Artigo de método

Ensaios de atividade com base em RMN para determinação da inibição de compostos, valores de IC50 , atividade Artifactual e atividade de células inteiras de Ribohidrolases nucleósidos

DOI:

10.3791/59928

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30 de junho de 2019

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1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Foram desenvolvidos ensaios de atividade com base em RMN para identificar e caracterizar inibidores de duas enzimas de riboidrolase nucleósidas. Os protocolos são fornecidos para ensaios compostos iniciais em 500 μM e 250 μM, ensaios de dose-resposta para a determinação de valores de IC50 , ensaios de tela de contador de detergente, ensaios de tela de contador de diluição de salto e ensaios em células inteiras de e. coli .

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A espectroscopia de RMN é freqüentemente utilizada para a identificação e caracterização de inibidores enzimáticos na descoberta de fármacos, particularmente no contexto de triagem de fragmentos. Os ensaios de atividade baseados em RMN são ideais para trabalhar nas concentrações mais elevadas de compostos de teste necessários para detectar esses inibidores mais fracos. A escala dinâmica e a dispersão química do deslocamento em uma experimentação de RMN podem facilmente resolver ressonâncias do substrato, do produto, e dos compostos do teste. Isso contrasta com os ensaios espectrofotométricos, nos quais os problemas de interferência de leitura geralmente surgem de compostos com perfis de absorção UV-VIS sobrepostos. Além, desde que faltam enzimas do repórter, os ensaios da RMN da único-enzima não são propensas aos falsos positivos acoplados-ensaio. Este atributo os torna úteis como ensaios ortogonais, complementando os ensaios tradicionais de triagem de alta taxa de transferência e ensaios de triagem de bancada. Os protocolos detalhados são fornecidos para ensaios compostos iniciais em 500 μM e 250 μM, ensaios de dose-resposta para a determinação de valores de IC50 , ensaios de tela de contador de detergente, ensaios de tela de contador de diluição de salto e ensaios em células inteiras de e. coli . Os métodos são demonstrados usando duas enzimas do ribohydrolase do nucleosídeo. O uso de 1H NMR é mostrado para a enzima purine-específica, quando 19F NMR for mostrado para a enzima pyrimidine-específica. Os protocolos são geralmente aplicáveis a qualquer enzima onde as ressonâncias de substrato e produto podem ser observadas e distinguidas por espectroscopia de RMN. Para ser o mais útil no contexto da descoberta de drogas, a concentração final de substrato deve ser não mais do que 2-3x seu valor de Km . A escolha do experimento de RMN depende da reação enzimática e dos substratos disponíveis, bem como da instrumentação de RMN disponível.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é bem estabelecida para caracterizar e monitorar as reações enzimáticas1,2. As diferenças nos deslocamentos químicos e nos padrões de acoplamento são usadas para distinguir as ressonâncias do substrato e do produto, e as intensidades de ressonância relativas são usadas para quantificar o percentual de reação. Tanto o consumo de substrato quanto a criação do produto são observados diretamente no espectro de RMN. Isso contrasta com a espectrofotometria ou espectroscopia de fluorescência, na qual o curso de tempo de reação é indicado por uma alteração na absorvência atribuível a algumas espécies químicas que estão sendo consumidas ou criadas. Assim como com os outros métodos, RMN pode ser usado para estudar as reações enzimáticas em função da temperatura, pH, ou outras condições da solução, e os efeitos dos inibidores podem ser determinados.

Mais recentemente, foram demonstrados os ensaios de atividade enzimática baseada em RMN para a triagem de fragmentos3,4. Os ensaios baseados em RMN são ideais para trabalhar nas concentrações mais elevadas de compostos de ensaio (frequentemente tão elevados como 1 mM) necessários para detectar estes inibidores mais fracos. A escala dinâmica e a dispersão química do deslocamento na experimentação de RMN podem facilmente resolver ressonâncias do substrato, do produto, e dos compostos do teste. Isto compara favoràvel aos ensaios espectrofotométricos onde os problemas da interferência da leitura-para fora levantam-se frequentemente dos compostos com perfis de absorção UV-VIS de sobreposição. Além, desde que faltam enzimas do repórter, os ensaios da RMN da único-enzima não são propensas aos falsos positivos acoplados-ensaio. Essa vantagem os torna úteis como ensaios ortogonais, complementando os ensaios tradicionais de triagem de alta produtividade e os ensaios de triagens de bancada5.

Em nosso laboratório de pesquisa, os ensaios de atividade baseados em RMN são usados para identificar e avaliar os inibidores de Trichomonas vaginalis nucleosídeo ribohydrolases. O parasita T. vaginalis causa a doença sexualmente transmissível não viral mais prevalente6. Aumentar a resistência às terapias existentes7 está conduzindo a necessidade para tratamentos novos, mecanismo-baseados, com as enzimas essenciais do caminho do salvamento do nucleosídeo que representam alvos principais8. Foram desenvolvidos ensaios de atividade baseados em RMN para as enzimas pirimidina e Purina específicas, a ribohydrolase do nucleosídeo uridina (UNH)9e a adenosina/guanosina preferindo a ribohidlase nucleosídeo (agnh)10. As reações catalisadas por estas duas enzimas são mostradas na Figura 1. Os ensaios de RMN estão sendo usados para fazer a tela de bibliotecas de fragmentos para pontos de partida químicos, determinar os valores de IC50 e eliminar inibidores de ligação com base em agregação ou covalentes11. Os mesmos ensaios também estão sendo traduzidos para avaliar a atividade enzimática em células inteiras12.

Os protocolos detalhados são fornecidos para ensaios compostos iniciais em 500 μM e 250 μM, ensaios de dose-resposta para a determinação de valores de IC50 , ensaios de tela de contador de detergente, ensaios de tela de contador de diluição de salto e ensaios em células inteiras de e. coli . Os protocolos são geralmente aplicáveis a qualquer enzima em que as ressonâncias de substrato e produto podem ser observadas e distinguidas pela espectroscopia de RMN. Três suposições foram feitas para a simplicidade. Primeiro, o substrato não é especificado. Para que os ensaios de atividade baseados em RMN sejam úteis, a concentração final do substrato deve ser não superior a 2-3x o valor de Km 4. Nos exemplos mostrados, as concentrações finais de adenosina e 5-fluorouridina são 100 μM (km = 54 μM) e 50 μm (km = 15 μm), respectivamente. Nos protocolos, atingir estas concentrações corresponde a 12 μL de 5 mM de adenosina ou 12 μL de 2,5 mM 5-fluorouridina.

Em segundo lugar, a quantidade de enzima prevista nos protocolos, 5 μL, foi escolhida para corresponder à quantidade necessária para resultar em aproximadamente 75% de conversão do substrato para o produto em 30 min. Esta quantidade representa tipicamente uma grande diluição de um estoque purified da enzima, e a diluição deve ser determinada adiantado para cada enzima. As soluções de estoque de enzimas purificadas AGNH e UNH são armazenadas em-80 ° c em alíquotas que fornecem enzima suficiente para várias milhares de reações. Assim, o fator de diluição idealmente só precisa ser determinado ou validado a cada poucos meses. Em terceiro lugar, o experimento NMR 1D específico não é especificado. Nos resultados representativos, 1H NMR é mostrado para agnh10 e 19F NMR é mostrado para unh9, com o experimento de RMN descrito nas referências correspondentes. A escolha do experimento de RMN depende da reação enzimática e dos substratos disponíveis, bem como da instrumentação de RMN disponível. Por fim, deve-se salientar que a abordagem experimental descrita não adere às rigorosas exigências da RMN quantitativa (qnmr)13,14. No protocolo, uma reação percentual é determinada usando as alterações relativas na intensidade da mesma ressonância em cada espectro, em vez de determinar concentrações absolutas. Essa abordagem elimina a necessidade de aquisição de dados e modificações de processamento, bem como padrões internos ou externos, que são necessários para qNMR.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ensaios de compostos de teste inicial a 500 μM e 250 μM

  1. Prepare substrato e teste composto para reações.
    1. Prepare soluções de substrato (adenosina ou 5-fluorouridina) em água e composto de teste de 50 mM em dimetil sulfóxido (DMSO) deuterado. Consulte a secção de introdução para concentrações de solução de substrato a utilizar.
    2. Adicionar 12 μL de substrato (adenosina ou 5-fluorouridina) a cada um dos quatro tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, 1 – 4.
    3. Adicionar 6 μL de DMSO deuterado a tubos 1 (0 min de controle) e 4 (30 min de controle). Adicionar 6 μL de composto de ensaio ao tubo 2. Adicionar 3 μL de composto de ensaio e 3 μL de DMSO deuterado ao tubo 3.
  2. Prepare solução de estoque de reação suficiente.
    Nota: a solução de stock é para cinco reacções que contêm 517 μL de tampão, 60 μL de óxido de deutério e 5 μL de solução enzimática (AGNH ou UNH). Consulte a secção de introdução para concentrações de solução enzimática a utilizar.
    1. Adicionar 2,59 mL de tampão de reacção (fosfato de potássio de 50 mM, 0,3 M KCl, pH 6,5) a um tubo cônico de 15 mL. Adicionar 300 μL de óxido de deutério ao tubo cônico. Adicionar 25 μL de solução enzimática (AGNH ou UNH) ao cônica.
    2. Inverta suavemente o tubo cônico duas vezes para misturar.
  3. Simultaneamente iniciar e saciar a 0 min reação de controle. Transfira 582 μl da solução do stock de reacção para um tubo de microcentrífuga limpo. Adicionar 10 μL de 1,5 M HCL a este tubo de microcentrífuga. Transfira os 592 μl combinados para o tubo de microcentrífuga 1. Aspirar e dispensar a amostra duas vezes de forma lenta, mas deliberada.
  4. Iniciar e executar as três reações restantes em forma escalonada. No tempo 0 minuto, transfira 582 μl da solução do estoque da reação ao tubo 2 do microcentrífuga. Aspirar e dispensar a amostra duas vezes de forma lenta, mas deliberada. Repita em intervalos de 30 s para os tubos de microcentrífuga 3 e 4. Aguarde 30 min.
  5. Saciar as reações. No tempo 30 min, adicionar 10 μL de 1,5 M HCL para microcentrífuga 2. Repita em intervalos de 30 s para os tubos de microcentrífuga 3 e 4. Transferir 600 μl de solução de cada microcentrífuga para tubos RMN.
  6. Adquira um espectro de RMN 1D em cada amostra. Processe os dados para garantir a correta faseamento e as linhas de base planas.
  7. Calcule a conversão percentual de substrato para espectros de controle.
    1. Sobrepor os espectros para 0 min e 30 min controles. Dimensione o sinal do substrato no controle de 0 min para coincidir com o controle de 30 min. Observe essa porcentagem.
    2. Calcule a conversão percentual como (100 – percentual determinado na etapa 1.7.1).
  8. Calcule a conversão percentual de substrato para reações contendo composto de teste.
    1. Espectros de sobreposição para o controle de 0 min e primeira reação contendo o composto de teste de 500 μM. Dimensione o sinal do substrato no controle 0 min para corresponder ao espectro com o composto de teste. Observe essa porcentagem. Calcule a conversão percentual como (100 – percentual determinado).
    2. Repita para a segunda reacção que contém o composto de teste de 250 μM.
  9. Calcule a porcentagem de reação e a porcentagem de inibição para cada concentração de compostos de teste.
    1. Calcule a reação percentual como (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. Calcule a porcentagem de inibição como (100 – percentual determinado na etapa 1.9.1).

2. determinação dos valores de IC50

  1. Prepare substrato e teste composto para reações.
    1. Prepare soluções de substrato (adenosina ou 5-fluorouridina) em água e composto de teste de 10 mM em DMSO deuterado. Consulte a secção de introdução para concentrações de solução de substrato a utilizar.
  2. Prepare diluições seriais de composto de teste de 10 mM (em DMSO deuterado).
    1. Adicionar 36 μL de DMSO deuterado a cinco tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, 1 – 5.
    2. Adicione 12 μL de composto de teste de 10 mM ao tubo 1 e toque levemente para misturar. O composto do teste é agora 2,5 milímetros.
    3. Transfira 12 μL do tubo 1 para o tubo 2 e toque levemente para misturar. O composto do teste é agora 0,63 milímetros. Transfira 12 μL do tubo 2 para o tubo 3 e toque levemente para misturar. O composto do teste é agora 0,16 milímetros. Transfira 12 μL do tubo 3 para o tubo 4 e toque levemente para misturar. O composto do teste é agora 0, 4 milímetros. Transfira 12 μL do tubo 4 para o tubo 5 e toque levemente para misturar. O composto do teste é agora 0, 1 milímetros.
  3. Prepare 14 tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para reações.
    1. Adicionar 12 μL de substrato (adenosina ou 5-fluorouridina) a cada um dos 14 tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, 1-14.
    2. Adicionar 12 μL de DMSO deuterado a tubos 1 (0 min de controle) e 14 (30 min de controle).
    3. Adicionar 12 μL de composto de teste de 10 mM aos tubos 2 e 3. Adicionar 12 μL de composto de teste de 2,5 mM aos tubos 4 e 5. Adicionar 12 μL de composto de teste de 0,63 mM aos tubos 6 e 7. Adicionar 12 μL de composto de teste de 0,16 mM aos tubos 8 e 9. Adicionar 12 μL de composto de teste de 0, 4 mM aos tubos 10 e 11. Adicionar 12 μL de composto de teste de 0, 1 mM aos tubos 12 e 13.
  4. Prepare uma solução de estoque de reação suficiente para executar 15 reações que contenham 511 μL de tampão, 60 μL de óxido de deutério e 5 μL de solução enzimática (AGNH ou UNH) cada. Consulte a secção de introdução para concentrações de solução enzimática a utilizar.
    1. Adicionar 7,67 mL de tampão de reacção (fosfato de potássio de 50 mM, 0,3 M KCl, pH = 6,5) a um tubo cônico de 15 mL. Adicionar 900 μL de óxido de deutério ao tubo cônico. Adicionar 75 μL de solução enzimática (AGNH ou UNH) ao cônica.
    2. Inverta suavemente o tubo cônico 2x para misturar.
  5. Siga as etapas descritas nas etapas 1.3 – 1.9 para (usando 576 μL de solução de estoque de reação) para determinar a reação percentual para cada concentração de compostos de teste.
  6. Calcule o valor IC50 usando o GraphPad Prism.
    1. Criar uma tabela de dados correlacionando o log de concentrações de compostos de teste de reação (200 μM, 50 μM, 12,5 μM, 3,13 μM, 0,78 μM, 0,20 μM) com porcentagem de reação (dois valores cada).
    2. Use um ajuste de curva não linear para determinar o valor de IC50 e o erro padrão.

3. ensaios de tela de contador de detergente em 100 μM e 50 μM

  1. Prepare substrato e teste composto para reações.
    1. Prepare soluções de substrato (adenosina ou 5-fluorouridina) em água e composto de teste de 10 mM em DMSO deuterado. Consulte a secção de introdução para concentrações de solução de substrato a utilizar.
    2. Adicionar 12 μL de substrato (adenosina ou 5-fluorouridina) a cada um dos oito tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, 1 – 8.
    3. Adicionar 6 μL de DMSO deuterado aos tubos 1 e 5 (0 min controles) e 4 e 8 (30 min controles). Adicionar 6 μL de composto de ensaio aos tubos 2 e 6. Adicionar 3 μL de composto de ensaio e 3 μL de DMSO deuterado aos tubos 3 e 7.
  2. Prepare solução de estoque de reação suficiente sem detergente para executar cinco reações que contenham 517 μL de tampão, 60 μL de óxido de deutério e 5 μL de solução enzimática (AGNH ou UNH) cada. Consulte a secção de introdução para concentrações de solução enzimática a utilizar.
    1. Adicionar 2,59 mL de tampão de reacção (fosfato de potássio de 50 mM, 0,3 M KCl, pH = 6,5) a um tubo cônico de 15 mL. Adicionar 300 μL de óxido de deutério ao tubo cônico. Adicionar 25 μL de solução enzimática (AGNH ou UNH) ao cônica.
    2. Inverta suavemente o tubo cônico 2x para misturar.
  3. Prepare solução de estoque de reação suficiente com 0, 1% v/v Triton X-100 detergente para executar cinco reações que contêm 517 μL de tampão, 60 μL de óxido de deutério, e 5 μL de solução enzimática (AGNH ou UNH) cada.
    1. Adicionar 2 μL de detergente Triton X-100 a 20 mL de tampão de reacção (fosfato de potássio 50 mM, 0,3 M KCl, pH = 6,5). As soluções detergentes devem ser usadas no prazo de 1 dia.
    2. Adicionar 2,59 mL de tampão de reacção contendo 0, 1% de detergente Triton X-100 a um tubo cônico de 15 mL. Adicionar 300 μL de óxido de deutério ao tubo cônico. Adicionar 25 μL de solução enzimática (AGNH ou UNH) ao cônica.
    3. Inverta suavemente o tubo cônico 2x para misturar.
  4. Para tubos 1 – 4, usando a solução de estoque de reação sem detergente, siga as etapas descritas nas etapas 1.3 – 1.9 para determinar a porcentagem de inibição para cada concentração de compostos de teste.
  5. Para tubos 5 – 8, usando a solução de estoque de reação com 0, 1% v/v Triton X-100 detergente, siga os passos descritos nas etapas 1.3 – 1.9 para determinar a porcentagem de inibição para cada concentração de compostos de teste.

4. ensaios da tela contrária da saltar-diluição

  1. Prepare o substrato e os compostos de teste para reações
    1. Prepare soluções de substrato (adenosina ou 5-fluorouridina) em água e composto de teste de 10 mM em DMSO deuterado. Consulte a secção de introdução para concentrações de solução de substrato a utilizar.
    2. Adicionar 53,8 μL de tampão de reacção (fosfato de potássio de 50 mm, 0,3 M KCl, pH = 6,5) a dois tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (cada), 1 e 2. Adicionar 5 μL de enzima (AGNH ou UNH) aos tubos 1 e 2.
    3. Adicionar 511 μL de tampão de reacção a dois tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, 3 e 4 (cada). Adicionar 60 μL de óxido de deutério aos tubos 3 e 4. Adicionar 5 μL de enzima (AGNH ou UNH) aos tubos 3 e 4.
    4. Adicionar 1,2 μL de DMSO deuterado ao tubo 1 (30 min de controlo). Adicionar 1,2 μL de composto de ensaio ao tubo 2. Adicionar 12 μL de DMSO deuterado ao tubo 3 (30 min de controlo). Adicionar 12 μL de composto de ensaio ao tubo 4. Incubar por 30 min.
  2. Prepare dois tubos de microcentrífuga de 1,5 ml com solução de diluição.
    1. Adicionar 468 μL de tampão de reacção a cada um dos dois tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, 5 e 6. Adicionar 60 μL de óxido de deutério a cada tubo (5 e 6).
  3. Prepare quatro tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para as reações.
    1. Adicionar 12 μL de substrato (adenosina ou 5-fluorouridina) a cada um dos quatro tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, 7 – 10.
  4. Realize o salto-diluições e inicie as reações.
    1. Transferir 528 μL de solução do tubo 5 para o tubo 1. Aspirar e dispensar a amostra duas vezes de forma lenta, mas deliberada. Transferir 528 μL de solução do tubo 6 para o tubo 2. Aspirar e dispensar a amostra duas vezes de forma lenta, mas deliberada.
    2. No tempo 0 min, transfira 588 μL de solução do tubo 1 para o tubo 7. Aspirar e dispensar a amostra 2x de forma lenta, mas deliberada. A intervalos de 30 s, transfira 588 μL de solução do tubo 2 para o tubo 8, tubo 3 para o tubo 9 e tubo 4 para tubo 10. Aspirar e dispensar a amostra duas vezes de forma lenta, mas deliberada. Aguarde 30 min.
  5. Para os tubos 7 – 10, siga as etapas descritas nas etapas 1.5 – 1.9 para determinar a porcentagem de inibição para cada concentração de compostos de teste.

5. ensaios compostos em células inteiras de E. coli

  1. Prepare 10 mL de cultura durante a noite de E. coli no dia anterior experimentos.
  2. Prepare células de E. coli para experimentos de RMN.
    1. Centrifugue as células em alíquotas de 1 mL por 10 min a 15.000 x g.
    2. Descartar o sobrenadante e ressuscitará cada alíquota de células em 1 mL de tampão de reação (fosfato de potássio 50 mM, 0,3 M KCl, pH = 6,5) por vortexing.
  3. Siga as secções 1 ou 2 para o ensaio pretendido com as seguintes alterações:
    1. Substitua 280 μL de tampão na solução do stock de reacção com 280 μL de células ressuspender.
    2. Substitua 5 μL de enzima (AGNH ou UNH) na solução do stock de reacção com 5 μL de tampão.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A Figura 2 mostra os resultados para testar dois compostos contra agnh usando 1H NMR após a seção 1. A reação enzimática é mais facilmente observada e quantificada pelo desaparecimento do singlet de adenosina e ressonâncias de gibão em 8,48 ppm e 6, 9 ppm, respectivamente, e o aparecimento de uma ressonância singela de adenina a 8,33 ppm, como observado no controle de 30 min Espectro. Na presença de 500 μM composto 1, nenhum produto é formado como evidenciado pela falta de uma res...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os protocolos descritos são geralmente aplicáveis a muitas enzimas, desde que os substratos e/ou produtos tenham sinais resolvíveis no espectro de RMN. No entanto, é crítico que a concentração de substrato está perto de seu valor de Km e alta o suficiente para ser detectado em um experimento de RMN dentro de um prazo razoável. Uma concentração de substrato não superior a 2-3x o valor de Km é ideal para detectar inibidores competitivos, não competitivos e não competitivos

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Dr. Dean Brown por fornecer compostos da biblioteca de fragmentos AstraZeneca e do Dr. David Parkin para fornecer as enzimas AGNH e UNH. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas dos institutos nacionais de saúde o prêmio número R15AI128585 a B. J. S. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde. a Research também foi apoiada por um Horace G. McDonell Summer Research Fellowship concedida a S. N. M., uma família Landesberg Bolsa concedida a J. A. G., e bolsas de desenvolvimento do corpo docente e prêmio de pesquisa Frederick Bettelheim da Universidade Adelphi para B. J. S.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AGNHN / Ainterno purificadoTVAG_213720
UNHN / Ainterno purificadoTVAG_092730
AdenosinaSigmaA9251
5-fluorouridinaSigmaF5130
Dimetilsulfóxido-D6Cambridge Isotope LabsDLM-10-100D, 99,9%
de fosfato de potássio monobásicoSigmaP0662
Fosfato de potássio dibásicoSigmaP3786
Cloreto de potássioSigmaP9541
Óxido de deutérioCambridge Isotope LabsDLM-4-100D, 99,9%
de ácido clorídricoFisher ChemicalA144212
Triton X-100SigmaX100
3-(Trimetilsilil)propiônico-2,2,3,3,-d4 sal de sódio ácido (TSP)Sigma269913D, 98%
2,2,2-Trifluoroetanol-1,1-d2Sigma612197 D, 99,5%
PipetaGilsonF123602PIPETMAN Classic P1000
PipetaGilsonF123601PIPETMAN Classic P200
PipetaGilsonF123600PIPETMAN Classic P20
Tubos de microcentrífugaFisher Scientific05-408-129
Tubos cônicosCorning352099
MicrocentrífugaEppendorf5418
Misturador de vórticeFisher Scientific02215365
Tubos de RMNNorell502-7Ou conforme apropriado para o
espectrômetro de RMNBrukerN/ UmAvanceIII500
PrismGraphPadN/AVersão 5.04
software

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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