Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

Resumo

É descrito aqui um procedimento de funcionamento padrão simplificado para o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica 16s rRNA e a análise usando ferramentas livremente disponíveis. Este protocolo ajudará os investigadores que são novos ao campo do microbioma assim como aqueles que exigem actualizações em métodos para conseguir o perfilamento bacteriano em uma definição mais elevada.

Resumo

O intestino humano é colonizado por trilhões de bactérias que suportam funções fisiológicas, tais como metabolismo alimentar, colheita de energia, e regulação do sistema imunológico. A perturbação do microbioma intestinal saudável tem sido sugerida para desempenhar um papel no desenvolvimento de doenças inflamatórias, incluindo esclerose múltipla (MS). Fatores ambientais e genéticos podem influenciar a composição do microbioma; Portanto, a identificação de comunidades microbianas ligadas a um fenótipo de doença tornou-se o primeiro passo para a definição do papel do Microbiome na saúde e na doença. O uso do sequenciamento metagenomico de 16s rRNA para analisar a comunidade bacteriana tem ajudado no avanço da pesquisa de microbioma. Apesar de seu uso largo, não há nenhum protocolo uniforme para a análise de perfilação taxonômica 16S rRNA-baseada. Outra limitação é a baixa resolução da atribuição taxonômica devido a dificuldades técnicas, como leituras de sequenciamento menores, bem como o uso de apenas leituras Forward (R1) na análise final devido à baixa qualidade de leituras inversas (R2). Há necessidade de um método simplificado com alta resolução para caracterizar a diversidade bacteriana em um dado bioespécime. Os avanços na tecnologia de sequenciamento com a capacidade de sequenciar leituras mais longas em alta resolução ajudaram a superar alguns desses desafios. A tecnologia de sequenciamento atual combinada com um pipeline de análise metagenômica disponível publicamente, como o R-based divisive amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2), ajudou a avançar o perfil microbiano em alta resolução, pois DADA2 pode atribuir a sequência no gênero e níveis de espécies. Descrito aqui é um guia para a realização de perfis bacterianos usando a amplificação em duas etapas da região v3-v4 do gene 16S rRNA, seguido pela análise usando ferramentas de análise disponíveis livremente (i.e., DADA2, Phyloseq, e METAGENassist). Acredita-se que este fluxo de trabalho simples e completo servirá como uma excelente ferramenta para pesquisadores interessados em realizar estudos de perfilamento de microbioma.

Introdução

A microbiota refere-se a uma coleção de microrganismos (bactérias, vírus, archaea, bacteriófagos e fungos) vivendo em um ambiente particular, e o microbioma refere-se ao genoma coletivo de microrganismos residentes. Como as bactérias são um dos micróbios mais abundantes em humanos e camundongos, este estudo é focado apenas no perfil bacteriano. O intestino humano é colonizado por trilhões de bactérias e centenas de cepas bacterianas¹. A microbiota intestinal normal desempenha um papel vital na manutenção de um estado saudável no hospedeiro, regulando as funções (ou seja, a manutenção de uma barreira do intestino intacto, metabolismo alimentar, ....

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Iowa.

1. coleta e manuseio de amostras fecais

1. Esterilizar as caixas divisórias (ver tabela de materiais, Figura complementar 1) com 70% de etanol.
2. Pré-rótulo de tubos de microcentrífuga (um por mouse) com o ID de amostra e grupo de tratamento (se aplicável).
3. Coloc os ratos em umas caixas esterilizadas do divisor e permita que defecar normalmente para até 1 h.
4. Colete as pelotas fecais em um tubo de microcentrífuga vazio, pré-rotulado de 1,5 mL usando fórceps estéril e fec....

Resultados

Como as moléculas da classe II de MHC (HLA nos seres humanos) são os jogadores centrais na resposta imune adaptativa e mostram associações fortes com uma predisposição a MS^24,25,26, foi supor que a molécula da classe II de HLA influenciaria a composição microbiana do intestino. Conseqüentemente, os ratos que faltam o gene da classe II de MHC (AE. KO) ou expressando o gene humano de HLA-DQ8 (HLA-DQ8) foram utilizados para compree.......

Discussão

O protocolo descrito é simples, com etapas fáceis de seguir para executar o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica de 16s rRNA de um grande número bioespécimes do interesse. O sequenciamento da próxima geração transformou estudos de ecologia microbiana, especialmente em modelos de doenças humanas e pré-clínicas^31,32. A principal vantagem desta técnica é a sua capacidade de analisar com sucesso composições microbianas complexas (micróbios cu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de Microcentríguo Natural de 1,5 mL	EUA, Scientific	1615-5500	Coleta fecal
Rodo de borracha 3M aplicador manual PA1-G	3M, MN, US		Espremedor para vedação adequada da placa de PCR
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter, IN, EUA	A63880	Purificação de PCR, Limpeza NGS, Limpeza de PCR
Agilent DNA 1000 REAGENTE	Agilent Technologies, CA, EUA	5067-1504	Quantificação de DNA e controle de qualidade
Bioanalisador DNA 1000 chip	Agilent Technologies, CA, EUA	5067-1504	Quantificação de DNA e controle de qualidade
Tampas de substituição do adotante do índice	Illumina, Inc., CA, EUA	15026762	Nova tampa para o primer do adotante do índice 1 e 2
DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit	MoBio agora parte da QIAGEN, Valencia, CA, EUA	12855-100	DNA isolamento
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x)	Kapa Biosystem, MA, EUA	KK2602	PCR pronto para Amplicon PCR1 e Indexado PCR2
Divider Boxes	Lewis Bins, WI, US	ND03080	Coleção Fecal
Suporte magnético	New England BioLabs, MA, EUA	S1509S	Para limpeza de PCR
MicroAmp Placa de reação	óptica rápida de 96 poçosApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, EUA	Placa de	PCR
Filme Adesivo Óptico MicroAmp	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, EUA	Centrífuga 4311971	Seladora de Placas de PCR
Microfuge 20 Centrífuga	Beckman Coulter, IN, EUA	Centrífuga B30154	usada para isolamento de DNA
Kit de reagentes MiSeq (600 ciclos) v.3	Illumina, Inc., CA, EUA	MS-102-3003	Para sequenciamento MiSeq
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina, Inc., CA, EUA	FC-131-1001	16S rRNA DNA Library
Preparation Reagent Reservoirs Multichannel	Trays ASI, FL,USA	RS71-1	Para agrupamento de placas de produtos PCR2
Cetrifuge	Thermo Fisher Scientific, CA, USA	75004393	Para mistura de reagentes PCR e remoção de bolhas de ar da placa
PhiX Control	Illumina, Inc., CA, EUA	FC-110-3001	Para controle de sequenciamento MiSeq
Kit de purificação de DNA de microbioma	Thermo Fisher Scientific, CA, EUA	A29789	Para purificação do produto PCR1
PowerLyzer 24 Homogeneizador	Omni International, GA, EUA	19-001	Batedor de contas para isolamento de DNA
Qubit dsDNA HS (alta sensibilidade) kit de ensaio	Thermo Fisher Scientific, CA, EUA	Q32854	Quantificação de DNA
TruSeq Index Plate Fixture	Illumina, Inc., CA, USA	FC-130-1005	Para organizar os primers de índice
Divisores verticais (grandes)	Lewis Bins, WI, US	DV-2280	Coleção fecal
Divisores verticais (pequenos)	Lewis Bins, WI, US	DV-1780	Coleção fecal

7100038651 Lewis 4346906