Artigo de método

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

DOI:

10.3791/59980

⸱

15 de outubro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Iowa, 2Medical Scientist Training Program, University of Iowa, 3Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 4Graduate Program in Molecular Medicine, University of Iowa

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

É descrito aqui um procedimento de funcionamento padrão simplificado para o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica 16s rRNA e a análise usando ferramentas livremente disponíveis. Este protocolo ajudará os investigadores que são novos ao campo do microbioma assim como aqueles que exigem actualizações em métodos para conseguir o perfilamento bacteriano em uma definição mais elevada.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O intestino humano é colonizado por trilhões de bactérias que suportam funções fisiológicas, tais como metabolismo alimentar, colheita de energia, e regulação do sistema imunológico. A perturbação do microbioma intestinal saudável tem sido sugerida para desempenhar um papel no desenvolvimento de doenças inflamatórias, incluindo esclerose múltipla (MS). Fatores ambientais e genéticos podem influenciar a composição do microbioma; Portanto, a identificação de comunidades microbianas ligadas a um fenótipo de doença tornou-se o primeiro passo para a definição do papel do Microbiome na saúde e na doença. O uso do sequenciamento metagenomico de 16s rRNA para analisar a comunidade bacteriana tem ajudado no avanço da pesquisa de microbioma. Apesar de seu uso largo, não há nenhum protocolo uniforme para a análise de perfilação taxonômica 16S rRNA-baseada. Outra limitação é a baixa resolução da atribuição taxonômica devido a dificuldades técnicas, como leituras de sequenciamento menores, bem como o uso de apenas leituras Forward (R1) na análise final devido à baixa qualidade de leituras inversas (R2). Há necessidade de um método simplificado com alta resolução para caracterizar a diversidade bacteriana em um dado bioespécime. Os avanços na tecnologia de sequenciamento com a capacidade de sequenciar leituras mais longas em alta resolução ajudaram a superar alguns desses desafios. A tecnologia de sequenciamento atual combinada com um pipeline de análise metagenômica disponível publicamente, como o R-based divisive amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2), ajudou a avançar o perfil microbiano em alta resolução, pois DADA2 pode atribuir a sequência no gênero e níveis de espécies. Descrito aqui é um guia para a realização de perfis bacterianos usando a amplificação em duas etapas da região v3-v4 do gene 16S rRNA, seguido pela análise usando ferramentas de análise disponíveis livremente (i.e., DADA2, Phyloseq, e METAGENassist). Acredita-se que este fluxo de trabalho simples e completo servirá como uma excelente ferramenta para pesquisadores interessados em realizar estudos de perfilamento de microbioma.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microbiota refere-se a uma coleção de microrganismos (bactérias, vírus, archaea, bacteriófagos e fungos) vivendo em um ambiente particular, e o microbioma refere-se ao genoma coletivo de microrganismos residentes. Como as bactérias são um dos micróbios mais abundantes em humanos e camundongos, este estudo é focado apenas no perfil bacteriano. O intestino humano é colonizado por trilhões de bactérias e centenas de cepas bacterianas1. A microbiota intestinal normal desempenha um papel vital na manutenção de um estado saudável no hospedeiro, regulando as funções (ou seja, a manutenção de uma barreira do intestino intacto, metabolismo alimentar, homeostase energética, inibição da colonização por organismos patogénicos, e regulação das respostas imunes)2,3,4,5. As perturbações composicional da microbiota intestinal (disbiose intestinal) têm sido ligadas a uma série de doenças humanas, incluindo distúrbios gastrointestinais6, obesidade7,8, acidentevascular cerebral9, câncer10, diabetes8,11, artrite reumatóide12, alergias13, e doenças relacionadas ao sistema nervoso central, tais como esclerose múltipla (MS)14,15e Alzheimer doença (AD)8,16. Portanto, nos últimos anos, tem havido crescente interesse em ferramentas para identificar a composição bacteriana em diferentes locais do corpo. Um método confiável deve ter características como ser de alta produtividade e fácil de usar, ter a capacidade de classificar a microbiota bacteriana com alta resolução, e ser de baixo custo.

Técnicas microbiológicas baseadas na cultura não são sensíveis o suficiente para identificar e caracterizar o complexo microbioma intestinal devido à falha de várias bactérias intestinais para crescer na cultura. O advento da tecnologia baseada em sequenciamento, especialmente o seqüenciamento metagenomico baseado em rRNA 16s, superou alguns desses desafios e transformou a pesquisa em microbioma17. A avançada tecnologia de sequenciamento 16S rRNA tem ajudado a estabelecer um papel crítico para o microbioma intestinal na saúde humana. O projeto do microbioma humano, uma iniciativa nacional dos institutos de saúde18, e o projeto metahit (uma iniciativa européia)19 ajudaram a estabelecer um quadro básico para a análise do microbioma. Essas iniciativas ajudaram a iniciar vários estudos para determinar o papel do microbioma intestinal na saúde humana e na doença.

Vários grupos demonstraram disbiose intestinal em pacientes com doenças inflamatórias12,14,15,20,21,22. Apesar de ser amplamente utilizado para o perfilamento taxonômico devido à capacidade de multiplex e de baixos custos, não há nenhum protocolo uniforme para o perfilamento taxonômico 16S rRNA-baseado. Outra limitação é a baixa resolução da atribuição taxonômica devido às leituras de seqüenciamento menores (150 BP ou 250 BP) e o uso de apenas seqüenciamento de encaminhamento lido (R1) devido a leituras de seqüenciamento reverso de baixa qualidade (R2). No entanto, os avanços na tecnologia de sequenciamento ajudaram a superar alguns desses desafios, como a capacidade de sequenciar leituras mais longas usando leituras de extremidade emparelhada (por exemplo, Illumina MiSeq 2x300bp).

A tecnologia de sequenciamento atual pode sequenciar 600 BP leituras de boa qualidade, que permite a mesclagem de leituras R1 e R2. Essas leituras de R1 e R2 mais longas mescladas permitem melhores atribuições taxonômicas, especialmente com a plataforma de acesso livre com base em R divisive amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2). DADA2 utiliza atribuições baseadas em variante de sequência de amplicon (ASV) em vez de atribuições de unidade taxonômica operacional (OTU) com base na similaridade de 97% utilizada pelo QIIME23. As correspondências do ASV resultam em uma correspondência exata de sequência no banco de dados dentro de 1 a 2 nucleotídeos, o que leva à atribuição em níveis de gênero e espécie. Assim, a combinação de leituras mais longas, de boa qualidade pareadas e melhores ferramentas de atribuição taxonômica (como DADA2) transformaram estudos de microbioma.

Fornecido aqui é um guia passo-a-passo para a realização de perfis bacterianos usando a amplificação em duas etapas da região v3-v4 de rRNA 16S e análise de dados usando DADA2, Phyloseq e METAGENassist pipelines. Para este estudo, os camundongos transgênicos de classe II de Antígeno leucocitário humano (HLA) são usados, pois certos alelos HLA classe II estão vinculados a uma predisposição a doenças auto-imunes, como a MS20,24,25. Entretanto, a importância de genes da classe II de HLA em regular a composição da microbiota do intestino é desconhecida. Hipótese que a molécula da classe II de HLA influenciará a comunidade microbiana do intestino selecionando para bactérias específicas. Os camundongos Knockout de classe II (AE. ko) ou camundongos que expressam moléculas HLA-DQ8 humanas (HLA-DQ8)24,25,26 foram usados para compreender a importância das moléculas HLA classe II em moldar a comunidade microbiana do intestino. Acredita-se que este fluxo de trabalho completo e simplificado com análise de dados baseada em R servirá como uma excelente ferramenta para pesquisadores interessados em realizar estudos de perfilamento de microbioma.

A geração de camundongos que faltam genes de classe II Murina endógena de MHC (AE. KO) e AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * (HLA-DQ8) camundongos transgênicos com um fundo C57BL/6J tem sido descrito anteriormente26. Amostras fecais são coletadas de camundongos de ambos os sexos (8 – 12 semanas de idade). Os camundongos foram previamente criados e mantidos na instalação animal da Universidade de Iowa de acordo com o NIH e as diretrizes institucionais. Estratégias de controle de contaminação, como o desmame dos camundongos dentro de um armário de fluxo laminar, a mudança de luvas entre diferentes cepas de camundongos, e a manutenção adequada de camundongos são passos críticos para o perfilamento do microbioma intestinal.

O equipamento de proteção individual (EPI) adequado é altamente recomendado durante todo o procedimento. Controles negativos apropriados devem ser incluídos na realização de isolamento de DNA, amplificação PCR1 e PCR2 e etapas de sequenciamento. Recomenda-se o uso de suprimentos estéreis, livres de DNase, RNase e sem Pirogênios. O pipetador designado para o trabalho do microbioma e as pontas filtradas da pipeta devem ser usados durante todo o protocolo. A análise da microbiota consiste em sete etapas: 1) coleta e processamento de amostras fecais; 2) extração de DNA; 3) amplificação do gene 16S rRNA; 4) construção da biblioteca do ADN usando o PCR indexado; 5) limpeza e quantificação de PCR indexada (biblioteca); 6) sequenciamento de MiSeq; e 7) processamento de dados e análise de sequências. Um diagrama esquemático de todas as etapas do protocolo é mostrado na Figura 1.

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Protocolo

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O protocolo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Iowa.

1. coleta e manuseio de amostras fecais

  1. Esterilizar as caixas divisórias (ver tabela de materiais, Figura complementar 1) com 70% de etanol.
  2. Pré-rótulo de tubos de microcentrífuga (um por mouse) com o ID de amostra e grupo de tratamento (se aplicável).
  3. Coloc os ratos em umas caixas esterilizadas do divisor e permita que defecar normalmente para até 1 h.
  4. Colete as pelotas fecais em um tubo de microcentrífuga vazio, pré-rotulado de 1,5 mL usando fórceps estéril e feche o tubo firmemente. Esterilizar o fórceps após a coleta de cada rato.
  5. Coloque o tubo de microcentrífuga contendo pellets fecais em um freezer-80 ° c até o processamento adicional.
    Nota: As caixas do divisor são vantajosas porque permitem a coleção simultânea de amostras fecais dos ratos múltiplos (até 12) em uma vez.

2. extração de DNA

  1. Retire as amostras fecais (rato ou humano) do congelador e descongelar à temperatura ambiente (RT).
    Nota: É aconselhável descongelar amostras de fezes humanas durante a noite a 4 ° c, conforme necessário para coletar 200 mg ou a quantidade necessária de amostras de estoque.
  2. Use 200 mg de materiais de partida e DNA eluto para um volume final de 50 μL.
  3. Inclua um kit de isolamento de DNA em branco em que nenhuma amostra fecal é adicionada, mas é processada através de todas as etapas de extração de DNA.
    Nota: Utilizou-se um kit de isolamento de DNA específico (ver tabela de materiais), pois contém reagentes específicos para remover materiais inibidores como biossólidos, material vegetal não digerido e compostos heme de glóbulos vermelhos lisados presentes em fezes humanas e de rato Amostras.
  4. Coloc o tubo do grânulo em um homogeneizador (veja a tabela de materiais) e Homogeneize as amostras para 45 s em RT e uma velocidade de 4,5 m/s.
    Nota: Grânulo-batendo homogeneizador de qualquer fabricante pode ser usado. No entanto, recomenda-se padronizar o método, especificamente a velocidade e a duração da homogeneização, ao usar homogeneizador de batida de talão de outro fornecedor.
  5. Isole o DNA de amostras fecais de camundongo individuais usando um kit de isolamento de DNA bacteriano seguindo o protocolo do fabricante (ver tabela de materiais) com pequenas modificações. Quantificar o DNA isolado carregando 1 μL do DNA em um fluorímetro ou no chip de eletroforese de alta sensibilidade (ver tabela de materiais).
    Nota: O rendimento esperado do DNA pode variar de 500 – 2500 ng quando se inicia com 200 mg da amostra fecal.
  6. Ajuste a concentração de DNA para 4 – 20 ng/μL utilizando tampão de eluição. Requantify o ADN (como feito na etapa 2,5) antes de prosseguir à amplificação do gene do rRNA 16S (PCR1), se PCR1 não é executado no mesmo dia.

3. amplificação do gene do rRNA 16S (PCR1)

  1. Configurar a amplificação do gene 16S rRNA (PCR1) em uma placa de PCR 96 bem usando um volume de reação de 25 μL.
  2. Utilizando uma pipeta multicanal, adicionar 12,5 μL de 2x mistura de enzima polimerase de alta fidelidade, incluindo tampão, além de dNTPs (ver tabela de materiais): 40 ng de DNA em até 10,5 μL de volume total (ajustar o volume total com água de grau PCR): 1 μl (cada) de avanço e primers reversos a 1 μM de concentração.
    Nota: As sequências dos primers são as seguintes:
    Forward primer = 5 '-TCGTCGGCAGCGTCA GATGTGTATAAGAGA CAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3 ' primer reverso = 5 '-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTA TAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATC C-3 '. Inclua um jogo em branco da etapa 2,3 (controle do reagente do jogo) na placa do PCR.
  3. Sele a placa do PCR e Centrifugue em 1.000 x g em 20 ° c por 1 minuto em um centrifugador da placa do tabletop (veja a tabela dos materiais) e realize o PCR em um ciclador térmico programado para: 95 ° c por 3 minutos; 25 ciclos de 1) 95 ° c para 30 s, 2) 55 ° c para 30 s, 3) 72 ° c para 30 s; extensão final a 72 ° c por 5 min; e segure a 4 ° c.
    Nota: Embora este método de amplificação do gene 16S rRNA deva trabalhar com diferentes tipos de bioespécimes, é aconselhável padronizar o número de ciclos de amplificação ao iniciar um novo projeto.
  4. Confirme o tamanho do produto PCR1 carregando 1 μL do DNA em um chip de eletroforese de alta sensibilidade. Alternativamente, execute 5 μL do produto 16S rRNA-amplificado em um gel do agarose de 1,5% para confirmar 550 BP do produto PCR1.
    Nota: A limpeza do produto 16S rRNA amplificado é opcional e depende do kit de isolamento de DNA/método que está sendo usado. Se usando um método de isolamento de DNA em casa, PCR1 produto pode ser limpo utilizando um kit de purificação de DNA de microbioma conforme o protocolo do fabricante (ver tabela de materiais). O kit de isolamento de DNA utilizado aqui produz um DNA ultrapura e não requer limpeza do produto PCR1.

4. construção da biblioteca do ADN usando o PCR indexado (PCR2)

  1. Coloque o índice 1 e o índice 2 primers com código de barras em um rack especial (consulte tabela de materiais) para 96 bibliotecas.
    1. Organize o primer do índice 1 nas colunas 1 – 12 e primer do índice 2 nas linhas A – H do rack especial.
    2. Adicione 2,5 μL do índice 1 nas colunas 1 – 12 e primer do índice 2 nas linhas A – H usando pipetas multicanal. Coloque a nova tampa (ver tabela de materiais) no índice 1 e no índice 2 iniciadores de adoptor e guarde-o num congelador de-20 ° c.
  2. Utilizando uma pipeta multicanal, adicionar 12,5 μL de 2x mistura de enzima polimerase de alta fidelidade contendo um tampão, além de dNTPs (Ver tabela de materiais); 5 μL da água da classe do PCR e 2,5 μL do produto 16S rRNA-amplificado.
    Nota: Adicione índices exclusivos a cada amostra para multiplexação de mais de 96 bibliotecas em uma única execução, conforme descrito em Kiernan et al.27. O presente protocolo utiliza adaptadores de um kit comercial (por exemplo, NextEra XT index Kit) de acordo com as instruções do fabricante fornecidas no método de sequenciamento de metagenômica 16S (por exemplo, Illumina).
  3. Sele e Centrifugue a placa indexada do PCR em 1.000 x g em 20 ° c por 1 minuto e realize o PCR em um ciclador térmico programado para: 95 ° c por 3 minutos; 8 ciclos de 1) 95 ° c para 30 s, 2) 55 ° c para 30 s, 3) 72 ° c para 30 s; e extensão final a 72 ° c por 5 min.
  4. Confirme o tamanho 630 base do produto de PCR indexado carregando 1 μL de DNA em um chip de eletroforese de alta sensibilidade. Alternativamente, funcione 5 μL do produto indexado do PCR em um gel do agarose de 1,5% para confirmar o tamanho e a intensidade do produto.

5. limpeza do PCR indexado (PCR2) e quantificação

  1. Pool 5 μL de PCR2 amplicon usando pipetas multicanais de cada poço em uma bandeja de reservatório multicanal livre de DNase detectável, RNase, DNA humano e bactérias pirogênicas (ver tabela de materiais).
  2. Transfira o produto em pool da bandeja de reservatório multicanal para um tubo de microcentrífuga e Vortex vazio pré-rotulado de 1,5 mL para misturar.
  3. Purify o produto PCR2 usando o jogo magnético padrãodos grânulos (veja a tabela de materiais) como por a instrução do fabricante. Sele e armazene os 20 μL restantes de PCR2 na mesma placa em-80 ° c para uma utilização mais adicional, se necessário.
  4. Prepare o etanol fresco de 80% adicionando 4 mL de etanol a 100% a 1 mL de água de grau PCR.
  5. Equilibre o cordão magnético para RT e Vortex para 30 s para dispersar as contas uniformemente.
  6. Momentaneamente Vortex e gire para baixo as amostras agrupadas do amplicon PCR2.
  7. Adicione 80 μL de grânulos magnéticos em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL pré-rotulado e estéril com 80 μL de produtos de PCR agrupados, depois vórtice e gire brevemente para resuspender uniformemente os grânulos magnéticos.
  8. Incubar o conteúdo em RT sem perturbar os tubos por 15 min.
  9. Coloque o tubo com o DNA e os grânulos magnéticos em um suporte magnético (Ver tabela de materiais) por 5 min.
  10. Retire e elimine cuidadosamente 150 μL do sobrenadante.
  11. Adicionar 200 μL de etanol preparado na hora 80% sem perturbar os grânulos e incubar por 30 s.
  12. Retire cuidadosamente e descarte todo o sobrenadante.
  13. Repita os passos 5.11 – 5.12. Retire o volume restante com uma pipeta P10. Deixe os grânulos secar ao ar por 15 minutos, com o tubo do PCR do índice restante no carrinho magnético.
  14. Retire do suporte magnético. Adicionar 33 μL de tampão de eluição (o tampão de eluição do kit DNA é aceitável). Vortex bem, e executar uma rotação rápida para remover qualquer líquido remanescente no lado. Incubar por 2 min e coloque no suporte magnético por 5 min.
  15. Transfira 30 μL do sobrenadante (produtos de PCR limpos) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL pré-rotulado.
  16. Quantifique a piscina purificada carregando 1 μL da piscina purificada em um fluorímetro ou chip de eletroforese de alta sensibilidade, pois isso será necessário durante o seqüenciamento. Execute MiSeq conforme detalhado abaixo.

6. sequenciamento de MiSeq

  1. Crie uma folha de amostra contendo informações de código de barras específicas de amostra para fluxo de trabalho de metagenômica e demultiplexação no instrumento MiSeq (Consulte tabela de materiais). Faça o upload desta folha de amostra para o software (por exemplo, Illumina Experiment Manager).
  2. Diluir as bibliotecas agrupadas da etapa 5,15 para 4 nM.
  3. As bibliotecas agrupadas de denature combinando 5 μL do pool da biblioteca de 4 nanômetro com 5 μL de NaOH recentemente preparado de 0,2 M em um tubo do microcentrifugador de 1,5 mL. Vortex brevemente para misturar, centrifugar brevemente e incubar por 5 min em ambiente RT.
  4. Adicionar 990 μL de tampão de hibridação gelada (tampão HB) e pipetar suavemente para misturar. Isso produzirá uma biblioteca de 20 pM.
  5. Combine 2 μL da biblioteca de controle de 10 nM com 3 μL de tampão EBT (10 mM de Tris-HCl, pH = 8,5, com 0,1% de Tween 20) para produzir uma biblioteca de controle de 4 nM. Adicione 5 μL de NaOH 0,2 N recém-preparados e vórtice brevemente para misturar. Incubar por 5 min em RT.
  6. Adicionar 990 μL de tampão de hibridação gelada (tampão HB) e pipetar suavemente para misturar. Isso produzirá 20 bibliotecas de controle pM.
    Nota: as bibliotecas de controle denatured 20 pM podem ser armazenadas em-20 ° c até por 4 semanas. Após 4 semanas, os números de cluster tendem a diminuir.
    1. Combine 210 μL da biblioteca de 20 pM com 40 μL da biblioteca de controle de 20 pM (concentração final = ~ 18%), e adicione 350 μL de tampão HB. Carregar a biblioteca em uma concentração final de 7 pM.
      Nota: Detalhes de entrada devem ser ajustados de acordo com o desempenho de execução.
  7. Incubar amostras durante 2 min a 96 ° c. Colocar gelo por 5 min. carregar 600 μL do conjunto final no poço adequado dos cartuchos de MiSeq.
    Nota: A seção 6 acima pode ser executada em uma instalação do núcleo de Genomic/DNA.

7. processamento de dados e análise de sequências

  1. Use o software R (versão 3,5) para processamento e análise de dados do DADA2. Para as etapas 7.1 – 7.4, use o software de acesso aberto conforme descrito no tutorial online desenvolvido anteriormente DADA2 encontrado em < https://benjjneb.github.Io/dada2/tutorial.html >.
    Nota: Um script R prontamente utilizável foi anexado como um arquivo suplementar 2, e os usuários devem alterar o nome e a origem dos arquivos de seqüenciamento (por exemplo, SAMPLENAME_R1_001. fastq e SAMPLENAME_R2_001. fastq).
  2. Visualize os perfis de qualidade das leituras Forward e Reverse usando o comando Plotqualityprofile .
  3. Aparar nucleotídeos de leituras para frente e para trás com base no gráfico de qualidade. Esses parâmetros são especificados pelo parâmetro truncLen em DADA2.
    Nota: Aqui, 280 é usado como o limite de comprimento para o qual as leituras de encaminhamento seriam descartadas e 260 é usado como o limite de comprimento para o qual as leituras reversas seriam descartadas.
  4. Processe os dados brutos de 16S como arquivos fastq pelo pipeline DADA2 conforme descrito no tutorial on-line (encontrado em < https://benjjneb.github.Io/dada2/tutorial.html >) para mesclar as leituras R1 e R2 e as variantes de sequência de amplicon (ASVs), que são usadas para atribuir com o banco de dados de referência da Silva23.
    Nota: uma tabela de variante de sequência de amplicon de exemplo gerada a partir do pipeline DADA2 está incluída como ficheiro suplementar 3. Um banco de dados de referência da Greengene ou Silva pode ser usado, pois não foram encontradas diferenças na classificação bacteriana usando qualquer uma dessas bases de dados.
  5. Gere um arquivo de mapeamento definido pelo usuário que contenha os metadados (ou seja, genótipo, sexo, tratamento, etc.) para cada amostra. Um arquivo de metadados de exemplo foi incluído como arquivo suplementar 4.
  6. Calcule a diversidade alfa (índice de Shannon) e a diversidade beta usando a análise de coordenadas principais (PCA) com base nas contagens de Otu rarefeito usando phyloseq28 conforme descrito no tutorial on-line, encontrado em < https://benjjneb.github.Io/dada2/tutorial.html >.
  7. Realize a seguinte análise no METAGENassist29.
    Nota:     realize a análise de abundância diferencial usando o teste de Rank-Sum de Wilcoxon no nível do gênero. Mapas de calor e táxons diferencialmente abundantes são destacados usando o METAGENassist29, um pipeline de análise disponível publicamente e baseado na Web.
    1. Carregue a tabela de abundância taxonômica (formato CSV) e selecione amostras na coluna.
    2. Carregue o arquivo de mapeamento (formato CSV) e selecione amostras em uma linha.
    3. Selecione opções para remover variáveis com mais de 50% de zeros e exclua leituras não atribuídas e não mapeadas.
    4. Selecione opções para normalizar linhas por soma e log normalizar colunas.
    5. Faça um gráfico de vulcão, PCA ou plsda clicando no mesmo na coluna da esquerda e clique em remover nome de amostras para fazer o gráfico.
    6. Realize um teste t(se apenas dois grupos) ou ANOVA (se maior que dois grupos) para visualizar os recursos (bactérias) que diferem entre os grupos. Clique em feições selecionadas para visualizar bactérias específicas que diferem entre os grupos.
    7. Clique em Dendrogram ou mapa de calor para criar respectivos gráficos. A análise adicional, como a visualização de amostra por grupos ou os recursos do Top 25 com base em t-Test/ANOVA, pode ser realizada.
    8. Clique em Randomforest para criar gráficos mostrando recursos que podem ser usados para classificação. Clique na guia variância na parte superior para criar gráficos para os principais recursos que diferem entre/entre grupos. Clique em detalhes do recurso para ver uma lista de bactérias que diferem entre os grupos e clique em cada bactéria para criar um resumo gráfico do mesmo.
    9. Clique na guia outlier na parte superior para Visualizar amostras que são outliers.
    10. Finalmente, clique em baixar e selecione 1) um arquivo ZIP contendo toda a análise realizada ou 2) os recursos desejados para download. Este arquivo deve ser salvo como um nome exclusivo e precisará ser descompactado antes de usar.

Nota: Para os testes estatísticos detalhados realizados durante a análise do microbioma, consulte as obras de Chen et al. e hugerth et al.14,30.

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Resultados

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Como as moléculas da classe II de MHC (HLA nos seres humanos) são os jogadores centrais na resposta imune adaptativa e mostram associações fortes com uma predisposição a MS24,25,26, foi supor que a molécula da classe II de HLA influenciaria a composição microbiana do intestino. Conseqüentemente, os ratos que faltam o gene da classe II de MHC (AE. KO) ou expressando o gene humano de HLA-DQ8 (HLA-DQ8) foram utilizados para compree...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo descrito é simples, com etapas fáceis de seguir para executar o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica de 16s rRNA de um grande número bioespécimes do interesse. O sequenciamento da próxima geração transformou estudos de ecologia microbiana, especialmente em modelos de doenças humanas e pré-clínicas31,32. A principal vantagem desta técnica é a sua capacidade de analisar com sucesso composições microbianas complexas (micróbios cu...

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Divulgações

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A. M. recebeu royalties da Mayo Clinic (pago pela Evelo Biosciences) como um dos inventores de uma tecnologia reivindicando o uso de Prevotella histicola para o tratamento de doenças auto-imunes.

Agradecimentos

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Os autores reconhecem o financiamento do NIAID/NIH (1R01AI137075-01), o Carver Trust Medical Research Initiative Grant, e do centro de pesquisa de ciências ambientais de saúde da Universidade de Iowa, NIEHS/NIH (p30 ES005605).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de Microcentríguo Natural de 1,5 mLEUA, Scientific1615-5500Coleta fecal
Rodo de borracha 3M aplicador manual PA1-G3M, MN, USEspremedor para vedação adequada da placa de PCR
Agencourt AMPure XPBeckman Coulter, IN, EUAA63880Purificação de PCR, Limpeza NGS, Limpeza de PCR
Agilent DNA 1000 REAGENTEAgilent Technologies, CA, EUA5067-1504Quantificação de DNA e controle de qualidade
Bioanalisador DNA 1000 chipAgilent Technologies, CA, EUA5067-1504Quantificação de DNA e controle de qualidade
Tampas de substituição do adotante do índiceIllumina, Inc., CA, EUA15026762Nova tampa para o primer do adotante do índice 1 e 2
DNeasy PowerLyzer PowerSoil KitMoBio agora parte da QIAGEN, Valencia, CA, EUA12855-100DNA isolamento
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x)Kapa Biosystem, MA, EUAKK2602PCR pronto para Amplicon PCR1 e Indexado PCR2
Divider BoxesLewis Bins, WI, USND03080Coleção Fecal
Suporte magnéticoNew England BioLabs, MA, EUAS1509SPara limpeza de PCR
MicroAmp Placa de reaçãoóptica rápida de 96 poçosApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, EUAPlaca dePCR
Filme Adesivo Óptico MicroAmpApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, EUACentrífuga 4311971Seladora de Placas de PCR
Microfuge 20 CentrífugaBeckman Coulter, IN, EUACentrífuga B30154usada para isolamento de DNA
Kit de reagentes MiSeq (600 ciclos) v.3Illumina, Inc., CA, EUAMS-102-3003Para sequenciamento MiSeq
Nextera XT DNA Library Preparation KitIllumina, Inc., CA, EUAFC-131-100116S rRNA DNA Library
Preparation Reagent Reservoirs MultichannelTrays ASI, FL,USARS71-1Para agrupamento de placas de produtos PCR2
CetrifugeThermo Fisher Scientific, CA, USA75004393Para mistura de reagentes PCR e remoção de bolhas de ar da placa
PhiX ControlIllumina, Inc., CA, EUAFC-110-3001Para controle de sequenciamento MiSeq
Kit de purificação de DNA de microbiomaThermo Fisher Scientific, CA, EUAA29789Para purificação do produto PCR1
PowerLyzer 24 HomogeneizadorOmni International, GA, EUA19-001Batedor de contas para isolamento de DNA
Qubit dsDNA HS (alta sensibilidade) kit de ensaioThermo Fisher Scientific, CA, EUAQ32854Quantificação de DNA
TruSeq Index Plate FixtureIllumina, Inc., CA, USAFC-130-1005Para organizar os primers de índice
Divisores verticais (grandes)Lewis Bins, WI, USDV-2280Coleção fecal
Divisores verticais (pequenos)Lewis Bins, WI, USDV-1780Coleção fecal
7100038651 Lewis 4346906

Referências

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