Um ensaio robusto baseado em reação em cadeia da polimerase para quantificar repetições de trinucleotídeo de citosina-guanina-guanina em X frágil retardo mental-1 gene

Huilin Wang; Xiaofan Zhu; Baoheng Gui; Wan  Chee Cheung; Mengmeng Shi; Zhenjun Yang; Ka Yin Kwok; Ricky Lim; Sanna Pietilä; Yuanfang Zhu; Kwong Wai Choy

doi:10.3791/59963

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Artigo de método

Um ensaio robusto baseado em reação em cadeia da polimerase para quantificar repetições de trinucleotídeo de citosina-guanina-guanina em X frágil retardo mental-1 gene

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DOI:

10.3791/59963

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16 de setembro de 2019

Huilin Wang^*¹ , Xiaofan Zhu^*²^,³ , Baoheng Gui^*³^,⁴ , Wan Chee Cheung² , Mengmeng Shi²^,³ , Zhenjun Yang²^,³ , Ka Yin Kwok² , Ricky Lim⁵ , Sanna Pietilä⁵ , Yuanfang Zhu⁶^,⁷ , Kwong Wai Choy²^,³

¹Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, ²Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, ³Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, ⁴Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, ⁵PerkinElmer Diagnostics, ⁶Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, ⁷Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Um ensaio exato e robusto da reacção em cadeia do polymerase para quantificar repetições do trinucleotide da citosina-guanina-guanina no frágil X retardo mental-1 gene facilita o diagnóstico molecular e a seleção da síndrome frágil de X e do X-relacionado frágil distúrbios com tempo de virada mais curto e investimento em equipamentos.

Resumo

A síndrome de X frágil (FXS) e as desordens associadas são causadas pela expansão da repetição do trinucleotide da citosina-guanina-guanina (CGG) na região 5 ' Untranslated (UTR) do promotor do gene do retardo mental X-1 (FMR1) frágil. Convencionalmente, a análise capilar do fragmento da electroforese em um analisador genético é usada para o dimensionamento das repetições de CGG de FMR1, mas a análise adicional do Sul do Borrão é exigida para a medida exata quando o número da repetição é mais elevado do que 200. Aqui, nós apresentamos um método exato e robusto da reacção em cadeia do polymerase (PCR)-baseado para a quantificação das repetições de CGG de FMR1. A primeira etapa deste teste é a amplificação do PCR das seqüências da repetição no 5 ' UTR do promotor FMR1 usando um jogo frágil do PCR de X, seguido pela purificação dos produtos do PCR e do fragmento que cola em um instrumento capilar microfluídicos da electroforese, e interpretação subseqüente do número de repetições CGG referenciando padrões com repetições conhecidas usando o software de análise. Este ensaio PCR-baseado é reprodutível e capaz de identificar a série completa de repetições de CGG de FMR1 promotores, incluindo aqueles com um número da repetição de mais de 200 (classific como a mutação cheia), 55 a 200 (premutação), 46 a 54 (intermediário), e 10 a 45 (normal). É um método rentável que facilita a classificação do FXS e de desordens X-associadas frágeis com robustez e tempo de relatório rápido.

Introdução

A síndrome de X frágil (FXS) e as desordens associadas frágeis de X, por exemplo, a síndrome do tremor e da ataxia (FX-TAS), e a insuficiência ovariana preliminar (FX-POI) são causadas principalmente pela expansão da repetição do trinucleotide da citosina-guanina-guanina (CGG) nos 5 ' não traduzidos região (UTR) do gene frágil X retardo mental-1 (FMR1) no xq 27,3^1,2^. A proteína FMR1 codificada (FMRP) é uma proteína de ligação de RNA associada a poliribosome que funciona no desenvolvimento neuronal e na plasticidade sináptica, regulando a emenda alternativa, estabilidade e transporte dendrític....