Cloroplastos são os organelos que definem as plantas1. Junto com muitas outras funções metabólicas, de desenvolvimento e sinalização, os cloroplastos são responsáveis pela fotossíntese – o processo pelo qual a energia da luz solar é aproveitada para alimentar as atividades celulares da vida. Consequentemente, os cloroplastos são essenciais, não apenas para as plantas, mas também para a miríade de ecossistemas que dependem das plantas e para a agricultura. Os cloroplastos são compostos por milhares de proteínas diferentes, a maioria das quais é codificada no núcleo e importada do citosol antes de ser direcionada internamente para um dos vários compartimentos intraorganelaresclaramente distintos 1. Para alcançar uma compreensão mais completa do desenvolvimento e das funções dos cloroplastos, e para possibilitar estratégias biotecnológicas envolvendo manipulação de cloroplastos que enfrentem desafios globais ligados à segurança alimentar ou à bioenergia, será essencial determinar o direcionamento, localização e interações de proteínas importantes dos cloroplastos. Esta coleção de métodos descreve um conjunto de técnicas criticamente importantes e complementares que podem ser usadas para alcançar esses objetivos. A coleção foca principalmente na planta modelo amplamente utilizada Arabidopsis thaliana (agrião thale), mas os métodos também podem ser adaptados e aplicados a outros organismos.
A coleção inclui descrições de duas técnicas diferentes para analisar a importação de proteínas codificadas pelo núcleo em cloroplastos através do envelope de membrana dupla. O artigo de Ling eJarvis 2 descreve um método in vitro no qual cloroplastos isolados são incubados com uma proteína precursora marcada radioativamente. A extensão em que os cloroplastos absorvem a proteína precursora é determinada pelo monitoramento da mudança de tamanho da proteína que ocorre como resultado da clivagem do peptídeo de trânsito (sequência líder direcionada), usando SDS-PAGE e imagem de fósforo. O método apresentado é um desenvolvimento de uma abordagem que tem sido usada para estudar a importação de proteínas de cloroplastos in vitro por várias décadas 3,4, e incorpora etapas adicionais que permitem avaliar a resposta da maquinaria de importação às condições de estresse enfrentadas pelaplanta 5. Por outro lado, o artigo de Lee et al.6 descreve um método in vivo baseado na expressão transitória de uma proteína precursora quimérica, portadora de um domínio proteico fluorescente, em células intactas (protoplastos). Neste ensaio, a extensão da importação de proteínas de cloroplastos pode ser acompanhada de duas maneiras diferentes: monitorando a localização e intensidade do sinal de fluorescência usando microscopia de fluorescência; e, analisando a mudança de tamanho da proteína que ocorre como resultado da clivagem peptídico usando imunoblot. Esses dois métodos são altamente complementares e podem entregar resultados convincentes quando usados juntos emparalelo 5.
Uma vez que uma proteína é importada através do envelope para dentro do cloroplasto, e seu peptídeo de trânsito é removido, ela pode assumir sua conformação final no estroma (o principal compartimento aquoso interno do orgânino) ou ativar uma das várias vias internas deseparação 1. Como local dos complexos fotossintéticos altamente abundantes, as membranas tilacoides são um destino importante para esse tipo de separação interna; Na verdade, o direcionamento da proteína tilacoide envolve múltiplas vias mecanicamente distintas. O artigo de Asher et al.7 descreve uma série de métodos in vitro que permitem estudar diferentes vias de translocação de proteínas tilacoides. Esses métodos envolvem a incubação de tilacoides isolados com proteína precursora marcada radioativamente e, em alguns casos, um extrato estromal concentrado. A extensão em que a proteína é absorvida pelos tilacoides é monitorada avaliando a clivagem do sinal de direcionamento e a proteção da proteína contra a termolisina protease aplicada exogenamente, usando SDS-PAGE e imagem de fósforo. Claro, os tilacoides não são o único subcompartimento do cloroplasto, e muitas vezes é desejável ter a capacidade de avaliar outros compartimentos também. Nesse sentido, o artigo de Bouchnak et al.8 é particularmente importante, pois descreve métodos para a subfracionação de cloroplastos para produzir amostras altamente puras correspondentes às membranas do envelope, ao estroma e aos tilacoides. Uma vez preparadas, essas frações podem ser analisadas por imunoblotting e/ou espectrometria de massa, a fim de fornecer uma grande quantidade de informações sobre a localização suborganela das proteínas doscloroplastos 9.
No que diz respeito à análise de interações proteína-proteína e assemblagens de complexos multiproteicos, duas metodologias diferentes são descritas na coleção. O artigo de Shanmugabalaji et al.10 apresenta um método para a purificação de afinidade de complexos multiproteicos de cloroplastos. Essa técnica envolve a análise de plantas transgênicas que expressam um componente do complexo de interesse que foi projetado para carregar uma etiqueta de afinidade (a chamada tag de purificação de afinidade em tandem, ou tag TAP). A capacidade dessa etiqueta de se ligar fortemente a uma matriz que, de outra forma, inerte é explorada como parte da estratégia de purificação. O método apresentado foca especificamente na purificação da maquinaria de importação de proteínas de cloroplastos (que compreende complexos multiproteicos chamados TOC e TIC embutidos nas membranasdo envelope 1), mas, em princípio, pode ser adaptado para estudar qualquer uma das outras assemblagens multiproteicas existentes noscloroplastos 11. O artigo de Rantala et al.12 descreve uma abordagem complementar para caracterização complexa baseada em eletroforese sob condições nativas. A técnica, conforme apresentada aqui, envolve a libertação de complexos fotossintéticos de tilacoides purificados usando detergente suave e não iônico, seguida de sua separação usando blue native (BN)-PAGE. A resolução primária dos complexos pode ser seguida por uma segunda dimensão de eletroforese sob condições de desnaturação, o que permite a visualização dos componentes individuais de cada complexo identificados na primeira dimensão. Assim como no método TAP, essa abordagem nativa PAGE pode ser adaptada com sucesso para estudar outros complexos proteicos dentro doorganelo 13,14. Com qualquer uma das abordagens, os complexos purificados podem ser analisados de várias maneiras, incluindo imunoblotting e espectrometria de massas.
Juntos, os artigos incluídos nesta coleção de métodos apresentam um conjunto poderoso de técnicas complementares que, em conjunto com os recursosexistentes 15,16, podem ser empregadas para melhorar significativamente nossa compreensão de diversos aspectos da biogênese e função dos cloroplastos, especialmente aqueles intimamente ligados ao proteoma organelar. Como os cloroplastos são responsáveis pela maior parte da produção primária fotossintética terrestre e, além disso, desempenham papéis vitais nas respostas das plantas ao meio ambiente (incluindo estresses bióticos e abióticos), esses organelos notáveis inevitavelmente permanecerão um foco importante de pesquisa fundamental e aplicada em todo o mundo por muitos anos.