O objetivo deste protocolo é mostrar como usar microscopia de folha de luz de rede para visualizar quatro dimensões a dinâmica do receptor de superfície em células vivas. Aqui são mostrados receptores de células T em células CD4+ T primárias.
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Artigo de método
Visualizando dinâmica sadrindo de receptor estéta de células t usando microscopia de folha de luz de rede
Neste artigo
Resumo
Resumo
A sinalização e a função de uma célula são ditadas pelas estruturas dinâmicas e interações de seus receptores de superfície. Para realmente entender a relação estrutura-função desses receptores in situ, precisamos visualizá-los e rastreá-los na superfície das células vivas com resolução suficiente spatiotemporal. Aqui mostramos como usar microscopia de folha de luz de rede recém-desenvolvida (LLSM) para imagem de receptores de células T (TCRs) quatro dimensionalmente (4D, espaço e tempo) na membrana celular ao vivo. As células T são uma das principais células effectoras do sistema imunológico adaptativo, e aqui usamos as células T como exemplo para mostrar que a sinalização e a função dessas células são impulsionadas pela dinâmica e interações dos TCRs. O LLSM permite imagens 4D com resolução sem precedentes. Esta técnica de microscopia, portanto, pode ser geralmente aplicada a uma ampla gama de moléculas superficiais ou intracelulares de diferentes células na biologia.
Introdução
A dinâmica precisa do tráfico de moléculas e difusão na superfície celular tridimensional em tempo real têm sido um enigma para resolver. A microscopia sempre foi um equilíbrio de velocidade, sensibilidade e resolução; se qualquer um ou dois forem maximizados, o terceiro é minimizado. Portanto, devido ao pequeno tamanho e imensa velocidade com que os receptores de superfície se movem, o rastreamento de sua dinâmica tem permanecido um grande desafio tecnológico para o campo da biologia celular. Por exemplo, muitos estudos têm sido realizados utilizando a microscopia total de fluorescência interna (TIRF)1,2....
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Protocolo
5C. C7 TCR-transgênico RAG2 ratos knockout em B10. Um pano de fundo foi utilizado neste estudo de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Chicago.
1. Colher e Ativar células T
NOTA: Esta parte do protocolo é baseada em protocolos anteriores. Veja citações para mais detalhes20,21.
- Eutanize um 5C de 10 a 12 semanas. C7 mouse transgênico de ambos os sexos (~20-25 g) de acordo com o protocolo iACUC aprovado (ou seja, câmara de CO2 seguida de luxação cervical).
- Pu....
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Resultados
Aqui, descrevemos o isolamento, preparação e imagem do mouse primário 5C. Células C7 T usando um microscópio de folha de luz de rede. Durante a seção 3, é imprescindível alinhar o microscópio corretamente, e coletar PSF diariamente com o qual desconvolve os dados após a coleta. Na Figura 2,mostramos as imagens de alinhamento corretas que serão vistas ao alinhar o microscópio. A Figura 2A e a Figura 2B
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Discussão
O protocolo apresentado foi otimizado para o uso de células CD4+ T isoladas de 5C. Camundongos transgênicos C7 no instrumento LLSM usados e, portanto, outros sistemas celulares e LLSMs podem precisar ser otimizados de forma diferente. No entanto, este protocolo mostra o poder da imagem 4D, pois pode ser usado para quantificar a dinâmica de um receptor de superfície em uma célula inteira com a menor distorção em condições fisiológicas. Portanto, existem muitas aplicações futuras possíveis desta técnica.
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de reconhecer o conselho e a orientação do Dr. Vytas Bindokas na Universidade de Chicago. Agradecemos ao Centro Integrado de Microscopia Leve da Universidade de Chicago por apoiar e manter o microscópio de folha de luz de rede. Este trabalho foi apoiado pelo NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 e pelo NSF Career Award 1653782 (To J.H.). J.R. é apoiado pelo Programa de Bolsas de Pesquisa de Pós-Graduação da NSF.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringa de 1 mL | BD | 309659 | Para colheita de células T |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | Para cultura de células T |
| mm lamínulas redondas | World Precision Instruments | 502040 | Para Aquisição de Imagens |
| 70um Filtro de Células Estéreis | Corning | 7201431 | Para Colheita de Células T |
| Alexa Fluor 488 anti-rato TCR β cadeia Anticorpo | BioLegend | 109215 | para imagens |
| soro fetal bovino (FBS) | X & Cultura de células Y | FBS-500 | para cultura de células T |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Reagente de gradiente Denisty para colheita de células T |
| Sal de sódio fluoresceína | Sigma-Aldrich | F6377 | Para alinhamento de microscópio |
| FluoSpheres Microesferas modificadas com carboxilato | Thermo Fisher Scientific | F8810 | Para alinhamento de microscópio |
| Imaris | Bitplane | N/A | ; Outras opções de software de rastreamento incluem Amira ou Trackmate (Fiji). |
| Microscópio de folha de luz treliçada | 3i | N / A | Microscópio usado |
| L-15 de Leibovitz, sem fenol vermelho | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | para imagens de |
| L-glutamina | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | para cultura de células T |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N / A | O LLSpy foi usado sob licença do Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Entre em contato com innovation@janelia.hhmi.org para acesso. Outros métodos de deconvolução e deksewing estão disponíveis em softwares de processamento de imagem como Fiji, Slidebook, Amira e outros. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Citocromo C (MCC), sequência ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Síntese personalizada | para colheita de células T |
| Penacillina/estreptamicina | Life Technologies | 15140122_3683884612 | para cultura de células T |
| Poli-L-lisina | Phenix Research Products | P8920-100ML | para imagem de imagem |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | para colheita de células T |
| Camundongo recombinante IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | para cultura de células T |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | para cultura de células T |
| Slidebook | 3i | N / A | LLSM imaging software |
| Ferramentas de dissecção | cirúrgicaNova-Tech International | DSET10 | Para Colheita de Células T |
| T-25 Frascos | Eppendorf | 2231710126 | Para Cultura de Células T |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Kits de Preparação | Thermo Fisher Scientific | 44685 | Para Preparar Fab |
Referências
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z.
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Reimpressões e permissões
