Ensaios de atividade com base em RMN para determinação da inibição de compostos, valores de IC50 , atividade Artifactual e atividade de células inteiras de Ribohidrolases nucleósidos

Resumo

Foram desenvolvidos ensaios de atividade com base em RMN para identificar e caracterizar inibidores de duas enzimas de riboidrolase nucleósidas. Os protocolos são fornecidos para ensaios compostos iniciais em 500 μM e 250 μM, ensaios de dose-resposta para a determinação de valores de IC₅₀ , ensaios de tela de contador de detergente, ensaios de tela de contador de diluição de salto e ensaios em células inteiras de e. coli .

Resumo

A espectroscopia de RMN é freqüentemente utilizada para a identificação e caracterização de inibidores enzimáticos na descoberta de fármacos, particularmente no contexto de triagem de fragmentos. Os ensaios de atividade baseados em RMN são ideais para trabalhar nas concentrações mais elevadas de compostos de teste necessários para detectar esses inibidores mais fracos. A escala dinâmica e a dispersão química do deslocamento em uma experimentação de RMN podem facilmente resolver ressonâncias do substrato, do produto, e dos compostos do teste. Isso contrasta com os ensaios espectrofotométricos, nos quais os problemas de interferência de leitura geralmente surgem de compostos com perfis de absorção UV-VIS sobrepostos. Além, desde que faltam enzimas do repórter, os ensaios da RMN da único-enzima não são propensas aos falsos positivos acoplados-ensaio. Este atributo os torna úteis como ensaios ortogonais, complementando os ensaios tradicionais de triagem de alta taxa de transferência e ensaios de triagem de bancada. Os protocolos detalhados são fornecidos para ensaios compostos iniciais em 500 μM e 250 μM, ensaios de dose-resposta para a determinação de valores de IC₅₀ , ensaios de tela de contador de detergente, ensaios de tela de contador de diluição de salto e ensaios em células inteiras de e. coli . Os métodos são demonstrados usando duas enzimas do ribohydrolase do nucleosídeo. O uso de ¹H NMR é mostrado para a enzima purine-específica, quando ¹⁹F NMR for mostrado para a enzima pyrimidine-específica. Os protocolos são geralmente aplicáveis a qualquer enzima onde as ressonâncias de substrato e produto podem ser observadas e distinguidas por espectroscopia de RMN. Para ser o mais útil no contexto da descoberta de drogas, a concentração final de substrato deve ser não mais do que 2-3x seu valor de K_m . A escolha do experimento de RMN depende da reação enzimática e dos substratos disponíveis, bem como da instrumentação de RMN disponível.

Introdução

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é bem estabelecida para caracterizar e monitorar as reações enzimáticas^1,2. As diferenças nos deslocamentos químicos e nos padrões de acoplamento são usadas para distinguir as ressonâncias do substrato e do produto, e as intensidades de ressonância relativas são usadas para quantificar o percentual de reação. Tanto o consumo de substrato quanto a criação do produto são observados diretamente no espectro de RMN. Isso contrasta com a espectrofotometria ou espectroscopia de fluorescência, na qual o curso de tempo de reação é indicado por uma alteração na abs....

Protocolo

1. ensaios de compostos de teste inicial a 500 μM e 250 μM

1. Prepare substrato e teste composto para reações.
   1. Prepare soluções de substrato (adenosina ou 5-fluorouridina) em água e composto de teste de 50 mM em dimetil sulfóxido (DMSO) deuterado. Consulte a secção de introdução para concentrações de solução de substrato a utilizar.
   2. Adicionar 12 μL de substrato (adenosina ou 5-fluorouridina) a cada um dos quatro tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, 1 – 4.
   3. Adicionar 6 μL de DMSO deuterado a tubos 1 (0 min de controle) e 4 (30 min de controle). Adicionar 6 μL de composto de ensaio ao tubo 2. Adicionar 3 μL de composto de ensaio e 3 μL....

Resultados

A Figura 2 mostra os resultados para testar dois compostos contra agnh usando ¹H NMR após a seção 1. A reação enzimática é mais facilmente observada e quantificada pelo desaparecimento do singlet de adenosina e ressonâncias de gibão em 8,48 ppm e 6, 9 ppm, respectivamente, e o aparecimento de uma ressonância singela de adenina a 8,33 ppm, como observado no controle de 30 min Espectro. Na presença de 500 μM composto 1, nenhum produto é formado como evidenciado pela falta de uma res.......

Discussão

Os protocolos descritos são geralmente aplicáveis a muitas enzimas, desde que os substratos e/ou produtos tenham sinais resolvíveis no espectro de RMN. No entanto, é crítico que a concentração de substrato está perto de seu valor de K_m e alta o suficiente para ser detectado em um experimento de RMN dentro de um prazo razoável. Uma concentração de substrato não superior a 2-3x o valor de K_m é ideal para detectar inibidores competitivos, não competitivos e não competitivos

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AGNH	N / A	interno purificado	TVAG_213720
UNH	N / A	interno purificado	TVAG_092730
Adenosina	Sigma	A9251
5-fluorouridina	Sigma	F5130
Dimetilsulfóxido-D6	Cambridge Isotope Labs	DLM-10-100	D, 99,9%
de fosfato de potássio monobásico	Sigma	P0662
Fosfato de potássio dibásico	Sigma	P3786
Cloreto de potássio	Sigma	P9541
Óxido de deutério	Cambridge Isotope Labs	DLM-4-100	D, 99,9%
de ácido clorídrico	Fisher Chemical	A144212
Triton X-100	Sigma	X100
3-(Trimetilsilil)propiônico-2,2,3,3,-d4 sal de sódio ácido (TSP)	Sigma	269913	D, 98%
2,2,2-Trifluoroetanol-1,1-d2	Sigma		612197 D, 99,5%
Pipeta	Gilson	F123602	PIPETMAN Classic P1000
Pipeta	Gilson	F123601	PIPETMAN Classic P200
Pipeta	Gilson	F123600	PIPETMAN Classic P20
Tubos de microcentrífuga	Fisher Scientific	05-408-129
Tubos cônicos	Corning	352099
Microcentrífuga	Eppendorf	5418
Misturador de vórtice	Fisher Scientific	02215365
Tubos de RMN	Norell	502-7	Ou conforme apropriado para o
espectrômetro de RMN	Bruker	N/ Um	AvanceIII500
Prism	GraphPad	N/A	Versão 5.04