria de Fluxo	BD Biosciences	650033	Classificador de células ativadas fluorescentes Soro
Fetal Bovino	Omega Scientific	FB-11	Componente do meio de células tumorais
Agente anestésico Fluriso (Isofluornae)	MWI Vet Supply	502017	Reagente anestésico para animais
FxCycle Violet Stain	Life Technologies	F10347	Discriminar células vivas e mortas
Goat Serum	Life Technologies	16210072	Componente do tampão FACS
F10 Media	Life Technologies	da	11550043 Componente do tampão FACS
Horse Serum	Life Technologies	16050114	Componente do meio de isolamento celular
Reagente de transfecção Lipofectamine 3000 Reagente
de transfecção ThermoFisher L3000015Matriz de membrana Matrigel	Corning	CB40234	Fornece suporte para células transplantadas
N-2 Supplemtns (100X)	Gibco	17502048	Componente do meio da tumosfera
Neomicina-Polimixina B Sulfatos-Bacitracina Zinco Pomada Oftálmica	MWI Vet Supply	701008	Pomada para os olhos
PBS	Gibco	10010023	Componente do tampão FACS e usado para lavar células
pEGFP-C1	Addgene	6084-1	GFP plasmídeo
Penicilina - Estreptomiocina	Life Technologies	15140163	Componente da tumosfera e células tumorais mídia
Recombinante Humana β FGF-basic	Peprotech	10018B	Componente da mídia da tumosfera
Camundongo recombinante Flt-3 Ligante Proteína	R & D Systems	427-FL-005	Proteína recombinante
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	Discriminar células vivas e mortas

de Ham's