Este artigo apresenta um método para estudar o tráfico de receptores de glutamato (GluR) em culturas hipocampais primárias dissociadas. Usando uma abordagem de alimentação de anticorpos para rotular receptores endógenos ou superexpressos em combinação com abordagens farmacológicas, este método permite a identificação de mecanismos moleculares que regulam a expressão da superfície GluR modulando processos de internalização ou reciclagem.
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Artigo de método
Uma abordagem de alimentação de anticorpos para estudar o tráfico de receptores de glutamato em culturas hipocampais primárias dissociadas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Respostas celulares a estímulos externos dependem fortemente do conjunto de receptores expressos na superfície celular em um determinado momento. Assim, a população de receptores de superfície expressa está constantemente se adaptando e sujeita a rigorosos mecanismos de regulação. O exemplo paradigmático e um dos eventos de tráfico mais estudados em biologia é o controle regulado da expressão sináptica de receptores de glutamato (GluRs). Os GluRs mediam a grande maioria da neurotransmissão excitatória no sistema nervoso central e controlam mudanças funcionais e estruturais dependentes da atividade fisiológica nos níveis sinápticos e neuronais (por exemplo, plasticidade sináptica). As modificações no número, na posição, e na composição do subunidade de glurs expressados superfície afetam profundamente a função neuronal e, de facto, as alterações nestes fatores são associadas com os neuropathies diferentes. Aqui apresentamos um método para estudar o tráfico de GluR em neurônios primários hipocampais dissociados. Uma abordagem de "alimentação de anticorpos" é usada para visualizar diferencialmente as populações de GluR expressas na superfície e nas membranas internas. Ao rotular receptores de superfície em células ao vivo e fixá-los em momentos diferentes para permitir a endocitose e/ou reciclagem de receptores, esses processos de tráfico podem ser avaliados e seletivamente estudados. Este é um protocolo versátil que pode ser usado em combinação com abordagens farmacológicas ou superexpressão de receptores alterados para obter informações valiosas sobre estímulos e mecanismos moleculares que afetam o tráfico de GluR. Similarmente, pode facilmente ser adaptado para estudar outros receptores ou proteínas expressadas superfície.
Introdução
As células utilizam o processo ativo de tráfico para mobilizar proteínas para localizações subcelulares específicas e exercer rigorosa regulação espaciotemporal sobre sua função1. Esse processo é especialmente importante para os receptores transmembranares, pois as respostas celulares a diferentes estímulos ambientais dependem de cascatas intracelulares desencadeadas pela ativação do receptor. As células são capazes de modificar essas respostas alterando a densidade, localização e composição da subunidade de receptores expressos na superfície celular através da regulação do tráfico subcelular receptor2. A inserção de rec....
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Protocolo
O trabalho relativo à preparação da cultura preliminar hippocampal foi revisto e aprovado pelo Comitê do cuidado animal e do uso da Universidade de Northwestern (protocolo #IS00001151).
1. preparação antes da rotulagem
-
Preparação e manutenção de culturas hipocampais primárias
- Prepare culturas hippocampal preliminares em uma densidade de 150.000 pilhas chapeadas em poli-D-lysine-revestido (0,1 mg/mL) 18 milímetros cobrem vidros. Excelentes guias para a preparação da cultura neuronal dissociada estão disponíveis7,8.
Nota: Se ne....
- Prepare culturas hippocampal preliminares em uma densidade de 150.000 pilhas chapeadas em poli-D-lysine-revestido (0,1 mg/mL) 18 milímetros cobrem vidros. Excelentes guias para a preparação da cultura neuronal dissociada estão disponíveis7,8.
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Resultados
Este protocolo para estudar o tráfico de receptores de glutamato é baseado na rotulagem diferencial dos receptores expressos na superfície celular e naqueles expressos em membranas internas. A segregação é conseguida pela rotulagem dos receptores antes e após a permeabilização da membrana, utilizando o mesmo anticorpo primário, mas um anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo diferente. Como descrito pelas etapas opcionais incluíram o protocolo, trata-se de um método muito versátil.......
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Discussão
A interação entre uma célula e seu ambiente (por exemplo, comunicação com outras células, resposta a diferentes estímulos, etc.), depende fortemente da expressão correta dos receptores na superfície celular. O Regulamento rápido e fino-ajustado no conteúdo superfície-expressado do receptor permite a resposta celular apropriada a um ambiente constantemente em mudança. No caso particular dos neurônios, alterações no número, localização, e composição subunidade de receptores sináticamente expressos influencia fortemente a c.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos ao centro noroeste de microscopia avançada para o uso do microscópio Nikon a1 confocal e sua assistência no planejamento e análise dos experimentos. Esta pesquisa foi apoiada por NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), e NIA (R00AG041225) e um jovem investigador NARSAD Grant do cérebro & Fundação de pesquisa do comportamento (#24133) (A. S.-C.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 18 mm de diâmetro. #1.5 óculos de cobertura de espessura | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugado cabra anti-rato secundário | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugado cabra anti-coelho secundário | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugado cabra anti-rato secundário | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugado cabra anti-coelho secundário | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Placas de Cultura de Células de Fundo Plano | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glicose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Cabra anti-coelho Fab fragmentos | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamina | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anticorpo anti-GluA1 | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Mídia neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxina | Tocris | 1128 | |
| Bromidrato de poli-D-lisina | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Anticorpo anti-GFP para coelho | Invitrogen | A11122 | |
| Anticorpo anti-PSD-95 para coelho | Sinalização celular | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sacarose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost mais lâminas de microscópio | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
Referências
- Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
- Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. , Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
- Diering, G. H., H....
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Reimpressões e permissões
