Medição da proliferação de células musculares vasculares lisas usando química clique

Resumo

A proliferação é uma parte crítica da função celular, e uma leitura comum usada para avaliar a toxicidade potencial de novos medicamentos. A medição da proliferação é, portanto, um ensaio freqüentemente usado na biologia celular. Aqui apresentamos um método simples e versátil de medição da proliferação que pode ser usado em células aderentes e não aderentes.

Resumo

A capacidade de uma célula para proliferar é parte integrante da função normal da maioria das células, e a desregulação da proliferação está no coração de muitos processos de doença. Por estas razões, medir a proliferação é uma ferramenta comum usada para avaliar a função celular. A proliferação celular pode ser medida simplesmente pela contagem; no entanto, este é um meio indireto de medir a proliferação. Um meio comum de detectar diretamente as células se preparando para dividir é a incorporação de análogos nucleosídeos rotulados. Estes incluem o análogo radioradioativo do nucleosídeo ³H-thymidine mais análogos não radioativos do nucleosside tais como o deoxyuridine de 5 bromo-2' (BrdU) e 5-etilnyl-2′-deoxyuridine (EdU). A incorporação da EdU é detectada pela química do clique, que tem várias vantagens quando comparada à BrdU. Neste relatório, fornecemos um protocolo para medir a proliferação pela incorporação da EdU. Este protocolo inclui opções para várias leituras, juntamente com as vantagens e desvantagens de cada um. Também discutimos locais onde o protocolo pode ser otimizado ou alterado para atender às necessidades específicas do experimento planejado. Finalmente, tocamos nas maneiras que este protocolo básico pode ser modificado para medir outros metabólitos celulares.

Introdução

A proliferação é uma parte crítica da função celular^1,2. O controle da proliferação influencia processos normais, como desenvolvimento e processos patológicos, como câncer e doenças cardiovasculares. Acredita-se que o crescimento hiperplástico das células musculares lisas vasculares, por exemplo, seja um precursor da aterosclerose^3. Mudanças na proliferação celular também são usadas para avaliar a toxicidade potencial de novos medicamentos. Dado o seu impacto generalizado, medir a proliferação é um pilar de muitos laboratórios baseados em biologia celular.

A ....

Protocolo

1. Detecção de EdU usando rótulo fluorescente

1. Soluções de ações
   1. Prepare uma solução de ações edu de 5 mM adicionando 12,5 mg de EdU a 10 mL de H₂O destilado duplo.
   2. Prepare os componentes da solução de rotulagem: 200 mM tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) (100 mg em 1,15 mL H₂O), 100 mM CuSO₄ (15,95 mg em 1 mL H₂O; fazer fresco), 10 mM Cy3 picolyl-azide (1 mg em 95,3 m HL 2 Ol₂Ozi2 , armazenados em 5 μL alíquotas a -20 °C) e 1 M de ascorbate de sódio (200 mg em 1 mL H₂O; faça fresco).
   3. Prepare a solução de ações resazurina a uma concentração de 0,15 m....

Resultados

Na Figura 2,demonstramos os resultados de três experimentos diferentes que medem a proliferação do VSMC em resposta ao PDGF. Depois de cultivar as células em meios de comunicação formulados para SMCs, realizamos o experimento em DMEM livre de soro, para eliminar quaisquer efeitos potenciais do soro ou fatores de crescimento na proliferação. Na Figura 2A comparamos os resultados, do mesmo experimento, usando uma leitura fluorescente vs luminescente. Para ler essa.......

Discussão

A incorporação da UEd é uma forma simples e direta de medir a proliferação celular; é particularmente útil para as células aderentes¹³. Nosso protocolo usa células musculares lisas, mas é aplicável a qualquer célula aderente (epiteliais, endoteliais, etc.). Embora o protocolo não seja complicado, o único passo crítico é fazer a solução de rotulagem - os ingredientes devem ser adicionados na ordem listada. Além disso, como as manchas ocidentais quimiiluminescentes, se usar a leitura de luminescênci.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5-Etinil-2'-desoxiuridina	Carbosynth	NE08701
biotina picolyl azida	Click Chemistry Tools	1167-5
CuSO4	Fisher Scientific	C1297-100G
Cy3 picolyl azide	Click Chemistry Tools	1178-1
Cytation Plate Reader	Biotek
EVOS Microscópio	Thermo Fisher Scientific
	Sigma-Aldrich	216763
Na ascorbato	Sigma-Aldrich	11140-250G
NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes	Invitrogen	R37606	DAPI mancha nuclear
Odyssey Blocking Buffer	Li-Cor	927-40000	buffer
de bloqueioServiços de	Microscopia Eletrônica	15710
PBS	Fisher Scientific	SH3002802
Cloreto de Sódio	Sigma Life Science	S3014-5kg
Streptavidin Hardradish Peroxidase Conjugado	Life Technologies	S911
Super Signal ELISA Femto	Thermo Scientific	PI137075	substrato ELISA
Leitor de Placas Synergy	de Clique THPTA da Biotek
		1010-100
Tris Hidroximetil Aminometano Cloridrato (Tris-HCl)	Fisher Scientific	BP153-500
Triton X 100	Bio-Rad	1610407
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100

Solução de peróxido de hidrogênio de Paraformaldeído Ferramentas de Química