O ensaio duplo da régua do ADN é desenvolvido para determinar a posição do mRNA durante a translocação Ribossoma, que confia nas forças da dissociação dos duplexes dados forma do ADN-mRNA. Com a definição e a capacidade single-nucleotide de alcangar ambas as extremidades do mRNA, pode fornecer introspecções mecanicista para o translocação e a sonda Ribossoma outros deslocamentos do ácido nucleico.
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Artigo de método
Réguas duplas do ADN para estudar o mecanismo da translocação ribosome com a definição do único-nucleotide
Neste artigo
Resumo
Resumo
A translocação Ribossome refere-se ao movimento ribossômico no mRNA por exatamente três nucleotídeos (NT), que é o passo central na síntese proteica. Para investigar o seu mecanismo, existem dois requisitos técnicos essenciais. Primeiro é a resolução de NT único que pode resolver translocação normal de frameshifting, durante o qual o Ribossome move por outros de 3 NT. A segunda é a capacidade de sonda tanto os lados de entrada e saída do mRNA, a fim de elucidar todo o quadro de translocação. Nós relatamos o ensaio duplo da régua do ADN que é baseado nas forças críticas da dissociação de duplexes do ADN-mRNA, obtidos pela espectroscopia de magnetização remanescente força-induzida (FIRMAS). Com resolução de força de 2-4 pN, o ensaio de régua dupla é suficiente para distinguir diferentes etapas de translocação. Implementando um linker longo nos DNAs de sondagem, podem alcangar o mRNA no lado oposto do ribosome, de modo que a posição do mRNA possa ser determinada para ambos os lados. Conseqüentemente, o ensaio duplo da régua é serido excepcionalmente para investigar a translocação Ribossoma, e o movimento ácido nucleico geralmente. Nós mostramos resultados representativos que indicaram um conformação em loop do mRNA e resolveram o translocação normal do frameshifting.
Introdução
O deslocamento Biomolecular é um parâmetro fundamental no estudo do mecanismo das funções biológicas relacionadas. Um exemplo particular é o translocação Ribossome1,2, durante que o ribossoma se move por exatamente três nucleotídeos (NT) no RNA do mensageiro (mRNA) normalmente, e por um, dois, ou outros números de NT exceto três no caso de ribossômica. Conseqüentemente, uma definição do único-NT do sistema da régua molecular é exigida para distinguir os tamanhos diferentes da etapa. Um desafio maior é sondar o movimento Ribossome nos lados da entrada e da saída. Em outras palavras, somente com um sistema de ré....
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Protocolo
1. preparação dos complexos ribosalguns
- Fazer 1.000 mL de tampão TAM10, que consiste de 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM mg (OAc)2, 30 mm NH4CL, 70 mm KCl, 5 mM EDTA, 7 mm Bme (2-Mercaptoetanol), e 0, 5% Tween20.
- Prepare as cinco misturas indicadas na tabela 1.
Nota: o Ribossome foi da cepa MRE60011. EF-tu: fator de alongamento termo instável. EF-TS: fator de alongamento Thermo estável. GTP: trifosfato de guanosina. PEP: fosho (enol) piruvato. - Incubar as cinco misturas separadamente a 37 ° c por 25 min antes de fazer os complexos ribosalguns. Prepare os cinco complexos ribosa....
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Resultados
A Figura 1 mostra o esquema de detecção e as fotografias dos componentes principais. A detecção magnética é alcançada por um magnetómetro atômico utilizando o esquema de digitalização (Figura 1a)13. A amostra é colocada sobre uma haste montada em um motor linear. O motor transporta a amostra ao sensor atômico dentro de um escudo magnético, a seguir de volta ao local original para descarregar. O magnetometro atômico detect.......
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Discussão
Em nosso ensaio duplo da régua, os grânulos magnéticos jogam dois papéis essenciais. Primeiro, eles servem como os transdutores de força porque a força centrífuga é proporcional à sua massa flutuante. Em segundo lugar, os grânulos são portadores do sinal detectados por um magnetometer atômico, que seja atualmente o sensor magnético o mais exato. Combinando manipulação mecânica e detecção magnética, a técnica de empresas é capaz de resolver um grande número de interações moleculares com base em suas forças de dissociação .......
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Divulgações
Nenhum conflito de interesse potencial foi relatado por autores.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pelos institutos nacionais de saúde dos EUA (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. reconhece o apoio da Fundação Welch (E-1721).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tira de estireno | Cidade da Indústria | MS-861 | |
| Lâminas de vidro Revestimentos | evaporados | 60,0 &vezes; 4,0 &vezes; 0,3 mm3 | |
| Ácido acético | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropiltrietoxissilano | UCT especialidades | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotina-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Bicarbonato de sódio | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Cola epóxi | Devcon | 31345 | |
| Estreptavidina | ThermoFisher | 434301 | |
| Ácido fusídico | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Sulfato de neomicina | Millipore Sigma | ||
| Sulfato de Viomicina | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Higromicina | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Acetato de magnésio | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Cloreto de amônio | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potássio cloreto | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoetanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Piruvato Quinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sacarose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo Integrated | DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| Tecnologias integradas oligo | do ADN | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5' |
| Tecnologias | de DNA Oligo Integradas | DNA 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5' |
| Tecnologias integradas | oligo do ADN | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5' |
| Tecnologias | de DNA Oligo Integradas | DNA 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5' |
| Tecnologias integradas | de DNA oligo | DNA 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5' |
| DNA Oligo Integrated | DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| Tecnologias | de DNA Oligo Integradas | DNA 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5' |
| Centrífuga | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrífuga | Hitachi | CS150FNX | |
| Misturador de vórtice | VWR | VM-3000 | |
| Amplificador de bloqueio | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Amplificador de bloqueio | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Gerador de função | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Detectores fotográficos | Thorlabs | DET36A |
Referências
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12(2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F.
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Reimpressões e permissões
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