Realizando xenoenxertos de músculo esquelético humano em camundongos imunodeficientes

Tem sido relatado que apenas 13,8% de todos os programas de desenvolvimento de medicamentos submetidos a ensaios clínicos são bem-sucedidos e levam a terapias aprovadas¹. Quando esta taxa de sucesso for mais elevada do que os 10,4% relatados previamente², há ainda uma sala significativa para a melhoria. Uma abordagem para aumentar a taxa de sucesso dos ensaios clínicos é melhorar os modelos laboratoriais utilizados na investigação pré-clínica. A administração de alimentos e drogas (FDA) requer estudos em animais para demonstrar a eficácia do tratamento e avaliar a toxicidade antes dos ensaios clínicos de fase 1. No entanto, muitas vezes há concordância limitada nos desfechos de tratamento entre estudos em animais e ensaios clínicos³. Além disso, a necessidade de estudos pré-clínicos em animais pode ser uma barreira intransponível para o desenvolvimento terapêutico em doenças que não têm um modelo animal aceito, o que geralmente é o caso de doenças raras ou esporádicas.

Uma maneira de modelar a doença humana é transplantar o tecido humano em camundongos imunodeficientes para gerar xenoenxertos. Existem três principais vantagens para os modelos de Xenoenxerto: primeiro, eles podem recapitular as complexas anormalidades genéticas e epigenéticas que existem na doença humana que podem nunca ser reprodutíveis em outros modelos animais. Em segundo, os xenoenxertos podem ser usados para modelar doenças raras ou esporádicas se as amostras do paciente estiverem disponíveis. Terceiro, os xenoenxertos modelam a doença dentro de um sistema completo in vivo. Por estas razões, nós supor que os resultados da eficácia do tratamento em modelos do xenograft são mais prováveis traduzir aos testes nos pacientes. Os xenoenxertos de tumores humanos já foram utilizados com sucesso para desenvolver tratamentos para cânceres comuns, incluindo mieloma^{múltiplo, bem}como terapias personalizadas para pacientes individuais^4,5,6, o ⁷.

Recentemente, os xenoenxertos têm sido usados para desenvolver um modelo de doença muscular humana⁸. Neste modelo, os espécimes humanos da biópsia do músculo são transplantados nos hindmembros de ratos immunodeficientes de NRG para dar forma a xenoenxertos. Os myofibers humanos transplantados morrem, mas as pilhas de haste humanas do músculo atuais no xenograft expandem subseqüentemente e diferenciam-se em myofibers humanos novos que repovoam o lamina básico humano enxertado. Conseqüentemente, os myofibers regenerados nestes xenoenxertos são inteiramente humanos e são revascularizados espontâneamente e inervado pelo anfitrião do rato. Importante, o tecido muscular do paciente da distrofia muscular fascioscapulohumeral (FSHD) transplantado em ratos recapitula características chaves da doença humana, a saber expressão do fator⁸da transcrição DUX4 . A FSHD é causada pela superexpressão de DUX4, que é epigeneticamente silenciada no tecido muscular normal^9,10. No modelo de FSHD xenograft, o tratamento com um morfolino DUX4-specific foi mostrado para reprisificar com sucesso DUX4 expressão e função, e pode ser uma opção terapêutica potencial para pacientes de FSHD¹¹. Estes resultados demonstram que os xenoenxertos do músculo humano são uma aproximação nova para modelar a doença do músculo humano e para testar terapias potenciais nos ratos. Aqui, nós descrevemos em detalhe o método cirúrgico para criar xenoenxertos humanos do músculo esqueletal em ratos immunodeficientes.

Todo o uso de espécimes de pesquisa de sujeitos humanos foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional (IRB) da Johns Hopkins para proteger os direitos e o bem-estar dos participantes. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade Johns Hopkins (IACUC), de acordo com o guia nacional de saúde (NIH) para o cuidado e uso de animais de laboratório. Macho NOD-Rag1^NULLIL2rγ^NULL (NRG) camundongos hospedeiros (8-12 semanas de idade) são usados para realizar experimentos xenograft. Estes ratos são alojados em racks ventilados e são dadas HEPA-filtrado, temperado, e ar humidificado, bem como osmose reversa filtrada água hiperclorada. Os ratos são fornecidos água e uma dieta antibiótica irradiada (tabela de materiais) ad libitum, e a instalação fornece 14 h de luz para 10 h de escuro como controlado pelo temporizador central.

1. preparação do equipamento

1. Adquira NOD-Rag1^NULLIL2r γ^null (NRG) camundongos, 8-12 semanas de idade.
2. Equipamento cirúrgico da autoclave: tesouras, fórceps, suporte da agulha, grampeador cirúrgico (tabela dos materiais), grampos da ferida, limpezas cirúrgicas (tabela dos materiais), e taça (Figura 1a).
3. Prepare 50 mL de meios musculares (20% soro bovino fetal, 2% extrato de embrião de pintinho, 1% antibiótico/antimicótico em presuntos F10 médio). Manter todos os produtos químicos/drogas/soluções utilizadas para a cirurgia à temperatura ambiente, a menos que indicado de forma diferente no protocolo.
4. Prepare uma seringa de 1 mL com uma agulha de 26 G que seja 3/8 polegadas de comprimento contendo 2 mg/mL de analgésico (tabela de materiais), e coloque no gelo. O analgésico pode ser diluído para a concentração adequada usando salina tampão fosfato estéril (PBS).

2. Preparação cirúrgica

1. Obtenha uma biópsia do músculo humano um protocolo IRB-aprovado dos pacientes cujos os músculos exibem a força > 4-/5 na escala de MRC (Conselho de pesquisa médica)¹². Coloque o espécime de pesquisa em um prato de Petri de 100 mm x 15 mm contendo meios musculares.
   Nota: A escala do MRC é utilizada na prática clínica como uma avaliação da força muscular com 0 não mostrando contração, 5 mostrando potência normal e 4 (4-a 4 +) mostrando movimento contra resistência¹². Nós encontramos que os músculos com fraqueza suave a moderada (MRC > 4-/5) mostram tipicamente a patologia da doença mas não são substituídos extensivamente pelo tecido gordo ou pela fibrose, ambo impedem a regeneração do xenograft. No caso do tecido da autópsia onde uma contagem recente de MRC não está disponível, a qualidade do músculo pode ser alcançada através da observação bruta. As biópsias do músculo que são cor-de-rosa pálido na aparência ou têm grandes áreas do tecido gordo não são prováveis ao xenograft com sucesso.
2. Retire qualquer fáscia remanescente ou tecido adiposo do espécime com tesouras cirúrgicas usando um microscópio estéreo e fonte de luz para ajudar a visualização.
3. Dissecar a biópsia muscular em cerca de 7 mm x 3 mm x 3 mm peças com tesoura cirúrgica usando o microscópio estéreo e uma fonte de luz. Assegure-se de que as fibras estejam dispostas longitudinalmente dentro da amostra.
4. Coloc o prato de Petri que contem o músculo dissecado no gelo. Em média, os xenoenxertos são mantidos em mídia por 4 horas, enquanto as cirurgias estão sendo executadas. Entretanto, as biópsias foram armazenadas nos meios por 24 h antes do xenotransplantar, e este atraso não parece impactar negativamente a transplantação ou a regeneração.
5. Coloque suturas sintéticas, não absorvíveis (tabela de materiais) em um prato de Petri de 100 mm x 15 mm contendo 70% de etanol.
6. Configurar um circuito de anestesia de procedimento duplo: Organize o circuito de respiração Mapleson E no microscópio estéreo e coloque a câmara de indução em um gabinete de biossegurança (Figura 1a,B).
7. Obter o peso do rato NRG colocando em uma taça autoclavada em uma escala, e transferência para a câmara de indução. Induzir anestesia isoflurano a 3%. Uma vez alcançada a profundidade anestésica apropriada — avaliada pela observação da frequência respiratória, relaxamento muscular e falta de movimento voluntário — reduza o ajuste do vaporizador para 1,5% para o restante da cirurgia.
8. Transfira o rato da câmara de indução para o circuito respiratório de Mapleson e e aplique pomada oftálmico aos olhos.
9. Retire o cabelo sobrejacente ao tibial anterior (ta) do tornozelo ao joelho com um aparador, seguido de um tratamento de 1 min com loção para depilação (tabela de materiais) (Figura 2a).
10. Desinfete o local cirúrgico por limpando a perna com solução de iodo-povidona. Em seguida, lave o Povidone-Iodo restante com 70% de etanol.
11. Injete o rato por via subcutânea com analgésico, como o carprofeno, (tabela de materiais) numa dose de 5 mg/kg.

3. cirurgia de Xenoenxerto

1. Tape a perna e faça uma incisão reta sobre o músculo tibilalis anterior (TA) com tesoura e pinça de íris originada nos tendões distais e terminando abaixo do joelho (Figura 2b).
2. Separe a pele do músculo que usa a dissecção sem corte com tesouras cirúrgicas.
3. Corte através do epimísio do músculo ta com tesouras começando no tendão e terminando no joelho.
   Nota: Este é um corte muito superficial (menos de 0,5 mm; Figura 2b, linha tracejada preta), e o ta subjacente não deve ser danificado no processo, pois isso tornaria a remoção mais desafiadora. Quando realizada corretamente, as fibras musculares irá relaxar visivelmente.
4. Corte o tendão distal do TA com tesoura, agarre o tendão com pinça de íris, e puxe o TA para cima em direção ao joelho (Figura 2C).
5. Corte o tendão distal do extensor digitorum longo (EDL) com tesoura e puxe a EDL para o joelho (Figura 2D). Uma vez que o tendão proximal do músculo peroneus longo (pl) é visível, retire a EDL com tesouras (Figura 2D, linha tracejada verde).
6. Retire o TA com tesouras (Figura 2D, linha tracejada azul) e use um esfregue cirúrgico molhado com PBS e leve pressão para atingir a hemostasia (Figura 2e).
7. Rosqueie uma sutura através do tendão e da guarnição proximal do longo do peroneus (pl), deixando aproximadamente 1,5 de polegada da linha em um ou outro lado do tendão (Figura 2F).
8. Realize a primeira metade de um nó quadrado cirúrgico de duas mãos, mas não aperte: isso dará forma a um círculo. Coloc um xenograft neste círculo e aperte o laço para fixar o xenograft. Complete a outra metade do nó quadrado (Figura 2G,H). Isto suturará o xenograft ao tendão proximal do PL.
9. Sutura da rosca através do tendão PL distal e repita a técnica do nó quadrado da etapa 3,8 para amarrar o Xenoenxerto ao tendão distal (Figura 2h,I).
   Nota: A artéria tarsal medial e a veia podem estar próximas ou em cima do tendão distal do PL. Não coloc suturas através ou em torno destas embarcações. É fácil dizer se uma sutura foi coloc impropriamente enquanto os vasos Blanch ou sangram. Se isso ocorrer, remova a sutura e coloque em um local diferente.
10. Puxe a pele sobre o músculo xenografados, sele com colagem cirúrgica, e coloc 2-3 grampos cirúrgicos sobre a incisão (Figura 2j).
11. Coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada aquecida para recuperar. Monitore o mouse até estar totalmente consciente e periodicamente nos próximos dias para sinais de infecção sistêmica local e para garantir que o local cirúrgico não seja reaberto.
    Nota: Uma dose única de analgésico como descrito na etapa 2,11 é tipicamente suficiente para alívio da dor. No entanto, os camundongos também devem ser monitorados quanto à dor persistente (por exemplo, claudicação, revestimento de babados, postura curvada) e, se necessário, re-dosado com analgésico a 24 h no pós-operatório.

4. coleção xenograft

Nota: Os xenoenxertos são tipicamente coletados entre 4 a 6 meses após a cirurgia. No entanto, as coletas foram realizadas até 12 meses após a cirurgia.

1. Coloque uma taça coberta contendo 200 mL de 2-metilbutano em uma caixa contendo gelo seco por um mínimo de 30 min antes da coleta de Xenoenxerto.
2. Induzir anestesia isoflurano a 3% em câmara de indução. Uma vez que a profundidade anestésica apropriada é conseguida, reduza o ajuste do vaporizador a 1,5% para o restante da cirurgia.
3. Transfira o rato da câmara de indução para o circuito de respiração Mapleson E arranjado num microscópio estéreo.
4. Remova o cabelo que sobrejacente o tibial anterior do tornozelo ao joelho com um aparador e uma loção da remoção do cabelo. As suturas que prendem o xenograft no lugar podem ser vistas através da pele (Figura 3a).
5. Tape a perna e use tesouras e pinças de íris para abrir a pele sobre o Xenoenxerto até que ambas as suturas sejam visíveis (Figura 3B). A pele que sobrejacente o xenograft pode ser removida como mostrado para fazer a remoção do xenograft mais fácil.
6. Use um bisturi para cortar entre o xenograft e a tíbia (Figura 3B, a seta denota o local inicial e a direção da incisão). Isto libertará um lado do xenograft.
7. Use um bisturi para cortar entre o músculo pl eo músculo gastrocnêmio (Figura 3C, incision ao longo epimísio rotulado com seta). O PL será removido com o xenograft.
8. Corte abaixo da sutura distal e através do tendão distal do PL (Figura 3D, corte ao longo da linha pontilhada).
9. Remova o xenograft e o PL agarrando a sutura com o fórceps da íris e desviando o para o joelho ao usar a tesoura para cortá-la longe do músculo subjacente (Figura 3E).
10. Corte acima da sutura proximal com tesoura para remover o xenograft e o PL (Figura 3F, corte ao longo da linha pontilhada em 3E).
11. Coloque a amostra em um pequeno pedaço de papelão ou plástico, e fixar o mais próximo possível das suturas. Ao fixar o espécime, esticar delicadamente o músculo para assegurar-se de que a orientação da fibra esteja mantida durante o processo de congelação da pressão. Depois que os pinos estão firmemente no lugar, deslize o músculo acima dos pinos assim que descansa apenas acima do cartão.
    Nota: Alternativamente, uma extremidade do xenograft pode ser montada no tragacanto em uma cortiça, ou pode ser submergida inteiramente no composto óptimo da temperatura de corte (O.C.T.) em um cryomold. Com o cuidado, a conformação muscular pode ser mantida com ambos os métodos.
12. Congele o xenograft no 2-methylbutane pre-cooled.
13. Loja xenograft em-80 ° c.
14. Imediatamente após a coleta de Xenoenxerto, eutanizar camundongos de acordo com as diretrizes da American Veterinary Medical Association:
    1. Coloc ratos em uma câmara selada com um sistema apropriado da eliminação do gás waste. Use isoflurano em uma concentração de 3-4% para induzir anestesia.
    2. Uma vez alcançada a profundidade anestésica apropriada — avaliada pela observação da frequência respiratória, relaxamento muscular e falta de movimento voluntário — aumente o ajuste do vaporizador para 5% para induzir a morte. Deixe os ratos na câmara por um adicional de 2 minutos após a respiração cessou. A morte é verificada observando-se que os camundongos não conseguem se recuperar dentro de 10 min após a overdose de isoflurano.
    3. Finalmente, realize luxação cervical nos camundongos.
       Nota: No caso de camundongos bilateralmente xenografados, o Xenoenxerto contralateral pode ser salvo para uma coleta posterior. Para realizar uma coleção da sobrevivência, abra a pele que sobrejacente o xenograft com um único corte reto com tesouras cirúrgicas, e remova o xenograft como descrito nas etapas 4,6 a 4,10. Em seguida, feche a pele sobre o compartimento tibial vazio usando cola cirúrgica e grampos. Trate o rato com analgésico como descrito na etapa 2,11 e coloc o rato na gaiola limpa na almofada heated para recuperar. Monitore o rato até que inteiramente consciente e periòdicamente sobre os próximos dias para sinais da infecção sistemática local e assegure-se de que o local cirúrgico não esteja reaberto.

5. Xenoenxerto imunoistoquímica

1. Use um criostat para cortar as seções de 10 a 12 μm do xenograft coletado em corrediças positivamente carregadas (tabela dos materiais).
2. Encha o frasco da mancha com metanol e pre-esfrie em-20 ° c por 30 minutos.
3. Coloc corrediças no metanol frio do gelo por 10 minutos para fixar e permeabilize as seções do xenograft.
4. Coloque as lâminas no frasco de coloração e lave 3x com tampão fosfato salina (PBS) por 5 min.
5. Bloco com anti-mouse IgG (tabela de materiais) para 2 h a 4 ° c.
6. Blot com anticorpos primários, como A spectrina, lamina A/C e miosina embrionária (tabela de materiais) em PBS suplementado com soro de cabra a 2% durante a noite a 4 ° c.
7. Coloque os slides em um frasco de coloração e lave 3x com tampão fosfato salina (PBS) por 5 min.
8. Blot com anticorpos secundários conjugados fluorescentes-corante (tabela de materiais) em PBS suplementado com soro de cabra a 2% por 1 h à temperatura ambiente.
9. Coloque as lâminas no frasco de coloração e lave 3x com tampão fosfato salina (PBS) por 5 min.
10. Coloque o meio de montagem (tabela de materiais) sobre as seções de xenoenxertos, coloque a lamínula na parte superior e use esmalte para selar a lamínula.

Figura 2: cirurgia de Xenoenxerto. (A) o cabelo é removido do local cirúrgico. (B) uma incisão é feita sobre o tibial anterior (ta). Os tendões distais do TA e do extensor longo do digitorum (EDL) são marcados com setas. A linha tracejada preta indica onde o epimísio será cortado na etapa 3,3. (C) o tendão distal do ta é cortado e o músculo é puxado até o joelho. (D) o tendão do EDL é cortado e o EDL é puxado até o joelho. Isto expõe o tendão proximal do longo do peroneus (pl) marcado com uma seta. Linhas tracejadas indicam onde cortar com tesouras para remover o EDL (verde) e PL (azul). (E) os EDL e ta são removidos. (F) uma sutura é colocada através do tendão proximal do pl. (G) o xenograft é coloc no compartimento tibial vazio e suturado ao tendão proximal do pl usando um nó quadrado cirúrgico da dois-mão. (H) uma sutura é colocada através do tendão distal do pl, marcada com uma seta, e outro nó quadrado cirúrgico de duas mãos é usado para suturar o Xenoenxerto para o tendão distal. (I) o Xenoenxerto é totalmente transplantado e suturado para o pl. (J) a pele é fechada com cola cirúrgica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3:4 mês coleção xenograft. (A) o cabelo é removido do local cirúrgico. Suturas são visíveis a pele. (B) a pele que sobrejacente o xenograft é removida. Então o xenograft é agarrado com o fórceps da íris na sutura longe do ponto de origem e puxado delicadamente para cima. A partir do tornozelo, um bisturi é usado para cortar ao longo da tíbia e libertar o Xenoenxerto. A seta mostra o início da incisão ao longo da tíbia. (C) puxando o músculo gastrocnêmio ao lado, uma linha branca fraca de epimísio que separa o músculo do longo do peroneus (pl) e o gastrocnêmio (mostrado pela seta) torna-se visível. Use o bisturi para cortar ao longo desta linha para separar o PL dos outros músculos da perna. (D) o lado direito do xenograft, e o pl estão agora livres dos outros músculos na perna e estão prontos para a remoção. A linha tracejada indica onde cortar com tesouras cirúrgicas para começar a remover o xenograft e o PL. (e) após o corte abaixo da sutura longe do ponto de origem, deflexionar o xenograft para o joelho. A linha tracejada indica onde cortar com tesouras cirúrgicas para remover o xenograft e o PL do compartimento tibial. (F) o compartimento tibial vazio com o xenograft e o pl removidos com sucesso. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como demonstrado por Yuanfan Zhang et al., este protocolo cirúrgico é um método direto para produzir xenoenxertos de músculo esquelético humano8. Xenoenxertos regenerados tornam-se espontaneamente inervado e exibem contratilidade funcional. Além, o músculo xenografados dos pacientes de FSHD recapitula mudanças na expressão de gene observadas em pacientes de FSHD8.

Em nossa experiência, aproximadamente 7 de 8 xenoenxertos executados dos espécimes pacientes do controle mostrarão o Engraftment bem sucedido do músculo. Um Xenoenxerto bem-sucedido mostra uma regeneração robusta de miofibras humanas como identificado com anticorpos específicos humanos (Figura 4). A coloração embrionária positiva da miosina dentro de uma proporção de miofibras indica que o processo de regeneração ainda está em andamento. Em contrapartida, a má técnica cirúrgica ou um espécime inadequado podem levar à má regeneração das fibras musculares (Figura 4).

Xenoenxertos realizados a partir de um paciente diagnosticado com miopatia inflamatória idiopática (IIM) mostram números moderados de miofibras humanas regeneradas em coletas de 4 e 6 meses, e a coloração embrionária da miosina persiste aos 6 (Figura 5a). As células inflamatórias estão presentes no Xenoenxerto como mostrado pela coloração de H & E (Figura 5a), e foram confirmadas com CD3, CD68 e outros marcadores imunológicos (dados não mostrados). Xenoenxertos são estáveis dentro do mouse, e até 12-mês coleções foram executadas. O tamanho de miofibras individuais é comparável entre os xenoenxertos de IIM de 4 e 6 meses e a biópsia do paciente IIM original (Figura 5b). Fibras raras mostrando uma área transversal (CSA) maior que 3500 μm2 são observadas em xenoenxertos, mas não na biópsia de IIM, indicando que algumas miofibras nos xenoenxertos podem regenerar para um CSA comparável em tamanho a miofibras saudáveis (Figura 5b ).

Figura 1: set-up cirúrgico.
A) orientação padrão do microscópio estereofónico, do circuito de respiração de Mapleson e, e de ferramentas cirúrgicas durante A cirurgia do xenograft. B) colocação da câmara de indução em gabinete de biossegurança.

Figura 4: resultados positivos e negativos esperados.
Xenoenxertos coletados 4 meses após A cirurgia mostrando boa ou má regeneração são corados com lamina A/C (1:50) e espectral humano-específico (1:20) e miosina embrionária (1:10) (tabela de materiais). As regiões indicadas pelas caixas tracejadas brancas são mostradas como inserções de ampliação mais elevadas. Barra de escala: 200 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: regeneração representativa do Xenoenxerto.
A) xenoenxertos (delineados com linhas tracejadas) realizados a partir de um paciente com diagnóstico de miopatia inflamatória idiopática (IIM) corado com hematoxilina e eosina (H & e), lamina A/C específica humana e espectral específico humano, formação de miofibras de exposição dentro de camundongos NRG nos pontos de tempo de 4 e 6 meses. A coloração embrionária da miosina demonstra que a regeneração ainda está em andamento em ambos os pontos temporais. Barra de escala: 200 μm. B) histogramas que descrevem a área de secção transversal (CSA) de myofibers dos xenoenxertos de 4 e 6 meses e das biópsias humanas de um paciente diagnosticado com um miopatia inflamatório idiopático (IIM) e um paciente de controle saudável. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.