Visualizando dinâmica sadrindo de receptor estéta de células t usando microscopia de folha de luz de rede

Summary

O objetivo deste protocolo é mostrar como usar microscopia de folha de luz de rede para visualizar quatro dimensões a dinâmica do receptor de superfície em células vivas. Aqui são mostrados receptores de células T em células CD4⁺ T primárias.

Abstract

A sinalização e a função de uma célula são ditadas pelas estruturas dinâmicas e interações de seus receptores de superfície. Para realmente entender a relação estrutura-função desses receptores in situ, precisamos visualizá-los e rastreá-los na superfície das células vivas com resolução suficiente spatiotemporal. Aqui mostramos como usar microscopia de folha de luz de rede recém-desenvolvida (LLSM) para imagem de receptores de células T (TCRs) quatro dimensionalmente (4D, espaço e tempo) na membrana celular ao vivo. As células T são uma das principais células effectoras do sistema imunológico adaptativo, e aqui usamos as células T como exemplo para mostrar que a sinalização e a função dessas células são impulsionadas pela dinâmica e interações dos TCRs. O LLSM permite imagens 4D com resolução sem precedentes. Esta técnica de microscopia, portanto, pode ser geralmente aplicada a uma ampla gama de moléculas superficiais ou intracelulares de diferentes células na biologia.

Introduction

A dinâmica precisa do tráfico de moléculas e difusão na superfície celular tridimensional em tempo real têm sido um enigma para resolver. A microscopia sempre foi um equilíbrio de velocidade, sensibilidade e resolução; se qualquer um ou dois forem maximizados, o terceiro é minimizado. Portanto, devido ao pequeno tamanho e imensa velocidade com que os receptores de superfície se movem, o rastreamento de sua dinâmica tem permanecido um grande desafio tecnológico para o campo da biologia celular. Por exemplo, muitos estudos têm sido realizados utilizando a microscopia total de fluorescência interna (TIRF)^1,2,3, que tem alta resolução temporal, mas só pode imaginar uma fatia muito fina da membrana t-cell (~100 nm), e, portanto, perde eventos acontecendo mais longe na célula. Essas imagens tirf também mostram apenas uma seção bidimensional da célula. Em contrapartida, técnicas de superresolução, como microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM)^4,microscopia de localização fotoativada (PALM)⁵e microscopia de esgotamento de emissões estimuladas (STED)⁶, podem superar o limite de difração de luz abbe. Essas técnicas têm alta resolução espacial (~20 nm resolução)^4,5,6,7,mas muitas vezes levam muitos minutos para adquirir uma imagem bidimensional completa (2D) ou tridimensional (3D) e, portanto, a resolução temporal é perdida. Além disso, técnicas como STORM e PALM que dependem de sinais piscando podem ter imprecisões na contagem^{de 8,9}. A microscopia eletrônica tem de longe a mais alta resolução (até 50 pm resolução)¹⁰; ele pode até ser conduzido tridimensionalmente com microscopia eletrônica de varredura de feixe de íon focada (FIB-SEM), resultando em até 3 nm XY e resolução de 500 nm Z¹¹. No entanto, qualquer forma de microscopia eletrônica requer preparação de amostra gemida severa e só pode ser conduzida com células ou tecidos fixos, eliminando a possibilidade de imagens de amostras vivas ao longo do tempo.

Técnicas para obter a alta resolução spatiotemporal necessária para identificar a dinâmica das moléculas superficiais e intracelulares em células vivas em sua verdadeira natureza 3D fisiológica só estão sendo desenvolvidas recentemente. Uma dessas técnicas é a Microscopia de Folha de Luz de Retta (LLSM)^12,que utiliza uma folha de luz estruturada para diminuir drasticamente o fotobranqueamento. Desenvolvido em 2014 pelo ganhador do Nobel Eric Betzig, a alta resolução axial, o baixo fotobranqueamento e o ruído de fundo, e a capacidade de imagem simultânea de centenas de aviões por campo de visão tornam microscópios LLS superiores aos microscópios widefield, TIRF e confocals^{12,13,14,15,16,17,18,19}. Esta técnica de imagem de quatro dimensões (x, y, z e tempo), embora ainda limitada (resolução XYZ de ~200 nm), tem uma incrível resolução temporal (alcançamos uma taxa de quadros de cerca de 100 fps, resultando em uma imagem celular reconstruída em 3D com 0,85 segundos por quadro) para aquisição espacial 3D.

LlSM pode ser geralmente usado para rastrear dinâmicas em tempo real de quaisquer moléculas dentro de qualquer célula no nível de única molécula e unicelular, particularmente aquelas em células altamente mois, como células imunes. Por exemplo, mostramos aqui como usar llsm para visualizar a dinâmica do receptor de células T (TCR). As células T são as células effector do sistema imunológico adaptativo. Os TCRs são responsáveis pelo reconhecimento de ligantes peptídeos-MHC (pMHC) exibidos na superfície das células presentes a antígenos (APC), que determina a seleção, desenvolvimento, diferenciação, destino e função de uma célula T. Esse reconhecimento ocorre na interface entre células T e APCs, resultando em agrupamento de receptores localizados para formar o que é chamado de sinapse imunológica. Embora se saiba que os TCRs na sinapse imunológica são imperativos para a função de efeito t-células, ainda desconhecidos são os mecanismos subjacentes do tráfico de TCR em tempo real para a sinapse. A LLSM nos permitiu visualizar em tempo real a dinâmica dos TCRs antes e depois do tráfico para a sinapse com a interação pMHC-TCR resultante (Figura 1). O LLSM pode, portanto, ser usado para resolver questões atuais da dinâmica formativa dos TCRs e fornecer insights para entender como uma célula distingue entre antígenos eu e estrangeiros.

Protocol

5C. C7 TCR-transgênico RAG2 ratos knockout em B10. Um pano de fundo foi utilizado neste estudo de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Chicago.

1. Colher e Ativar células T

NOTA: Esta parte do protocolo é baseada em protocolos anteriores. Veja citações para mais detalhes^20,21.

1. Eutanize um 5C de 10 a 12 semanas. C7 mouse transgênico de ambos os sexos (~20-25 g) de acordo com o protocolo iACUC aprovado (ou seja, câmara de CO₂ seguida de luxação cervical).
2. Pulverizar a carcaça do rato com 70% de etanol para absorver a pele e trazer para um armário de segurança BSL-2.
3. Vire o rato para o lado direito e faça uma pequena incisão na cavidade corporal com tesoura cirúrgica. Remova o baço usando fórceps cirúrgicos. Corte o tecido conjuntivo conforme necessário com uma tesoura cirúrgica.
4. Coloque o baço em um filtro de célula de malha de 70 μm-pore e misture com a parte de trás de um êmbolo de seringa de 1 mL. Lave o filtro com RPMI completo (RPMI com 10% de soro bovino fetal [FBS], 2 mM L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina, 50 μM 2-mercaptoetanol).
5. Centrífuga a suspensão de uma única célula de splenocytes em 300 x g por 5 min. Descarte o supernatante.
   NOTA: A pelota neste momento será vermelha.
6. Resuspender os splenocytes em 5 mL RBC lysis buffer. Incubar por 5 min, depois saciar com 5 mL de RPMI completo.
7. Centrífuga a suspensão de uma única célula de splenocytes em 300 x g por 5 min. Descarte o supernatante.
   NOTA: A pelota neste momento deve ser branca, não vermelha.
8. Resuspender a pelota em 5 mL de RPMI completo.
9. Transfira para um frasco T-25 e adicione 10 μM de citocromo-C (MCC, sequência ANERADLIAYLKQATK). Coloque as células em uma incubadora de cultura celular a 37 °C, 5% DE CO₂ durante a noite.
10. No dia seguinte, adicione o mouse recombinante IL-2 a uma concentração final de 100 U/mL.
11. Observe para os dias seguintes, adicionando novas mídias à medida que a mídia atual fica amarela. As células T morrerão se deixadas na mídia amarela sem vigilância por mais de 48 h. As células estiverem prontas para usar de 6 a 10 dias após a colheita.

2. Preparar células

1. Incubar 5 mm de cobertura redonda com 0,1% poli-L-lysine por 10 min. Aspirar e deixar secar naturalmente.
2. Use um reagente gradiente de densidade (ver a Tabela de Materiais) para separar células mortas e obter 1 x 10⁶ células T e 1 x 10⁶ APCs (células CH27^21,22 transinduzidas com citosólicom mCherry) separadamente.
   NOTA: As células são contadas usando um hemocímetro.
   1. Adicione 3 mL de reagente gradiente de densidade a um tubo cônico de 15 mL e adicione as células em sentido lento à borda do tubo cuidadosamente. Não misture. Centrífuga a 930 x g por 10 min a 4 °C; usar aceleração/desaceleração: LENTO/LENTO. Remova cuidadosamente a fina camada média das células entre a mídia completa e o reagente gradiente de densidade cuidadosamente, colocando cada tipo de célula em tubos cônicos separados.
      NOTA: É necessário preparar mais células do que o necessário para a imagem, pois descobrimos que 50% são perdidos em média durante o processo. Quanto mais células usadas para o processo, mais fácil é colhê-las do gradiente de densidade. Usamos 4-8 mL de ambos os tipos de células para garantir o excesso de células. Se desejar, as células podem ser contadas antes desta etapa para garantir o volume necessário. Todas as células extras são colocadas de volta em seus respectivos frascos.
   2. Lave os dois tubos de células T e células CH27 três vezes com 5 mL rpmi completo (300 x g por 5 min). Descarte o supernatante cada vez durante a lavagem. Resuspender cada tubo em 1 mL completo RPMI e contar células por um hemocímetro.
3. Resuspender 1 x 10⁶ APCs em 500 μL rpmI completo e adicionar 10 μM MCC. Incubar por 3h a 37 °C, 5% CO₂. Lave células três vezes com 500 μL rpmi completo (300 x g por 5 min). Descarte os supernatantes.
4. Resuspender 1 x 10⁶ células T em 500 μL rpmI completo. Adicione 2 μg de Fab anti-TCRβ Alexa488 rotulado (clone H57) a 500 μL de células. Incubar por 30 min a 37 °C, 5% CO₂. Lave células três vezes com 500 μL de RPMI completo (300 x g por 5 min). Descarte supernatant depois de cada lavagem.
   NOTA: O anticorpo anti-TCR divalente foi cortado em Fab monovalente usando um kit de preparação fab (veja a Tabela de Materiais) para evitar cruzar os receptores de células T pelo anticorpo divalente (este passo é opcional).
5. Resuspender ambos os tipos de células em 500 μL de mídia de imagem (fenol vermelho-free Leibovitz's L-15 médio com 10% FBS, 1% penicilina/estreptomia, 2 mM L-glutamina).

3. Conduzindo o alinhamento diário llsm

NOTA: (Importante) Este protocolo de alinhamento é baseado no instrumento LLSM utilizado (consulte a Tabela de Materiais). Cada LLSM pode ser diferente e exigir diferentes estratégias de alinhamento, especialmente aquelas que são construídas em casa. Realize o alinhamento de rotina adequado e continue seção 4.

1. Adicione 10 mL de água mais 30 μL fluoresceína (1 mg/mL estoque) ao banho LLSM (~10 mL volume), pressione Image (Home) para mover o objetivo para a posição de imagem e olhar para um único padrão de feixe laser Bessel. Alinhar o raio laser usando as guias e a região de interesse pré-definido (ROI) para tornar o feixe um padrão fino equilibrado em todas as direções.
   1. O feixe também deve aparecer focado na câmera do localizador. Use dois ajustadores de inclinação do espelho, micrometro superior, foco e coleira objetiva de emissão para ajustar. Veja a Figura 2A,B para vigas corretamente alinhadas.
2. Lave o banho e os objetivos com pelo menos 200 mL de água para remover completamente a fluoresceína.
3. Contas fluorescentes padrão de imagem na mídia de imagem (preparadas aderindo contas a um deslizamento de cobertura de 5 mm com poli-L-lysine, consulte a Tabela de Materiais; isso pode ser pré-preparado e reutilizado) para a função de propagação de pontos físicos (PSF) em mídia de imagem.
   NOTA: Só pode haver uma peça em vista para processamento posterior, então tente encontrar uma peça que esteja sozinha no espectador ou possa ser facilmente cortada para obter uma única peça.
   1. Ligue o dither definindo para 3 na caixa 'X Galvo'. Pressione ao vivo para ver o campo atual. Mova-se ao longo da direção Z para encontrar o deslizamento de tampa e contas. Encontre o centro de uma peça movendo-se ao longo de Z, pressione Pare para pausar o laser. Verifique 3D,pressione o Centro e, em seguida, pressione execute. Isso coletará os dados.
   2. Ajuste manualmente o espelho de inclinação, a coleira objetiva e o micrometro de foco para os mais altos valores cinzentos, ajuste conforme necessário para obter padrões adequados para varredura objetiva, z galvo, z+objetivo (totPSF) e modos de captura de amostra (samplePSF). Consulte a Figura 2C-F para projeções de intensidade máxima devidamente ajustadas (MIPs).
      NOTA: Os vários modos de captura (varredura objetiva, z galvo, z+objetivo e amostragem) alteram a forma como a folha de luz se move através da amostra. Todos os modos de varredura devem ser usados para alinhamento.
   3. A varredura da amostra mostra como os dados serão coletados durante o experimento. Colete a amostra PSF pressionando Execute no modo de varredura de amostras para desdistorção e desconvolução (ver seção 5). Mude os lasers para três modos de cores (488, 560, 647) e pressione execute novamente.
      NOTA: Desde as imagens do LLSM em um ângulo (57,2°), as imagens capturadas no modo "varredura de amostra" são coletadas neste ângulo e, portanto, são "distorcidas". Desdistorção é o processo de correção para este ângulo e "realinhar" a imagem a uma verdadeira pilha z. Esses dados devem ser coletados em mídia de imagem e em todos os canais que serão imagens durante o experimento. Se isso não for coletado corretamente, os dados não serão devidamente desviados. Da mesma forma, certifique-se de que a mídia foi aquecida a 37 °C (ou temperatura experimental desejada).

4. Configuração de células com LLSM

1. Adicione 100.000 APCs (50 μL) da etapa 2,5 a um deslizamento circular de 5 mm de diâmetro da etapa 2.1 e permita que eles se contentem com 10 min.
2. Unte o suporte da amostra e adicione o lado da célula de deslizamento de cobertura a ele. Adicione uma gota de mídia de imagem na parte de trás do deslizamento de cobertura para evitar bolhas antes de colocar no banho. Dane-se o suporte da amostra no piezo e pressione Image (Home).
3. Encontre um APC para imagem para garantir que o LLSM e o software de imagem (ver Tabela de Materiais) estejam funcionando corretamente.
   NOTA: Nós imagem em 0,4 μm tamanho passo com 60 passos e exposição de 10 ms para duas cores com dither definido para 3, o que resulta em 1,54 s por quadro de imagem 3D com ~200 nm XY e resolução de 400 nm Z. Essas configurações podem precisar ser ajustadas com base no tamanho da célula, resolução z desejada e força de sinal da técnica de rotulagem fluorescente usada. O uso de energia a laser também variará com base na técnica de rotulagem fluorescente usada.
   1. Pressione ao vivo para ver a imagem atual. Mova-se ao longo de Z para encontrar o deslizamento de tampa e células.
   2. Encontre o centro de um APC movendo-se na direção Z, em seguida, pressione Pare para pausar o laser. Verifique 3D e insira as configurações desejadas (ver passo 4.3.1), pressione o Centro e, em seguida, pressione execute. Isso coletará os dados.
4. Abaixe o estágio para carregar a posição e adicione 50 μL de células T em mídia de imagem (100.000 células, a partir da etapa 2.5) em sentido de gota diretamente sobre o deslizamento de cobertura. É melhor deixar uma forma de gota na extremidade da ponta da pipeta e, em seguida, tocar a ponta para o líquido do banho. Levante o palco para trás clicando "Imagem (Retorno)".
5. Comece a imagem. Certifique-se de definir o tamanho da pilha desejado e o comprimento do lapso de tempo. Por exemplo, a imagem de 60 z-stacks a um tamanho de passo de 0,4 μm e os prazos de entrada 500. (Normalmente) pare de gravar antes que 500 quadros sejam alcançados para evitar fotobranqueamento. Use o modo Live para procurar pares de células e, quando as configurações prontas e desejadas forem inseridas, pressione execute para coletar dados. Veja o Filme 1 e a Figura 1 por exemplo.

5. Track Surface Dynamics

1. Exporte os dados do software de imagem (veja a Tabela de Materiais). Isso criará arquivos TIF z-stack para cada ponto de cada vez em cada cor.
2. Primeiro desdistore e desconve os dados.
   NOTA: Usamos o gasoduto LLSpy licença pelo Campus¹⁸de Pesquisa Janelia da HHMI, mas desdistorção e desconvolução também estão disponíveis dentro de vários softwares de imagem (ver Tabela de Materiais).
3. Desabranque os dados.
   NOTA: Usamos o recurso debleach de Fiji com correspondência de histograma (Fiji Pathway: Image | Ajuste | Correção de Alvejante | Correspondência do Histograma | OK).
4. Importe no software de rastreamento (veja a Tabela de Materiais). Rastreie clusters de acordo com as especificações do software. Veja o Filme 2 como exemplo.
   NOTA: O rastreamento dos resultados dependerá do software de rastreamento usado, algoritmo escolhido, parâmetros de saída desejados selecionados, etc. Por exemplo, no software de rastreamento que utilizamos (veja a Tabela de Materiais),optamos por permitir que o software rastreie formas irregulares, em vez de atribuir cada recurso um único ponto, uma vez que os clusters TCR não são organizados em esferas perfeitas. Além disso, optamos por coletar 35 parâmetros, incluindo velocidade, direção, volume, intensidade, área, localização e informações de duração da faixa. No entanto, diferentes métodos ou parâmetros serão benéficos para responder a diferentes perguntas.
   1. Se o rastreamento não for desejado, use o plugin ClearVolume para Fiji para visualizar e criar filmes a partir de dados de hiperstack.

Results

Aqui, descrevemos o isolamento, preparação e imagem do mouse primário 5C. Células C7 T usando um microscópio de folha de luz de rede. Durante a seção 3, é imprescindível alinhar o microscópio corretamente, e coletar PSF diariamente com o qual desconvolve os dados após a coleta. Na Figura 2,mostramos as imagens de alinhamento corretas que serão vistas ao alinhar o microscópio. A Figura 2A e a Figura 2B

Discussion

O protocolo apresentado foi otimizado para o uso de células CD4⁺ T isoladas de 5C. Camundongos transgênicos C7 no instrumento LLSM usados e, portanto, outros sistemas celulares e LLSMs podem precisar ser otimizados de forma diferente. No entanto, este protocolo mostra o poder da imagem 4D, pois pode ser usado para quantificar a dinâmica de um receptor de superfície em uma célula inteira com a menor distorção em condições fisiológicas. Portanto, existem muitas aplicações futuras possíveis desta técnica.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringa de 1 mL	BD	309659	Para colheita de células T
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	Para cultura de células T
mm lamínulas redondas	World Precision Instruments	502040	Para Aquisição de Imagens
70um Filtro de Células Estéreis	Corning	7201431	Para Colheita de Células T
Alexa Fluor 488 anti-rato TCR β cadeia Anticorpo	BioLegend	109215	para imagens
soro fetal bovino (FBS)	X & Cultura de células Y	FBS-500	para cultura de células T
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	Reagente de gradiente Denisty para colheita de células T
Sal de sódio fluoresceína	Sigma-Aldrich	F6377	Para alinhamento de microscópio
FluoSpheres Microesferas modificadas com carboxilato	Thermo Fisher Scientific	F8810	Para alinhamento de microscópio
Imaris	Bitplane	N/A	; Outras opções de software de rastreamento incluem Amira ou Trackmate (Fiji).
Microscópio de folha de luz treliçada	3i	N / A	Microscópio usado
L-15 de Leibovitz, sem fenol vermelho	Thermo Fisher Scientific	21083027	para imagens de
L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030-081	para cultura de células T
LLSpy	Janelia Research Campus	N / A	O LLSpy foi usado sob licença do Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Entre em contato com innovation@janelia.hhmi.org para acesso. Outros métodos de deconvolução e deksewing estão disponíveis em softwares de processamento de imagem como Fiji, Slidebook, Amira e outros. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Citocromo C (MCC), sequência ANERADLIAYLKQATK	Elimbio	Síntese personalizada	para colheita de células T
Penacillina/estreptamicina	Life Technologies	15140122_3683884612	para cultura de células T
Poli-L-lisina	Phenix Research Products	P8920-100ML	para imagem de imagem
RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4300-54	para colheita de células T
Camundongo recombinante IL-2	Sigma-Aldrich	I0523	para cultura de células T
RPMI 1640 Medium	Corning	MT10040CV	para cultura de células T
Slidebook	3i	N / A	LLSM imaging software
Ferramentas de dissecção	cirúrgicaNova-Tech International	DSET10	Para Colheita de Células T
T-25 Frascos	Eppendorf	2231710126	Para Cultura de Células T
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Kits de Preparação	Thermo Fisher Scientific	44685	Para Preparar Fab