Identificação de RNAs circulares usando sequenciamento de RNA

Shobana Sekar; Philipp Geiger; Lori Cuyugan; Annalee Boyle; Geidy Serrano; Thomas G. Beach; Winnie S. Liang

doi:10.3791/59981

Artigo de método

Identificação de RNAs circulares usando sequenciamento de RNA

DOI:

10.3791/59981

⸱

14 de novembro de 2019

Shobana Sekar¹^,² , Philipp Geiger¹^,² , Lori Cuyugan¹^,² , Annalee Boyle¹^,² , Geidy Serrano²^,³ , Thomas G. Beach²^,³ , Winnie S. Liang¹^,²

¹Translational Genomic Research Institute, ²Arizona Alzheimer's Consortium, ³Banner Sun Health Research Institute

Neste artigo

Resumo

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RNAs circulares (circRNAs) são RNAs não codificadores que podem ter papéis na regulação transcricional e mediar interações entre proteínas. Após a avaliação de diferentes parâmetros para a construção de bibliotecas de sequenciamento circRNA, um protocolo foi compilado utilizando a preparação total da biblioteca de RNA com o pré-tratamento RNase R e é apresentado aqui.

Resumo

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RnAs circulares (circRNAs) são uma classe de RNAs não codificadores envolvidos em funções como regulação de microRNA (miRNA), mediação de interações proteína-proteína e regulação da transcrição do gene parental. Na próxima geração clássica de sequenciamento de RNA (RNA-seq), os circRNAs são tipicamente negligenciados como resultado da seleção poli-A durante a construção de bibliotecas de mRNA, ou são encontrados em abundância muito baixa e, portanto, são difíceis de isolar e detectar. Aqui, um protocolo de construção da biblioteca circRNA foi otimizado comparando kits de preparação de bibliotecas, opções de pré-tratamento e vários valores totais de insumos de RNA. Dois kits de preparação de bibliotecas de transcriptoma inteira comercialmente disponíveis, com e sem pré-tratamento RNase R, e usando quantidades variáveis de entrada total de RNA (1 a 4 μg), foram testados. Por último, vários tipos de tecido; incluindo fígado, pulmão, nólina linfática e pâncreas; bem como várias regiões cerebrais; incluindo o cerebelo, o lóbulo parietal inferior, o giro temporal médio, o córtex occipital e o giro frontal superior; foram comparados para avaliar a abundância circRNA em todos os tipos de tecido. A análise dos dados gerados de RNA-seq usando seis ferramentas diferentes de detecção de circRNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC e CIRCexplorer) revelou que um kit de preparação total de biblioteca de RNA encalhado com pré-tratamento RNase R e 4 μg de entrada de RNA é o ideal método para identificar o maior número relativo de circRNAs. Consistente com os resultados anteriores, o maior enriquecimento de circRNAs foi observado em tecidos cerebrais em comparação com outros tipos de tecido.

Introdução

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RNAs circulares (CircRNAs) são RNAs endógenos e não codificadores que ganharam atenção dada a sua expressão generalizada no transcriptoma eucariótico^1,^2,³. Eles são formados quando exons back-splice uns aos outros e, portanto, foram inicialmente considerados como estandecendo artefatos⁴^,⁵. No entanto, estudos recentes demonstraram que circRNAs exibem espécies, tecidos e expressão específica em estágio de desenvolvimento^3,⁶ e são conservadas evolutivamente

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Protocolo

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Esta pesquisa tem sido realizada em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. Os tecidos cerebrais foram obtidos a partir do Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program em Sun City, AZ. As operações do Programa de Doação de Cérebros e Corpos são aprovadas pelo Western Institutional Review Board (protocolo WIRB #20120821). Todos os sujeitos ou seus representantes legais assinaram o consentimento informado. Bioespécimes comerciais (não cerebrais) foram comprados da Proteogenex.

1. RNase R Tratamento

Nota: Nas etap....

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Resultados

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Os dados gerados usando um RNA universal comercialmente disponível do controle (UC) e usando dois jogos da preparação da biblioteca, ambos que incluem uma etapa do ribo-esgotamento em seus protocolos, foram avaliados primeiramente. Usando um fluxo de trabalho analítico (fluxo de trabalho de análise de dados, seção 4), em geral, um maior número de circRNAs foi detectado nos conjuntos de dados truseq em comparação com os Kapa(Figura 1). Embora os percentuais de RNA ribossômico (rRNA) estivesse.......

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Discussão

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Neste estudo, dois kits de preparação de bibliotecas comercialmente disponíveis, opções de pré-tratamento e quantidades de RNA de entrada foram testados para otimizar um protocolo de enriquecimento circRNA para a construção de bibliotecas de sequenciamento circRNA. Com base nas avaliações deste estudo, uma série de aspectos-chave e medidas críticas na criação de bibliotecas de sequenciamento circRNA são aparentes. Nossa avaliação confirma a utilidade do pré-tratamento RNase R, como refletido pelo aumento do número de cir.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Estamos gratos ao Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) de Sun City, Arizona para o fornecimento de tecidos cerebrais humanos. O BBDP tem sido apoiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson's Disease and Related Disorders), o National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer's Disease Core Center), o Arizona Department of Health Services (contrato 211002, Arizona Alzheimer's Research Center), o Arizona Biomedical Research Commission (contratos 4001, 0011, 05-901 e 1001 para o Arizona Parkinson's Disease Consortium) e mic....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1.000 µ ponteiras de pipeta L	Rainin	GP-L1000F
20 µ ponteiras de pipeta L	Rainin	SR L 10F
200 µ Pontas de pipeta L	Rainin	SR L 200F
2200 TapeStation Acessórios (tampas de folha)	Agilent Technologies	5067-5154
2200 TapeStation Acessórios (pontas)	Agilent Technologies	5067-5153
Filme adesivo para microplacas	VWR	60941-064
AMPure XP Beads 450 mL	Beckman Coulter	A63882	PCR purificação
Placas de PCR de 96 poços Eppendorf twin.tec	VWR	951020401
Reagentes D1000 de alta sensibilidade	Agilent Technologies	5067-5585
Fita de tela D1000 de alta sensibilidade	Agilent Technologies	5067-5584
HiSeq 2500 Sistema de sequenciamento	Illumina	SY-401-2501
HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit	Illumina	PE-410-1001
HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 ciclos)	Illumina	FC-410-1002
HiSeq 4000 Sistema de Sequenciamento	Illumina	SY-401-4001
HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2	Illumina	PE-402-4002
HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 ciclos)	Illumina	FC-402-4022
Kapa Total RNA Kit	Roche	KK8400
Etanol de grau de biologia molecular	de Tubos de Ensaio de Qubit de BP28184		Fisher Scientific
	por Thermo Fischer	Q32856
Qubit dsDNA High Sense Assay Kit	Centro de Fornecimento por Thermo Fischer	Q32854
Limpeza e concentrador de RNA - 5	Zymo	RCC-100	Contém colunas de purificação, tubos de coleta
Contas RNAClean XP	Beckman Coulter Genomics		RNA Cleanup Beads
Rnase R	Lucigen	RNR07250
SuperScript II Transcriptase Reversa 10.000 unidades	ThermoFisher (LifeTech)	18064014
TapeStation 2200	Agilent Technologies		Analisador de ácido nucleico
TElowE	VWR	10128-588
Kit de Preparação de Biblioteca de RNA Total Encalhado TruSeq	Kit	de 20020596	Illumina usado na seção 3
Bandeja Dividida de Dois Compartimentos	VWR	3054-1004
Água UltraPure	por Thermo Fischer	10977-015
Controle Universal RNA	Agilent	740000

Centro de Fornecimento da Centro de Abastecimento de

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733(2012).
Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant....

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Tratamento com RNase R Prepara o de Biblioteca Quantidade de RNA Total An lise de Tecido Cerebral Ferramentas de Detec o de circRNA Kit TruSeq Kit KAPA Compara o de Tecidos

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