Visualizando dinâmica sadrindo de receptor estéta de células t usando microscopia de folha de luz de rede

Summary

O objetivo deste protocolo é mostrar como usar microscopia de folha de luz de rede para visualizar quatro dimensões a dinâmica do receptor de superfície em células vivas. Aqui são mostrados receptores de células T em células CD4⁺ T primárias.

Abstract

A sinalização e a função de uma célula são ditadas pelas estruturas dinâmicas e interações de seus receptores de superfície. Para realmente entender a relação estrutura-função desses receptores in situ, precisamos visualizá-los e rastreá-los na superfície das células vivas com resolução suficiente spatiotemporal. Aqui mostramos como usar microscopia de folha de luz de rede recém-desenvolvida (LLSM) para imagem de receptores de células T (TCRs) quatro dimensionalmente (4D, espaço e tempo) na membrana celular ao vivo. As células T são uma das principais células effectoras do sistema imunológico adaptativo, e aqui usamos as células T como exemplo para mostrar que a sinalização e a função dessas células são impulsionadas pela dinâmica e interações dos TCRs. O LLSM permite imagens 4D com resolução sem precedentes. Esta técnica de microscopia, portanto, pode ser geralmente aplicada a uma ampla gama de moléculas superficiais ou intracelulares de diferentes células na biologia.

Introduction

A dinâmica precisa do tráfico de moléculas e difusão na superfície celular tridimensional em tempo real têm sido um enigma para resolver. A microscopia sempre foi um equilíbrio de velocidade, sensibilidade e resolução; se qualquer um ou dois forem maximizados, o terceiro é minimizado. Portanto, devido ao pequeno tamanho e imensa velocidade com que os receptores de superfície se movem, o rastreamento de sua dinâmica tem permanecido um grande desafio tecnológico para o campo da biologia celular. Por exemplo, muitos estudos têm sido realizados utilizando a microscopia total de fluorescência interna (TIRF)^1,2....

Protocol

5C. C7 TCR-transgênico RAG2 ratos knockout em B10. Um pano de fundo foi utilizado neste estudo de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Chicago.

1. Colher e Ativar células T

NOTA: Esta parte do protocolo é baseada em protocolos anteriores. Veja citações para mais detalhes^20,21.

1. Eutanize um 5C de 10 a 12 semanas. C7 mouse transgênico de ambos os sexos (~20-25 g) de acordo com o protocolo iACUC aprovado (ou seja, câmara de CO₂ seguida de luxação cervical).
2. Pu....

Results

Aqui, descrevemos o isolamento, preparação e imagem do mouse primário 5C. Células C7 T usando um microscópio de folha de luz de rede. Durante a seção 3, é imprescindível alinhar o microscópio corretamente, e coletar PSF diariamente com o qual desconvolve os dados após a coleta. Na Figura 2,mostramos as imagens de alinhamento corretas que serão vistas ao alinhar o microscópio. A Figura 2A e a Figura 2B

Discussion

O protocolo apresentado foi otimizado para o uso de células CD4⁺ T isoladas de 5C. Camundongos transgênicos C7 no instrumento LLSM usados e, portanto, outros sistemas celulares e LLSMs podem precisar ser otimizados de forma diferente. No entanto, este protocolo mostra o poder da imagem 4D, pois pode ser usado para quantificar a dinâmica de um receptor de superfície em uma célula inteira com a menor distorção em condições fisiológicas. Portanto, existem muitas aplicações futuras possíveis desta técnica.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringa de 1 mL	BD	309659	Para colheita de células T
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	Para cultura de células T
mm lamínulas redondas	World Precision Instruments	502040	Para Aquisição de Imagens
70um Filtro de Células Estéreis	Corning	7201431	Para Colheita de Células T
Alexa Fluor 488 anti-rato TCR β cadeia Anticorpo	BioLegend	109215	para imagens
soro fetal bovino (FBS)	X & Cultura de células Y	FBS-500	para cultura de células T
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	Reagente de gradiente Denisty para colheita de células T
Sal de sódio fluoresceína	Sigma-Aldrich	F6377	Para alinhamento de microscópio
FluoSpheres Microesferas modificadas com carboxilato	Thermo Fisher Scientific	F8810	Para alinhamento de microscópio
Imaris	Bitplane	N/A	; Outras opções de software de rastreamento incluem Amira ou Trackmate (Fiji).
Microscópio de folha de luz treliçada	3i	N / A	Microscópio usado
L-15 de Leibovitz, sem fenol vermelho	Thermo Fisher Scientific	21083027	para imagens de
L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030-081	para cultura de células T
LLSpy	Janelia Research Campus	N / A	O LLSpy foi usado sob licença do Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Entre em contato com innovation@janelia.hhmi.org para acesso. Outros métodos de deconvolução e deksewing estão disponíveis em softwares de processamento de imagem como Fiji, Slidebook, Amira e outros. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Citocromo C (MCC), sequência ANERADLIAYLKQATK	Elimbio	Síntese personalizada	para colheita de células T
Penacillina/estreptamicina	Life Technologies	15140122_3683884612	para cultura de células T
Poli-L-lisina	Phenix Research Products	P8920-100ML	para imagem de imagem
RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4300-54	para colheita de células T
Camundongo recombinante IL-2	Sigma-Aldrich	I0523	para cultura de células T
RPMI 1640 Medium	Corning	MT10040CV	para cultura de células T
Slidebook	3i	N / A	LLSM imaging software
Ferramentas de dissecção	cirúrgicaNova-Tech International	DSET10	Para Colheita de Células T
T-25 Frascos	Eppendorf	2231710126	Para Cultura de Células T
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Kits de Preparação	Thermo Fisher Scientific	44685	Para Preparar Fab