Artigo de método

Um pipeline completo para isolar e sequenciar MicroRNAs e analisá-los usando ferramentas de código aberto

DOI:

10.3791/59901

⸱

21 de agosto de 2019

 ,  , 
1Division of Medical Genetics, University of Washington School of Medicine

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos uma estratégia passo a passo para isolar pequenas RNAs, enriquecedora para microRNAs e preparando amostras para sequenciamento de alta taxa de transferência. Em seguida, descrevemos como processar leituras de sequência e alinhá-las ao microRNAs, usando ferramentas de código aberto.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A metade de todas as transcrições humanas é pensada para ser regulada por microRNAs. Portanto, a quantificação da expressão de microRNA pode revelar mecanismos subjacentes nos Estados de doença e fornecer alvos terapêuticos e biomarcadores. Aqui, detalhamos como quantificar com precisão microRNAs. Resumidamente, este método descreve isolando microRNAs, ligando-os a adaptadores adequados para sequenciamento de alta taxa de transferência, amplificando os produtos finais e preparando uma biblioteca de exemplo. Em seguida, explicamos como alinhar as leituras de sequenciamento obtidas aos grampos de cabelo microRNA e quantificar, normalizar e calcular sua expressão diferencial. Versátil e robusto, este fluxo de trabalho experimental combinado e a análise Bioinformatica permitem que os usuários comecem com a extração do tecido e termine com quantificação de microRNA.

Introdução

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Descoberto pela primeira vez em 19931, estima-se agora que cerca de 2000 microRNAs estão presentes no genoma humano2. MicroRNAs são pequenos não-codificando RNAs que são tipicamente 21-24 nucleotídeos longo. São reguladores pós-transcripcionais da expressão gênica, muitas vezes vinculando-se a sítios complementares na região 3-não traduzida (3-UTR) de genes alvo para reprisarem a expressão protéica e degradar o mRNA. Quantificando microRNAs pode dar uma visão valiosa sobre a expressão gênica e vários protocolos foram desenvolvidos para esta finalidade3.

Nós desenvolvemos um protocolo definido, reprodutível, e de longa data para o sequenciamento de RNA pequeno, e para analisar leituras normalizadas usando ferramentas de Bioinformática de código aberto. É importante ressaltar que nosso protocolo possibilita a identificação simultânea de microRNAs endógenos e construções exogenamente entregues que produzem espécies semelhantes a microRNA, enquanto minimiza leituras que mapeiam para outras espécies de RNA pequenas, incluindo RNAs ribossômicas ( rRNAs), transferir RNAs pequenas derivadas de RNA (tsRNAs), RNAs pequenas derivadas de repetição e produtos de degradação de mRNA. Felizmente, os microRNAs são 5-fosforilados e 2-3 hidroxilados4, um recurso que pode ser aproveitado para separá-los dessas outras pequenas RNAs e produtos de degradação de mRNA. Existem várias opções comerciais para a clonagem e sequenciamento do microRNA que muitas vezes são mais rápidas e fáceis de multiplexação; no entanto, a natureza proprietária de reagentes de kit e suas modificações freqüentes faz comparando amostra corre desafiador. Nossa estratégia otimiza a coleta apenas o tamanho correto de microRNAs através de acrilamida e etapas de purificação de gel de agarose. Neste protocolo, também descrevemos um procedimento para alinhar leituras de sequência a microRNAs usando ferramentas de código aberto. Este conjunto de instruções será especialmente útil para usuários de informática novatos, independentemente de se o nosso método de preparação de biblioteca ou um método comercial é usado.

Este protocolo tem sido utilizado em vários estudos publicados. Por exemplo, ele foi usado para identificar o mecanismo pelo qual a enzima Dicer cliva pequenas RNAs hairpin a uma distância de dois nucleotídeos do laço interno da estrutura de loop-tronco-a chamada "regra de contagem de loop"5. Nós igualmente seguimos estes métodos para identificar a abundância relativa de RNAs pequenos entregados do hairpin (shRNA) expressado dos vetores virais adeno-associados de recombinação (rAAVs), para identificar o ponto inicial da expressão de shRNA que pode ser tolerada antes do fígado toxicidade associada à expressão excessiva de shRNA6. Usando este protocolo, nós igualmente identificamos microRNAs no fígado que respondem à ausência de microRNA-122-um microRNA hepatic altamente expressado-ao igualmente caracterizar o teste padrão da degradação deste microRNA7. Porque nós usamos nosso protocolo consistentemente em experiências numerosas, nós pudemos observar longitudinalmente preparações da amostra, e vemos que não há nenhum efeito discernível do grupo.

Ao compartilhar este protocolo, nosso objetivo é permitir que os usuários gerem alta qualidade, quantificação reprodutível de microRNAs em praticamente qualquer linha de tecido ou célula, usando equipamentos e reagentes acessíveis e ferramentas de Bioinformática gratuitas.

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Protocolo

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Experimentos com animais foram autorizados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Washington.

Preparação pequena da biblioteca do RNA

1. isolação do RNA

  1. Isole o RNA de uma fonte biológica usando um reagente padrão do isolamento do RNA, ou um jogo que enriquece para microRNAs. Para os tecidos, é melhor começar com amostras snap-congelado em nitrogênio líquido e terra a um pó usando um almofariz pré-resfriado e pilão.
  2. Meça a integridade do RNA de cada amostra em um instrumento que possa quantificar o RNA e forneça um número da integridade do RNA (RIN). RINs devem ser > 7.

2.3 ' ligadura do adaptador

  1. Prepare uma reação de ligadura em tubos de tiras de PCR, combinando: 11 μL de RNA (1-3 μg, usando a mesma quantidade para cada amostra), 1,5 μL de tampão de reação da ligase de RNA de 10x T4, ATP-livre, 1 μL de Poli-etileno glicol (PEG) e 0,5 μL de 3 '-Linker (100 μM universal miRNA clonagem Lin de um doente).
    Nota: a ausência de ATP ajuda a enriquecer para miRNAs e minimiza a clonagem de produtos de degradação de mRNA. PEG atua como um agente de aglomeração molecular, melhorando a ligadura bem sucedida. O vinculador universal do clonagem de Mirna tem um grupo de obstrução 3 ' (Amine) para impedir o Self-ligadura, a circularização, e a ligadura ao RNA na extremidade 5 '.
  2. Aqueça as amostras a 95 ° c num termociclador para 30-40 s. arrefecer no gelo durante 1 min. adicionar 1 μL de RNA de T4 ligase 2 e incubar à temperatura ambiente durante 2 h. Prepare o gel (passo 2,3) enquanto as amostras estão incubando.
    Nota: incubação à temperatura ambiente ajuda a evitar ligadura linker-linker. Nós igualmente usamos com sucesso a ligase do RNA T4 1.
  3. Prepare 30 mL de um gel de poliacrilamida a 15% com ureia de 8 M (para um gel de 20x20 cm): 14,4 g de ureia, 3 mL de 10x ácido etilenodiaminotraacético com tampão Tris (TBE), 11,2 mL de 40% 19:1 acrilamida e H2o a 30 ml. A solução é melhor dissolvida a 42 ° c. Imediatamente antes da fundição, adicione 150 μL de persulfato de amônio a 10% (APS) e 30 μL de tetrametilenodiamina (TEMED) para polimerização.
  4. Despeje entre 0,8 mm separados placas de vidro em um molde de plástico e inserir pente. Uma vez que o gel é solidificado (aproximadamente 20 minutos), adicione 0.5 x TBE ao tanque e lave poços da ureia residual introduzindo com pipting vigorously.
  5. Pre-Run o gel em uma constante 375 V por 25 min sem amostras para que a ureia pode entrar no gel, em seguida, lave os poços novamente.
    Nota: a quantidade de tensão pode precisar de ser reduzida dependendo do tipo de fonte de alimentação e do sistema da electroforese que é usado.
  6. Uma vez que as amostras são feitas de ligadura, adicione 15 μL de corante de carga de acrilamida para as amostras (para uma proporção de 1:1), em seguida, desnaturar por 5 min a 95 ° c em um termociclador.
  7. Prepare 25 ng/μL de 37 e 44 BP marcadores de tamanho, diluído com uma parte de acrilamida corante de carga. As sequências estão listadas na tabela 1.
  8. Coloque as amostras no gel de poliacrilamida, deixando pelo menos uma faixa entre cada amostra. Carregar 20 μL de pelo menos dois conjuntos de marcadores, num padrão assimétrico para acompanhar a orientação do gel.
  9. Execute o gel em uma constante 375 V para os primeiros 15 min e, em seguida, aumente para uma constante 425 V para a execução restante. Corra até que o azul do bromofenol esteja aproximadamente 1-4 cm da parte inferior, que toma aproximadamente 2 h.
    Nota: se necessário, o gel pode ser executado em uma tensão constante mais baixa por um período de tempo mais longo até que o azul do bromofenol esteja aproximadamente 1-4 cm da parte inferior.
  10. Retire o gel das placas de vidro usando um separador de placa, e coloque o gel em um protetor de página de plástico. Diluir 5 μL de brometo de etídio em 500 μL de água destilada e pipetar para as vias do marcador logo acima do marcador azul claro superior (ver Figura 1a).
    PRECAUÇÃO: Utilize luvas para brometo de etídio e elimine os resíduos de acordo com as regulamentações locais. Deixe descansar por 5 min.
  11. a luz ultravioleta (UV), corte os géis de cima para baixo marcador em cada pista usando lâmina de barbear limpa (ver Figura 1a). Transferir para um quadrado de 4 x 4 cm de filme de vedação de laboratório, em seguida, cortar o gel com cerca de 4 cortes horizontalmente e 3 verticalmente para produzir 12 pequenos quadrados (ver Figura 1b).
  12. Pipete 400 μL de 0,3 M de NaCl para o quadrado do filme de vedação e peças em gel de funil em tubos siliconizados de 1,5 mL (ver Figura 1C). Agitar as amostras em um pulverizador a 4 ° c durante a noite.
    Nota: outros tubos de 1,5 mL de baixa retenção podem ser substituídos por tubos siliconizados.
  13. Após pelo menos 12 h de agitação a 4 ° c, recupere as amostras e coloque-as no gelo, juntamente com um tubo cônico de etanol a 100%.
  14. Transfira 400 μL de sobrenadante para um novo tubo e, em seguida, adicione 1 mL de etanol a 100% e 1 μL de coprecipitante de glicogênio 15 mg/mL. Assegure-se de recolher o máximo de sobrenadante possível, girando para baixo a 4 ° c e pipetando mais conforme necessário. Coloc em-80 ° c para 1 h, ou-20 ° c por 2 h ou mais por muito tempo. O coprecipitant do glycogen melhora a visibilidade e a recuperação da pelota.
  15. Gire a 4 ° c a 17.000 x g por 20-30 min. Remova todos os traços de etanol e deixe secar o ar da pelota por 5 min.

3.5 ' ligadura do vinculador

  1. Resuspenda o pellet introduzindo pipetagem em 6,5 μL de água sem nuclease. Deixar o pellet sentar-se na água por alguns minutos primeiro vai ajudar com a re-suspensão.
  2. Depois de girar o pellet e ressuscite na água, adicione 0,5 μL de 100 μM 5 '-Linker (com códigos de barras; ver tabela 1), 1 μL de tampão de LIGASE de RNA T4, 1 ΜL de ATP de 10 mm e 1 ΜL de Peg. Aqueça a 90 ° c por 30 s, depois coloque no gelo. Adicionar 1 μL de RNA de T4 ligase 1 e deixar incubar à temperatura ambiente durante 2 h.
  3. Adicionar 400 μL de 0,3 M de NaCl, seguido de 400 μL de fenol ácido/clorofórmio. Vortex 30 s-1 min (solução vai olhar nublado), e depois girar a 4 ° c para 10-15 min na velocidade máxima em uma microcentrífuga (~ 17.000 x g). Desenhe a camada superior e coloque no novo tubo de 1,5 mL.
    Nota: Evite Pipetar qualquer uma das camadas inferiores.
  4. Adicione 350 μL de clorofórmio, vórtice brevemente e, em seguida, gire a 4 ° c por 10 min na velocidade máxima (~ 17.000 x g). Desenhe o topo mais tarde e coloque no novo tubo de 1,5 mL. Adicionar 1,5 μL de coprecipitante de glicogênio e 1 mL de etanol a 100%.
    Nota: mais uma vez, evite pipetagem de qualquer camada inferior.
  5. Vortex brevemente, em seguida, coloque em-80 ° c por pelo menos 1 h, ou-20 ° c durante a noite.

4. transcrição reversa (RT)

  1. Ligue o bloco de calor de 42 ° c. Gire as amostras a 4 ° c e ~ 17.000 x g por 20-30 min. Remova todo o sobrenadante e deixe o ar da pelota secar por 5 min.
  2. Re-suspender a amostra peletizada em 8,25 μL de água sem nuclease, em seguida, adicionar: 0,5 μL de 100 μM RT Primer (tabela 1), e 5 μL de 2x RT Reaction mix de um kit de síntese de cDNA. Incubar a 42 ° c durante 3 min.
  3. Adicionar 1,5 μL de enzima 10x RT a cada amostra e incubar a 42 ° c durante 30 min num termocicer. Coloc em-20 ° c ou continue com hidrólise e neutralização.
    Nota: vários kits RT podem ser utilizados para as etapas 4,2 e 4,3.
  4. Realize a hidrólise alcalina e a neutralização: faça 1 mL de solução de hidróxido de potássio (KOH) de 150 mM (150 μL de 1 m de KOH, 20 μL de 1 M Tris base pH 7,5 e 830 μL de H2O) e 1 ml de ácido clorídrico de 150 mm (HCL) (150 μL de 1 m HCl e 850 μl de H2O).
  5. Antes de adicionar às amostras, determine a quantidade de HCl necessária para neutralizar a solução de KOH. Geralmente, cerca de 20-24 μL de HCl neutralizarão os 25 μL de KOH. Verifique a combinação em uma tira do pH para assegurar-se de que esteja na escala direita (pH 7,0 a 9,5).
  6. Hydrolyze as amostras adicionando 25 μL de solução de KOH de 150 mM e incubar por 10 min a 95 ° c.
  7. Neutralize as amostras adicionando a quantidade de 150 mM HCl determinada na etapa 4,4, para obter uma amostra final pH entre 7,0 e 9,5.

5. amplificação do PCR

  1. Após a neutralização, prepare uma reação de PCR com: 29,5 μL de água, 5 μL de tampão Taq 10x, 1 μL de dNTP, 2 μL de primer de 25 μM para a frente (tabela 1), 2 μL de primer reverso de 25 μm (tabela 1), 0,5 μL de Taq e 10 μl do cDNA transcrito reverso da etapa 4,6 .
  2. Execute a seguinte reacção de PCR: 94 ° c por 2 min, depois 20 ciclos de 94 ° c para 45 s, 50 ° c para 75 s e 72 ° c para 60 s.
  3. Execute uma segunda reação do PCR de aproximadamente 2-4 mais ciclos usando 5 μL do produto da etapa 5,2. Mistura: 34,8 μL de água, 5 μL de tampão Taq 10x, 1 μL de dNTP, 1 μL de primer de 25 μM para a frente (tabela 1), 1 μL de primer reverso de 25 μm (tabela 1) e 0,2 μL de Taq polimerase. Siga os mesmos parâmetros do termociclador esboçados na etapa 5,2.
    Nota: a finalidade de fazer duas reações do PCR-com o primeiro para 20 ciclos e o segundo para apenas 2-4 mais-é assegurar-se de que a quantidade de cDNA amplificada esteja em uma escala dinâmica (isto é, não uma quantidade saturada).

6. purificação do gel do agarose

  1. Prepare um gel de agarose 4% com agarose de baixa fusão. Carga 40 μL ou mais do produto do PCR no gel, junto com o corante do carregamento. Carga 100 BP e 25 BP marcadores de tamanho.
    Nota: a escada de 25 BP ajuda a distinguir produto amplificado de produtos de ligadura linker-linker. Os géis de agarose de baixa fusão devem ser fundidos com maior cuidado do que os géis de agarose tradicionais, seguindo atentamente as instruções do fabricante.
  2. Para a extração do gel, selecione o número do ciclo que é visível no gel mas não está saturado (geralmente 22 – 24 ciclos). Escolha bandas de intensidade semelhantes ao executar várias amostras.
  3. Corte a faixa que está acima da faixa de 125 BP (a faixa mais escura na escada de 25 BP; ver Figura 1D). Usando um kit de extração de gel, siga as instruções do fabricante para adicionar buffer com base em um gel de 4%, em seguida, agitar para dissolver agarose em buffer à temperatura ambiente.
    Nota: dissolver a 55 ° c aumenta o potencial de ligadura linker-linker.
  4. Siga as instruções de extração de gel do fabricante e eluir em 30 μL de tampão de eluição ou água. Se o produto parecia fraco no gel, em seguida, reduzir a eluição de 20 μL.
  5. Meça a concentração do cDNA usando uma técnica sensível, e prepare a biblioteca da amostra para arranjar em seqüência. A preparação dependerá do tipo de sequenciamento utilizado.
    Nota: os requisitos mínimos para uma biblioteca de sequenciamento são tipicamente um volume de 10 μL de produto de 10 μM. Se as concentrações são demasiado baixas, a associação e o etanol precipitam amostras para trazer a biblioteca à concentração desejada.
  6. Sequenciar as amostras usando o equipamento disponível. Um exemplo comum seria executar amostras usando um kit para 50 BP leituras únicas, para obter aproximadamente 15-25 milhões de leituras em um formato de saída FASTQ.

Alinhamento de seqüência de RNA pequeno e bioinformática

7. upload de dados

  1. Transfira arquivos FASTQ gerados de cada execução de sequenciamento. Faça o download de uma lista de seqüências de hairpin microRNA de miRbase.org8,9,10.
  2. Gere uma conta Galaxy em www.usegalaxy.org e carregue um ficheiro FASTQ de leituras de sequência para esta conta.
  3. Carregue um arquivo de texto de sequências de código de barras para a conta Galaxy, como o barcodes. txt, que está disponível como um arquivo de texto (tabela complementar 1).
  4. Faça o upload de um arquivo FASTA de grampos microRNA para a conta Galaxy de um banco de dados como miRBase.org. Exemplos de mouse (mousehairpins. FA) ou humanos (humanhairpins. FA) os precursores de microRNA são fornecidos na tabela complementar 2 e na tabela complementar 3.

8. remoção do adaptador, tipo do código de barras, e guarnição

  1. Na guia à esquerda, navegue até a manipulação de arquivos genômica > FASTA/FASTQ > seqüências do adaptador de clipe.
  2. No arquivo de entrada no formato FASTA ou fastq, insira o arquivo fastq na lista suspensa. Mude o comprimento de seqüência mínimo a 18. Altere Source para Inserir sequência personalizada. Digite Ctgtaggc. Mantenha todos os outros parâmetros padrão. Clique em executar.
    Observação: leituras de seqüência que são menores que 18 nucleotídeos são difíceis de mapear exclusivamente para microRNAs e contêm muitos produtos de degradação.
  3. Na guia à esquerda, navegue até a manipulação de arquivos genômica > FASTA/fastq ≫ Barcode Splitter.
    Nota: as funções do Galaxy e os cabeçalhos são actualizados periodicamente, pelo que a função de procura pode ser necessária para encontrar uma ferramenta equivalente ou a respectiva localização. Kits comerciais usando primers indexados muitas vezes já são classificados por código de barras. Conseqüentemente, esta etapa e a etapa da guarnição do código de barras não são necessárias se partindo de um jogo comercial.
  4. Para códigos de barras para usar, aponte para barcodes. txt. Para que a biblioteca seja dividida, use clip no arquivo de dados produzido na etapa anterior. Em número de incombinações permitidas, insira 1. Clique em executar.
  5. Aparar os primeiros 4 nucleotídeos: Navegue até manipulações de texto ≫ aparar caracteres à esquerda ou à direita. Para o conjunto de dados de entrada, clique no ícone de pasta, que é uma coleção de conjunto de dados. Selecione o arquivo em lotes de amostras, que inclui o divisor de código de barras de rótulo em dados. Em aparar desde o início até esta posição, insira 5. No é o conjunto de dados de entrada no formato FASTQ? digite Sim. Clique em executar. A execução pode demorar vários minutos.

9. alinhamento de leituras para microRNAs

  1. No Galaxy, navegue para análise de genômica > RNA-Seq > quantificação de transcrição sailfish11.
  2. Para a pergunta Selecione um transcriptoma de referência de seu histórico ou use um índice interno? selecione usar um do histórico. Insira o arquivo carregado mousehairpins. FA na lista suspensa. No arquivo FASTA/Q, clique no ícone de pasta para usar uma coleção de conjunto de dados e selecione o arquivo que inclui Trim na coleção. Clique em executar. A execução pode demorar vários minutos.
  3. Na guia histórico à direita, clique em sailfish na coleção... que é uma lista com 19 itens. Clique em cada arquivo individual e clique no ícone de disco para salvar no computador local. Os arquivos baixados individualmente primeiro precisam ser descompactados. Eles também podem precisar ser salvos novamente com uma extensão. txt com a finalidade de importar para uma planilha.
  4. Abra cada arquivo de planilha e renomeie a coluna Numreads para a condição de tratamento. Mesclar as colunas juntas para gerar uma matriz de microRNAs na primeira coluna e ler contagens por condição em colunas subseqüentes.
  5. Para calcular microRNAs diferencialmente expressas para cada condição de tratamento, use o arquivo com contagens de leitura de microRNA RAW como entrada para programas como DESeq212. DESeq2 está presente no Galaxy na análise de genômica > RNA-seq ≫ DESeq2 Tab.
  6. Converta leituras RAW para contagens de leitura microRNA normalizadas. As contagens são normalizadas para a profundidade da sequência de biblioteca da biblioteca através do seguinte cálculo: [(leituras brutas/leituras totais de microRNA) * (1 milhão – número de microRNAs contados) + 1].
    Nota: este cálculo fornece uma leituras normalizadas por milhão (RPM) mapeadas microRNAs que podem ser comparadas entre conjuntos de dados e condições biológicas. A saída é um arquivo delimitado por tabulação. Sailfish fornece uma coluna de saída do TPM , embora esse valor seja normalizado pelo comprimento do hairpin microRNA, o que não é necessário neste contexto.
  7. Se relevante, repita o alinhamento com sequências de entrada personalizadas (por exemplo, um vetor) para identificar as leituras que mapeiam para construções entregues, como shRNAs.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esquema das etapas envolvidas na preparação da biblioteca
Um esquema geral de extração, seqüenciamento e alinhamento de RNA pequeno é descrito na Figura 2.
Amostras de fígado de um macho e de um rato fêmea foram coletadas e estalaram congelado no nitrogênio líquido. O RNA total foi extraído e avaliado quanto à qualidade e concentração.

O sequenciamento de RNA pequeno p...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apesar da identificação de microRNAs há mais de 20 anos,13, o processo de sequenciamento de microRNA permanece trabalhoso e requer equipamentos especializados, impedindo que os laboratórios adotem rotineiramente os protocolos em casa14. Outras técnicas podem simultaneamente avaliar microRNAs, como Microarrays microRNA e painéis de expressão multiplexados; Entretanto, estas aproximações são limitadas que quantificam somente o microRNAs atual em seu jogo da ponta de prova. De...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer aos membros dos laboratórios de Andrew Fire e Mark Kay por orientação e sugestões.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Escada de DNA de 100 bpNEBN3231
19:1 bis-acrilamidaMillipore SigmaA9926
Escada de DNA de 25 bpPromegaG4511
Ácido fenol/clorofórmioThermoFisherAM9720
Corante de carregamento de RNA de acrilamidaThermoFisherR0641
Persulfato de amônio (APS)Instrumento bioanalisador Biorad161-0700
AgilentG2991AAPara avaliar a qualidade e concentração de RNA
ClorofórmioFisher ScientificC298-500
Etanol (100%)SigmaE7023
Gel Loading Buffer IIThermoFisherAM8547
GlycoBlueThermoFisherAM9516A cor azul ajuda na visualização do pellet
HClSigma320331
KOHSigmaP5958
Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cmGenesee45-109
miRVana microRNA kit de isolamentoThermoFisherAM1560
miSeq systemIlluminaSY-410-1003Para gerar pequenos dados
NaClFisher ScientificS271-500
Nusieve agarose de baixo ponto de fusãoLonza50081
Parafilm (filme de vedação de laboratório)Millipore SigmaP7793
Polietilenoglicol 8000NEBincluído com M0204
ProtoScript II Kit de Síntese de cDNA de primeira fitaNEBE6560S
QIAquick Gel Kit de extraçãoQiagen28704
Qubit FluorômetroThermoFisherQ33226Para quantificar a concentração de DNA
Qubit RNA HS Kit de ensaioThermoFisherQ32855
Lâminas de barbearFisher Scientific12640
Siliconized Low-Retention 1,5 ml tubosFisher Scientific02-681-331
T4 RNA ligase 1NEBM0204
T4 RNA Ligase 2, truncado K227QNEBM0351S
TapeStationAgilentG2939BAPara avaliar a qualidade e concentração do RNA
Taq DNA PolimeraseNEBM0273X
TEMEDBiorad161-0800
Tris Base pH 7,5Sigma10708976001
EDTA tampolado com TrisSigmaT9285
TrizolThermoFisher15596026
brometo de etídio ultrapuro (10 mg/ml)Invitrogen15585-011
Ligante universal de clonagem de miRNANEBS1315S
UreiaSigmaU5378
de sequenciamento de RNA

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  2. Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
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  4. Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. Biogenesis of small RNAs in animals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).
  5. Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
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  7. Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321(2018).
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  9. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
  10. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
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