Divulgando a coleta de Hemolinfas e a inoculação de blastósporos de Metarhizium em carrapatos de Rhipicephalus MICROPLUS para estudos de patologia de invertebrados

Resumo

A análise da hemolinfa de carrapato representa uma importante fonte de informações sobre como alguns patógenos causam doenças e como os carrapatos respondem imunologicamente a essa infecção. O presente estudo demonstra como inocular propágulos fúngicos e coletar hemolinfas de fêmeas de Rhipicephalus MICROPLUS ingurgizadas.

Resumo

Carrapatos são obrigatórios ectoparasitas hematófagos e Rhipicephalus MICROPLUS tem grande importância na medicina veterinária porque causa anemia, perda de peso, depreciação do couro dos animais e também pode atuar como um vetor de vários patógenos. Devido aos custos exorbitantes para controlar esses parasitas, danos ao meio ambiente causados pelo uso inadequado de acaricidas químicos, e o aumento da resistência contra parasiticidas tradicionais, controle alternativo de carrapatos, pelo uso de os fungos entomopatogénicos, por exemplo, foram considerados uma aproximação interessante. No entanto, poucos estudos demonstraram como o sistema imunológico do carrapato atua para combater esses entomopatógenos. Portanto, este protocolo demonstra dois métodos utilizados para a inoculação de entomopatógenos em fêmeas ingurgedadas e duas técnicas utilizadas para coleta de hemolinfas e hemócitos. A inoculação de patógenos na inserção da perna no corpo da fêmea do carrapato permite a avaliação de parâmetros biológicos femininos diferentemente da inoculação entre o Scutum e o capitulo, que freqüentemente danifica o órgão de Gené. A coleção dorsal do hemolinfa rendeu uma recuperação mais elevada do volume do que a coleção através das pernas. Algumas limitações da coleta e processamento de hemolinfas de carrapato incluem i) altas taxas de ruptura de hemócitos, II) contaminação da hemolinfa com intestino médio interrompido e III) baixa recuperação do volume da hemolinfa. Quando a hemolinfa é coletada através do corte da perna, a hemolinfa leva tempo para se acumular na abertura da perna, favorecendo o processo de coagulação. Além disso, menos hemócitos são obtidos na coleta através da perna em comparação com a coleta dorsal, embora o primeiro método seja considerado mais fácil de ser realizado. Compreender a resposta imune em carrapatos mediados por agentes entomopatogênicos ajuda a revelar sua patogênese e desenvolver novos alvos para o controle do carrapato. Os processos de inoculação aqui descritos requerem recursos tecnológicos muito baixos e podem ser utilizados não apenas para expor carrapatos a microrganismos patogênicos. Da mesma forma, a coleta de hemolinfa de carrapato pode representar o primeiro passo para muitos estudos fisiológicos.

Introdução

O carrapato de bovinos, Rhipicephalus MICROPLUS, é um ectoparasita hematófago com um enorme impacto negativo sobre o gado em áreas tropicais. Este carrapato é o vetor de agentes patogénicos, como Babesia bovis, Babesia bigemina, e Anaplasma marginale que, combinada com o dano de hemofeeding direto, pode reduzir a produção de leite e carne, causar anemia e, finalmente, a morte. As perdas causadas por este ectoparasita foram estimadas em 3.240.000.000 dólares anuais no Brasil¹. São exigidos métodos sustentáveis e a utilização de agentes entomopatogênicos é considerada uma alternativa promissora para reduzir o u....

Protocolo

Os carrapatos utilizados no presente estudo foram obtidos de uma colônia artificial, mantido na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, que métodos foram aprovados pela Comissão de ética para o uso de animais vertebrados (ceua-IV/UFRRJ #037/2014).

1. carrapato fêmeas ingurgadas

1. Após a coleta de carrapatos, lave as fêmeas ingurgitadas usando água da torneira e mergulhe-as em 0,5% (v/v) solução de hipoclorito de sódio por 3 min em um recipiente de vidro de 500 mL, para higiene da cutícula (Figura 1), depois seque todas as fêmeas usando toalhas de papel estéreis (Figura 2

Resultados

Este artigo aborda métodos de coleta de inoculação e hemolinfa aplicados a carrapatos. Após a inoculação entre a coxa da perna e o corpo da fêmea do carrapato, algum fluido (hemolinfa) pode ser secretado durante o processo; no entanto, é importante notar que, quando a inoculação é terminada, nenhum líquido ou tecido estiveram presentes na ponta da agulha ou no local de inoculação, assegurando que a suspensão fúngica foi completamente inoculada. Quando o processo de inoculação foi realizad.......

Discussão

A inoculação de patógenos é útil quando o estudo objetiva investigar a ação in vivo de microrganismos em modelos experimentais de artrópodes, pois assegura que o patógeno está dentro do hospedeiro. A técnica também pode ser aplicada para inocular moléculas como a interferência do RNA (RNAi). A inoculação entre o Scutum e o capitulo é considerada mais fácil de realizar, mas freqüentemente danifica o órgão de Gené, prejudicando a viabilidade dos ovos^12,13. O órgão .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução alcalina de hipoclorito	Sigma-Aldrich	A1727
D-(+)-glicose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
EDTA	Synth	2706
Soro bovino fetal	Gibco	16000036
Borracha flexível	BD
Giemsa mancha	Sigma-Aldrich	48900-500ML-F
Capilar de vidro	CTechGlass	CT95-02
Seringa de insulina (agulha)	BD	SKU:  324910
KH2PO4	Vetec	60REAVET014512
Meio de cultura L-15 da Leibovitz	Gibco	11415-064
Metanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
Microtubos Lâminas de Microscópio	Kasvi	K5-7105
MARCA		Z336769-1PAK
Na2HPO4	Vetec	60REAVET014593
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Câmara de Neubauer	Kasvi	K5-0111
Penicilina	Gibco	15140163
Coquetel de inibidores de protease	Sigma-Aldrich	P2714
Tween 80	Vetec	60REAVET003662