É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Medição específica do ciclo celular de γH2AX e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo

12.6K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/59968

⸱

1 de setembro de 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1CCU Molecular and Radiation Oncology, German Cancer Research Center, 2Department of Radiation Oncology, Heidelberg University Hospital, 3Department of Radiation Oncology, Freiburg University Medical Center

Autores correspondentes: Ramon Lopez Perez <r.lopez@dkfz-heidelberg.de>

Neste artigo

Resumo

O método apresentado combina a análise quantitativa das rupturas da dobro-Costa do ADN (DSBs), a distribuição do ciclo de pilha e o apoptose para permitir a avaliação ciclo-específica da pilha da indução e do reparo de DSB assim como as conseqüências da falha do reparo.

Resumo

O método apresentado ou versões ligeiramente modificadas foram concebidas para estudar respostas específicas de tratamento e efeitos colaterais de vários tratamentos anticancerígenos utilizados na oncologia clínica. Permite uma análise quantitativa e longitudinal da resposta de dano do ADN após o esforço genotóxico, como induzido pela radioterapia e por uma multidão de drogas anticancerígenas. O método abrange todas as fases da resposta ao dano do DNA, proporcionando desfechos para indução e reparo de quebras de dupla vertente de DNA (DSBs), prisão por ciclo celular e morte celular por apoptose em caso de falha no reparo. Combinar estas medidas fornece a informação sobre efeitos ciclo-dependentes do tratamento da pilha e permite assim um estudo detalhado do interação entre a proliferação celular e os mecanismos de enfrentamento de encontro aos danos do ADN. Como o efeito de muitos terapêutica oncológica, incluindo agentes quimioterápicos e radiação ionizante é limitado ou fortemente varia de acordo com as fases específicas do ciclo celular, análises correlativas dependem de um método robusto e viável para avaliar os efeitos do tratamento no DNA de uma forma específica do ciclo celular. Isso não é possível com ensaios de ponto de extremidade único e uma vantagem importante do método apresentado. O método não é restrito a qualquer linha celular em particular e foi exaustivamente testado em uma infinidade de tumores e linhas celulares normais do tecido. Pode ser amplamente aplicado como um ensaio de genotoxicidade abrangente em muitos campos de Oncologia, além de rádio-oncologia, incluindo avaliação de fatores de risco ambiental, triagem de drogas e avaliação da instabilidade genética em células tumorais.

Introdução

O objetivo da Oncologia é matar ou inativar as células cancerosas sem prejudicar as células normais. Muitas terapias, direta ou indiretamente, induzem o estresse genotóxico em células cancerosas, mas também para alguns se estendem em células normais. A quimioterapia ou as drogas alvejadas são combinadas frequentemente com a radioterapia para realçar a radiosensibilidade do tumor irradiado1,2,3,4,5, que permite uma redução de a dose de radiação para minimizar os danos teciduais normais.

A radiação ionizante e outros agentes genotóxicos induzem diferentes tipos de danos ao DNA, incluindo modificações de base, ligações cruzadas e quebras de fio simples ou duplo. As rupturas da dobro-Costa do ADN (DSBs) são as lesões as mais sérias do ADN e sua indução é chave ao efeito da matança da pilha da radiação ionizante e das várias drogas cytostatic na radioquimioterapia. Os DSBs não só prejudicam a integridade do genoma, mas também promovem a formação de mutações6,7. Conseqüentemente, as rotas diferentes do reparo de DSB, e os mecanismos para eliminar pilhas irreparàvel danificadas como o apoptose desenvolveram durante a evolução. A resposta inteira do dano do ADN (DDR) é regulada por uma rede complexa de vias de sinalização que alcangam do reconhecimento de dano do ADN e da apreensão do ciclo de pilha para permitir o reparo do ADN, à morte de pilha programada ou à inactivação em caso da falha do reparo8.

O método cytometric do do fluxo apresentado foi desenvolvido para investigar o DDR após o esforço genotóxico em um ensaio detalhado que cubra a indução e o reparo de DSB, assim como conseqüências da falha do reparo. Combina a medida do marcador amplamente aplicado γH2AX do DSB com análise do ciclo da pilha e da indução do apoptosis, usando a análise subG1 clássica e uma avaliação mais específica da ativação do caspase-3.

A combinação destes valores-limite em um ensaio reduz não somente o tempo, o trabalho e as despesas de custo, mas igualmente permite a medida ciclo-específica da pilha da indução e do reparo de DSB, assim como a ativação de caspase-3. Tais análises não seriam possíveis com ensaios conduzidos independentemente, mas são altamente relevantes para uma compreensão detalhada da resposta de dano do ADN após o esforço genotóxico. Muitas drogas anti-câncer, tais como compostos citostáticos, são dirigidas contra a divisão de células e sua eficiência é fortemente dependente da fase de ciclo celular. A disponibilidade de diferentes processos de reparo do DSB também depende do estágio do ciclo celular e da escolha do caminho que é crítico para a precisão do reparo, e por sua vez determina o destino da célula9,10,11, doze anos. Além, a medida ciclo-específica da pilha de níveis de DSB é mais exata do que a análise agrupada, porque os níveis de DSB são não somente dependentes da dose de um composto ou de uma radiação genotóxico, mas igualmente no índice do ADN da pilha.

O método tem sido utilizado para comparar a eficácia de diferentes radioterapias para superar os mecanismos de resistência no glioblastoma13 e dissecar a interação entre radiação ionizante e drogas direcionadas em osteossarcoma14,15 e cancros rhabdoid teratoides atípicos16. Adicionalmente, o método descrito tem sido amplamente utilizado para analisar os efeitos colaterais da rádio e da quimioterapia nas células-tronco mesenquimais17,18,19,20,21, 22,23,24, que são essenciais para o reparo de dano de tecido normal induzido pelo tratamento e têm uma aplicação potencial na medicina regenerativa.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. preparação

  1. Prepare ≥ 1 x 105 células/amostra em qualquer tipo de embarcação de cultura como material de partida.
    1. Por exemplo, realize um experimento de curso de tempo após a exposição de células de glioblastoma U87 à radiação ionizante: irradiar células U87 subconfluentes em frascos T25 em triplicados para cada ponto de tempo. Escolha o tempo-pontos adiantados (15 minutos até 8 h após a irradiação) para seguir a cinética do reparo de DSB (nível γH2AX) e os pontos atrasados do tempo (24 h até 96 h) para avaliar níveis residuais do DSB, efeitos do ciclo de pilha e apoptosis.
      Nota: O protocolo não é restrito a experimentos de irradiação ou qualquer linha celular específica. Foi testado com inúmeras linhas celulares de todos os tipos, de diferentes espécies e para várias condições de tratamento.
  2. Prepare as seguintes soluções, incluindo 10% de excesso de volume.
    1. Prepare 2 mL por amostra de solução de fixação composta por 4,5% de paraformaldeído (PFA) em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Prepare a solução fresca. Diluir PFA em PBS por aquecimento a 80 ° c com agitação lenta a capa de fumos. Cubra o balão com folha de alumínio para evitar a perda de calor. Deixe a solução arrefecer até à temperatura ambiente e ajuste o volume final. Passe a solução através de um filtro de celulose dobrado, grau 3hw (veja a tabela de materiais).
      Atenção: Fumos de PFA são tóxicos. Realize esta etapa uma capa de fumaça e descarte os resíduos de PFA apropriadamente.
    2. Prepare 3 mL por amostra de solução de permeabilização composta por 70% de etanol em gelo-frio H2O. conservar a-20 ° c.
    3. Prepare 7 mL por amostra de solução de lavagem composta por 0,5% de albumina sérica bovina (BSA) em PBS.
    4. Prepare 100 μL por amostra de 3% de BSA em PBS como diluente de anticorpos.
    5. Prepare 100-250 μL por amostra de solução de coloração de DNA composta por 1 μg/mL 4 ',6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) em PBS.
  3. Ajuste a centrífuga para tubos de 15 mL para 5 min a 200 x g e 7 ° c. Deixe a centrífuga arrefecer e utilize estas definições para todas as etapas de centrifugação.

2. coleta de amostras

  1. Se o processamento de células aderentes (por exemplo, células de glioblastoma U87 cultivadas em frascos T25 com 5 mL do meio modificado de Eagle de Dulbecco suplementado com soro bovino fetal a 10% a 37 ° c e a atmosfera de dióxido de carbono a 5%), continue com os passos 2.1.1. e 2.1.2. Para as células de suspensão Prossiga diretamente para o passo 2.1.2.
    1. Colete o meio em um tubo de centrifugação. Separe as células usando um método de cultura de célula rotineira, que pode incluir o uso de tripsina, ácido etilenodiaminotraacético (EDTA) ou outros agentes de descolamento celular.
      1. Para células U87, PBS pré-aquecido e tripsina/EDTA (ver a tabela de materiais) a 37 ° c, lave a camada celular com 1 ml de PBS, incubar as células por 1-2 min com 1 ml de TRIPSINA/EDTA e suporte de descolamento de células tocando no balão. Colete toda a solução de lavagem e a suspensão celular no tubo com o meio.
    2. Centrifugue as células, descarte o meio e ressuspender as células em 1 mL de PBS.
  2. Pipet as células para cima e para baixo várias vezes para garantir uma única suspensão celular e transferir a suspensão celular em um tubo com 2 mL de solução de fixação (4,5% PFA/PBS, 3% concentração final).
    Atenção: Fumos de PFA são tóxicos. Realize esta etapa uma capa de fumaça e descarte os resíduos de PFA apropriadamente.
  3. Incubar as células por 10 min à temperatura ambiente.
  4. Centrifugue as células e descarte o sobrenadante por decantação.
  5. Afrouxe a pelota da pilha batendo no tubo e ressuspender as pilhas em 3 mL do etanol de 70%. Prossiga diretamente com a próxima etapa ou armazene as amostras a 4 ° c por até várias semanas.

3. lavagem e coloração

  1. Centrifugue as células e descarte o sobrenadante por decantação.
  2. Afrouxe a pelota da pilha batendo no tubo. Resuspend as pilhas em 3 mL da solução de lavagem (0,5% BSA/PBS), centrifugue e descarte o sobrenadante.
  3. Repita o passo de lavagem 1X com 3 mL e, em seguida, 1x com 1 mL de solução de lavagem. Na última etapa, descarte o sobrenadante cuidadosamente por pipetagem. Tome cuidado para não aspirar o pellet.
  4. Diluir os anticorpos contra γH2AX, phospho-histone H3 (Ser10) e caspase-3 (ver a tabela de materiais) em 100 μl/amostra com diluente de anticorpo (3% BSA/PBS).
  5. Afrouxe a pelota da pilha batendo no tubo e ressuspender as pilhas em 100 μL da solução do anticorpo preparada na etapa 3,4. Mantenha as amostras no escuro a partir deste passo em diante.
  6. Incubar as amostras durante 1 h à temperatura ambiente.
  7. Centrifugue as células e elimine o sobrenadante com a pipetagem. Tome cuidado para não aspirar o pellet.
  8. Afrouxe o pellet da pilha batendo no tubo e ressuspender as células em 100-250 μL de solução de coloração de DNA (1 μg/mL DAPI/PBS).
    1. Use 100 μL se 1-2 X105 células estão presentes e aumentar o volume de números de células mais elevadas (250 μl para ≥ 1 x 106 células). Prossiga diretamente com a próxima etapa ou armazene as amostras no escuro a 4 ° c por até 2 semanas.
      Nota: Para alguns tipos de células, otimizar a concentração de DAPI pode ajudar a melhorar a separação das fases do ciclo celular.
  9. Pipet as amostras através da tampa do filtro da pilha de um tubo da amostra com um tamanho do pore da malha de 35 μm.

4. medição

  1. Coloque as amostras no gelo, inicie o citometro de fluxo (veja a tabela de materiais) configurado com uma configuração óptica de acordo com a tabela 1 e pressione o botão Prime . Se necessário, ligue o laser ultravioleta (355 NM de comprimento de onda) separadamente e defina a potência para 10 mW usando o software apropriado.
  2. Abra o software de aquisição (consulte a tabela de materiais), faça login e crie um novo experimento clicando no botão novo experimento na barra de ferramentas do navegador .
  3. Use a janela Inspector para personalizar o nome do experimento e escolha ' 5 décadas de log ' para exibição de plotagem.
  4. Clique no botão novo espécime na barra de ferramentas do navegador e expanda a nova entrada clicando no símbolo ' + ' no lado esquerdo para mostrar o primeiro tubo. Selecione o respectivo ícone e tipo para renomear a amostra (por exemplo, tipo de célula) e o tubo (identificador de amostra). Clique no ponteiro do tubo do primeiro tubo (seta-como símbolo à sua esquerda) para transformá-lo verde (ativo).
  5. Abra a guia parâmetros na janela do citometro e escolha os parâmetros de acordo com a tabela 1. Exclua todos os parâmetros desnecessários.
    Nota: os nomes dos parâmetros podem variar dependendo das predefinições personalizadas (por exemplo, Cy3 em vez de Alexa555). Certifique-se de que a seleção corresponda aos filtros ópticos e detectores na tabela 1. Os trajetos claros de todos os fluoróforos são inteiramente independentes nesta instalação e a compensação da sobreposição espectral não é exigida; no entanto, poderá ser necessário se for utilizada outra configuração óptica.
  6. Abra a janela planilha e crie plotagens de acordo com a Figura 1. Desenhe 2 parcelas de pontos e 4 histogramas usando os botões da barra de ferramentas correspondentes e clique nos rótulos dos eixos para escolher os parâmetros apropriados (dispersão frontal (FSC-A) versus dispersão lateral (SSC-A), DAPI-W versus DAPI-A e um histograma para DAPI-A e cada anticorpo acoplado fluoróforo.
  7. Anexe uma amostra de controle ao citometro e pressione o botão Run no instrumento. Selecione o primeiro tubo na janela do navegador do software e clique no botão adquirir dados no painel de aquisição. Ajuste o volume de injeção da amostra usando os botões baixo, médio ou alto e a roda de sintonia fina do instrumento. Preferencialmente trabalhar em baixa definição, mas tente adquirir pelo menos 100 eventos/segundo (ver painel de aquisição).
  8. Ajuste as tensões do detector para FSC, SSC e DAPI na guia parâmetros da janela Inspector usando as plotagens de pontos na Figura 1 como uma diretriz. Alterne para a escala logarítmica para os parâmetros FSC e SSC se a população da célula aparecer muito dispersa em uma escala linear.
  9. Pressione o botão STANDBY no citometro e continue com a configuração da planilha no software.
    1. Use a ferramenta de porta de polígono para definir a população de células no gráfico FSC-A versus SSC-a e a Rectangle Gate Tool para definir a população Singlecells na plotagem DAPI-W versus DAPI-a. Pressione Ctrl + G Keys para mostrar a hierarquia de população e clique nos nomes de portão padrão para renomeá-los.
    2. Subseqüentemente clique com o botão direito em todos os histogramas e escolha Mostrar populações | SingleCells no menu de contexto.
  10. Otimize as tensões do detector para os fluoróforos acoplados a anticorpos para cobrir a faixa dinâmica completa, adquirindo posteriormente controle e amostras tratadas. Maximize a relação sinal-ruído e evite a saturação do detector. Certifique-se de que o pico Alexa488 na população Singlecells não é truncado no controlo nem a amostra tratada.
  11. Pressione o botão STANDBY no citometro e, opcionalmente, execute as etapas 4.11.1-4.11.3 na janela planilha do software para obter uma estimativa aproximada dos efeitos do tratamento durante a aquisição da amostra.
    1. Selecione Singlecells na hierarquia de população e use a ferramenta porta retangular para definir a população G1 no gráfico DAPI-W versus DAPI-a. Clique com o botão direito do mouse no histograma Alexa488 e escolha Mostrar populações | G1 no menu de contexto.
    2. Clique com o botão direito do mouse no histograma Alexa488 e escolha criar exibição de estatísticas no menu de contexto. Clique com o botão direito do mouse na exibição de estatísticas e escolha Editar exibição de estatísticas. Vá para a guia estatísticas e ative a caixa de seleção para a mediana do sinal Alexa488 na população G1 (desative todas as outras opções).
    3. Selecione Singlecells na hierarquia de população e use a ferramenta de porta de intervalo para definir as populações subG1, M e Casp3 + no DAPI-a, Alexa555-a (Cy3-a na Figura 1) e Alexa647-A histogramas.
  12. Pressione o botão Run no citometro e Meça as amostras usando o painel de aquisição no software. Defina a porta de parada para todos os eventos ou o portão de células (se existirem numerosas pequenas partículas) e o número de eventos para gravar para 10.000.
  13. Clique em Next Tube para criar um novo exemplo, renomeá-lo na janela do navegador , clique em adquirir dados para iniciar a aquisição e gravar dados para iniciar a gravação.
  14. Selecione arquivo | Exportação | Experimentos na barra de menus e escolha exportação de diretório na caixa de diálogo para salvar os dados como arquivos '. FCS '. Opcionalmente, salve o experimento como um arquivo zip adicional se habilitar a reimportação do experimento em um momento posterior.
    Nota: A configuração de experimentos existentes pode ser facilmente reutilizada com Edit | Duplicar sem dados.

5. avaliação de dados

  1. Arraste e solte os arquivos '. FCS ' no navegador de amostra do software de análise citométrica de fluxo (consulte tabela de materiais). Aplique a estratégia de gating mostrada na Figura 2. Certifique-se de que os portões se encaixam na população correspondente em todas as amostras antes de prosseguir com a próxima porta da filha.
    1. Para aplicar alterações em todos os exemplos, selecione o portão alterado no navegador de exemplo, copie-o pressionando Ctrl + C, selecione o portão pai, pressione Ctrl + Shift + e para selecionar os nós equivalentes em todos os exemplos e pressione Ctrl + V para colar ou Sobrescrever o portão. Não use portões de grupo.
    2. Clique duas vezes na primeira amostra do navegador para abrir o gráfico SSC-A vs. FSC-A. Use a ferramenta Polygon na barra de ferramentas para definir a população de células (Figura 2, plotagem 1), excluindo os detritos da análise. Certifique-se de que o portão é suficientemente largo para o canto superior direito para acomodar turnos relacionados com o tratamento, mas restringir a borda voltada para o canto inferior esquerdo do gráfico para excluir a célula de forma confiável.
    3. Clique duas vezes no portão de células para abrir uma nova janela de plotagem e alterar os eixos para DAPI-W (vertical) vs. DAPI-a (horizontal) clicando nos rótulos do eixo. Use a ferramenta Rectangle para definir a população singlecells (Figura 2, parcela 2), excluindo duplicetas de células ou aglomerados da análise (doublets de células G1 têm A mesma intensidade DAPI-a como G2 e células M, mas um DAPI-W consideravelmente maior de valor).
      Nota: As contagens de pilha variando em amostras diferentes causarão deslocamentos na força de sinal total de DAPI-A devido à ligação do equilíbrio de DAPI ao ADN. Isso não afetará a análise do ciclo celular, mas pode ser necessário ajustar a borda direita da amostra de porta de célula única por amostra para dar conta desses turnos.
    4. Clique duas vezes no portão Singlecells para abrir uma nova janela de plotagem e alterar os eixos para mostrar o histograma DAPI-a. Use a ferramenta Bisector para distinguir células únicas com conteúdo normal de DNA (população decellcycle ) de células apoptóticas com DNA degradado (populaçãosubG1 ). Em seguida, selecione os novos portões no navegador e pressione Ctrl + R para renomeá-los adequadamente (Figura 2, plotagem 3).
    5. Selecione o Cellcycle Gate no navegador e escolha Tool | Biologia | Ciclo de células... a partir da barra de menus para abrir a ferramenta de modelagem do ciclo celular. Escolha Dean-Jett-Fox25,26 na seção modelo para estimar a frequência das células na fase G1, S e G2/M (Figura 2, parcela 4). Use restrições somente em caso de mau desempenho de modelagem (Minimize a raiz média do desvio quadrado entre o modelo e os dados).
    6. Crie portões para a fase G1 (Ellipse Tool), S (Polygon Tool) e G2 + M (Ellipse Tool) no DAPI-W vs. DAPI-um gráfico da população do ciclo de células para ativar a medição γh2ax específica do ciclo celular ( Figura 2, lote 5). Não use a ferramenta de modelagem para a gating automática do ciclo celular com base no histograma DAPI-A, pois isso pode ser impreciso.
      Nota: Pode ser necessário mover os portões ao longo da amostra do eixo DAPI-A por exemplo para dar conta dos turnos acima mencionados na força de sinal DAPI geral. Mova somente as três portas como um grupo e não mude a forma de portas individuais para evitar o viés.
    7. Use a ferramenta Bisector para distinguir as células de fosho-histona H3-positive (m) e-Negative (m-) no histograma Alexa555-a da população do cellcycle (Figura 2, parcela 6). Segure Ctrl e selecione os portões G2 + m e m-. Pressione Ctrl + Shift + a para criar o G2 (G2 + m & m-) portão.
    8. Use a ferramenta Bisector para distinguir as células caspase-3-positive (Casp3 +) e-Negative (Casp3-) no histograma Alexa647-a da população singlecells (Figura 2, parcela 7). Defina o limiar de tal forma que a média da população Casp3 + nos controlos não tratados atinge ~ 0,8% para assegurar uma elevada sensibilidade e minimizar as variações do ensaio para o ensaio.
    9. Pressione Ctrl + T para abrir o Editor de tabela e configurá-lo de acordo com a Figura 3. Arraste e solte as diferentes populações do navegador de exemplo no Editor de tabelas e clique duas vezes nas linhas para alterar as configurações de estatística, parâmetro e nome. Remova as linhas desnecessárias que são adicionadas automaticamente após o arrastar e soltar do ícone de modelagem de ciclo de célula selecionando as linhas e pressionando del.
    10. Escolha o arquivo, o formato e o destino na seção de saída da faixa de opções do menu e clique em criar tabela para exportar os dados como arquivo '. xlsx '.
  2. Use o software de cálculo de tabela (consulte a tabela de materiais) para análise de dados adicionais de acordo com o arquivo complementar 1 (FACS_Analysis_Template_ (1). xlsx).
    1. Corrija as frequências das células nas diferentes fases do ciclo celular, de forma que sua soma atinge 100% aplicando a fórmula X ' = X * 100/Σ (todas as fases do ciclo celular), com X ': valor corrigido, X: valor bruto, para cada fase do ciclo celular.
      Nota: Os desvios de uma soma de 100% ocorrem devido a imprecisões na modelagem do ciclo celular, mas geralmente são pequenos (< 5%).
    2. Normalize as intensidades médias γH2AX para o conteúdo de DNA nas diferentes fases do ciclo celular dividindo os valores na fase S por 1,5 e na fase G2 e M por 2,0.
    3. Para calcular o nível de γH2AX normalizado combinado em toda a população de células, use a fórmula Ia = iG1 * G1 + is * s + iG2 * G2 + im * m, onde ia, iG1, is, iG2, im são intensidades medianas normalizadas γH2AX de todas, G1, S, G2, células M respectivamente e G1, S, G2, M são frequência corrigida das células na respectiva fase de ciclo celular.
    4. Para os níveis normalizados de γH2AX e a frequência de células subG1 e caspase-3-positivas, subtrair o valor médio dos controles não tratados de cada amostra.
    5. Calcule a média e o desvio padrão de cada parâmetro de todas as amostras replicantes e plotar os resultados em diagramas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

As pilhas humanas do glioblastoma U87 ou LN229 foram irradiadas com 4 GY da radiação do íon do Photon ou do carbono. Os níveis de γH2AX específicos do ciclo celular e apoptose foram medidos em diferentes pontos de tempo até 48 h após a irradiação utilizando o método citométrico de fluxo apresentado aqui (Figura 3). Em ambas as linhagens celulares, os íons de carbono induziram maiores níveis de pico de γH2AX que diminuíram mais lentamente e permaneceram significativamente elevados em 24 a 48 ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O método caracterizado é fácil de usar e oferece uma medida rápida, exata e reprodutível da resposta de dano do ADN que inclui a indução e o reparo da ruptura da dobro-Costa (DSB), os efeitos do ciclo de pilha e a morte da pilha apoptóticas. A combinação desses Endpoints fornece um quadro mais completo de suas inter-relações do que os ensaios individuais. O método pode ser amplamente aplicado como um ensaio de genotoxicidade abrangente nos campos de biologia de radiação, terapia e proteção, e mais geralmente em Oncologia...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a equipe de facilidade de citometria de fluxo no centro de pesquisa de câncer da Alemanha (DKFZ) por seu apoio.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1.000 µ L pontas de filtroNerbe plus07-693-8300
100-1.000 µ Pipeta LEppendorf3123000063
12 mm x 75 mm Tubos com Tampa do Filtro de Células, 35 µ m tamanho de poro de malhaBD Falcon352235
tubos de 15 mLBD Falcon352096
200 µ L pontas de filtroNerbe plus07-662-8300
20-200 µ L pipetaEppendorf3123000055
4',6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI)Sigma-AldrichD9542Dissolver em água a 200 µ g/mL e armazene alíquotas a -20 ° C
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Fosfo-3 Anticorpo, RRID: AB_2248011BioLegend613406Diluir 1:20
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Anticorpo, AB_1727414BD Pharmingen560626Diluir 1:20
BD FACSSosoluçãoLean BD BiosciencesPara rotina de limpeza de citômetros após medição
FACSSosolução de inseBD Biosciences340346Para rotina de limpeza do citômetro após a medição
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (PBS)BiochromL 182Dissolver em água até a concentração de 1x
Meio de Eagle modificado de Dulbecco com glutamina estávelBiochromFG 0415Material de cultura de células de rotina para a linha celular de exemplo usada no protocolo
Etanol absolutoVWR20821.330
Software ExcelMicrosoft
FBS Superior (soro fetal bovino)BiochromS 0615Material de cultura de células de rotina para a linha celular de exemplo usada no protocolo
FlowJo v10 softwareLLCpedido
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01Meio de incorporação para preparação opcional de lâminas microscópicas a partir de amostras coradas
Filtros de celulose dobrados, grau 3hwNeoLab11416
LSRII ou LSRCotômetro de orquestraBD Biosciences
MG132Calbiochem474787medicamento opcional para controle positivo de apoptose
Multifuge 3SR +Heraeus
ParaformaldeídoAppliChemA3813Prepare a solução a 4,5% fresca. Diluir em PBS aquecendo a 80 & C com agitação lenta sob a hotte. Cobrir o balão com folha de alumínio para evitar a perda de calor. Deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente e ajuste o volume final. Passe a solução por um filtro de celulose.
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639Cell Signaling Technology#3475Diluir 3:200
PIPETBOY acu 2Integra Biosciences155 016
Pipetas sorológicas, 10 mLCorning4488
Pipetas sorológicas, 25 mLCorning4489
Pipetas sorológicas, 5 mLCorning4487
SuperKillerTRAIL (ligante indutor de apoptose relacionado ao TNF modificado)BiomolAG-40T-0002-C020medicamento opcional para controle positivo de apoptose
Frascos de cultura de células T25Greiner bio-one690160Material de cultura de células de rotina para a linha celular de exemplo usada no protocolo
Tripsina/EDTAPAN BiotechP10-025500Material de cultura celular de rotina para a linha celular de exemplo usada no protocolo
Células de glioblastoma U87 MGATCCATCC-HTB-14Exemplo de linha celular usada no protocolo
340345 BD on-line

Referências

  1. Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122(2006).
  2. Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
  3. Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
  4. Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
  5. Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
  6. Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
  7. Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
  8. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  9. Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
  10. Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  11. Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
  12. Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
  13. Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
  14. Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119(2011).
  15. Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
  16. Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52(2012).
  17. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
  18. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
  19. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
  20. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035(2016).
  21. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645(2016).
  22. Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
  23. Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).
  24. Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
  25. Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
  26. Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
  27. Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
  28. Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  29. Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
  30. Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
  31. Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
  32. Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161(2017).
  33. Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130(2016).
  34. Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
  35. Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Análise do Ciclo CelularMedição de Gamma H2AXResposta a Danos no DNADetecção de ApoptoseParada do Ciclo CelularReparo de DSBFosfo-Histona H3Ativação da Caspase-3
Medição específica do ciclo celular de γH2AX e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.