Murine Modelo de Transplante de Aorta Cervical usando uma técnica de manguito não sutura modificada

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo de transplante heterotópico da aorta em camundongos usando a técnica de manguito não sutura em um modelo de urina cervical. Este modelo pode ser usado para estudar a patologia subjacente da vasculopatia aloenxerto crônica (CAV) e pode ajudar a avaliar novos agentes terapêuticos, a fim de evitar a sua formação.

Resumo

Com a introdução de poderosos protocolos imunossupressores, avanços distintos são possíveis na prevenção e terapia de episódios de rejeição aguda. No entanto, apenas pequenas melhorias nos resultados a longo prazo de órgãos sólidos transplantados puderam ser observadas nas últimas décadas. Nesse contexto, a vasculopatia crônica do aloenxerto (CAV) ainda representa a principal causa de insuficiência de órgãos tardia em transplante cardíaco, renal e pulmonar.

Até agora, a patogênese subjacente do desenvolvimento da CAV permanece obscura, explicando por que as estratégias de tratamento eficazes estão atualmente ausentes e enfatizando a necessidade de modelos experimentais relevantes, a fim de estudar a fisiopatologia subjacente Formação CAV. O seguinte protocolo descreve um modelo heterotópico da transplantação do aortic do heterotópico do murine usando uma técnica modificada do punho da não-sutura. Nesta técnica, um segmento da aorta torácica é interposicionado na artéria carótida comum direita. Com o uso da técnica de manguito não sutura, um modelo fácil de aprender e reproduzível pode ser estabelecido, minimizando a possível heterogeneidade do micro anastomoses vascular suturado.

Introdução

Ao longo das últimas seis décadas, o transplante de órgãos sólidos evoluiu de um procedimento experimental para um padrão de atendimento para o tratamento da falência de órgãos em estágio final^1. Devido à melhoria dos agentes antimicrobianos, técnicas cirúrgicas e avanço em regimentos imunossupressores, a taxa de sucesso precoce do transplante de órgãos sólidos aumentou significativamente nas últimas décadas^2.

No entanto, as taxas de sobrevivência a longo prazo do enxerto não melhoraram significativamente da mesma forma^3. O desenvolvimento da CAV é o principal fator que limita a sobrevivência a longo prazo^4,5,6. Esta patologia é caracterizada pela formação de uma camada neointimal concêntrica composta por células musculares lisas, levando ao estreitamento progressivo do vaso e à malperfusão consecutiva do órgão sólido transplantado. Em receptores de transplante cardíaco, lesões CAV podem ser diagnosticadas em até 75% dos pacientes 3 anos após o transplante⁷.

A fisiopatologia da CAV ainda não é totalmente compreendida. Parece estar relacionado a inúmeros fatores imunológicos e não imunológicos, levando a danos endotélios com posterior ativação endotelial e disfunção⁸. Até agora, não existe opção de tratamento causal para a prevenção da CAV, enfatizando a necessidade de um modelo animal pequeno reproduzível, a fim de estudar a formação e potencial terapia da CAV.

Com o uso de modelos de transplante de aorta murine, CAV como lesões podem ser vistos 4 semanas após o transplante. Essas lesões consistem principalmente de células musculares lisas vasculares, assim, assemelhando-se à patologia humana. Devido a uma grande variedade de camundongos transgênicos e nocauteados, o uso de modelos de camundongos em patologias associadas ao transplante oferece uma oportunidade única para identificar novas opções terapêuticas e entender seu desenvolvimento. Devido ao pequeno diâmetro dos vasos transplantados no entanto, o uso de modelos de camundongos é comumente associado a curvas de aprendizagem longas e uma alta taxa de complicação inicial^9. Com a introdução da técnica de manguito não sutura, esta parte mais desafiadora da operação pode ser facilitada e o diâmetro da anastomose é mantido constante^10,11.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do ato alemão de bem-estar animal (TierSchG). (AZ: 55.2-1-54-2532.Vet_02-80-2015).

1. Habitação animal

1. Para experimentos, use camundongos C57BL/6 masculinos e BALB/c pesando 20-25 g com camundongos C57BL/6 como animais receptores e camundongos BALB/c como animais doadores.
2. Compre os animais e a casa em uma instalação livre de patógenos de barreira, de acordo com as diretrizes felasa para monitoramento de saúde^12.
3. Mantenha os ratos em gaiolas padrão de Makrolon com material de nidificação do enriquecimento. Fornecer acesso ad libitum à água e alimentos pelleted em um ciclo de dia / noite de 12 h.
4. Mantenha a temperatura ambiente em 22 ± 2°C e a umidade relativa em 55 ± 5%.

2. Preparação do destinatário

1. Primeiro, anestesiar o animal receptor (C57BL/6) com injeção intraperitoneal de midazolam (5 mg/kg; 5 mg/mL), medetomidina (0,5 mg/kg; 1 mg/mL) e fentanil (0,05 mg/kg; 0,05 mg/mL).
   NOTA: A profundidade correta da anestesia deve ser alcançada em 5-10 min.
   1. Aperte os pés traseiros com fórceps para verificar se há reflexos para confirmar a profundidade da anestesia.
2. Corte todo o cabelo da região lateral cervical com um clipper elétrico do cabelo para animais pequenos e aplique a pomada oftalmológico com cotonetes do algodão para impedir que os olhos sequem durante o procedimento.
3. Coloque o animal em uma posição supina em uma almofada de aquecimento o microscópio e bata suavemente as pernas para a mesa de operação com tiras de gesso sensíveis à pele.
4. Incline a cabeça para trás e esfregue o campo operativo várias vezes com álcool.
5. Faça uma incisão da pele da incisão jugular à mandíbula inferior direita com tesourapequena.
6. Retire o lobo inferior direito da glândula submandibular através do cautery bipolar do pedicle da embarcação e da excisão subseqüente com microtesouras.
7. Retire o músculo sternocleidomastoide direito através do cautery bipolar da porção superior e inferior e excisão subseqüente com microtesourapara ter acesso à artéria carótida comum.
8. Mobilizar a artéria carótida comum, tanto destally e proximally quanto possível, puxando o tecido conjuntivo circundante para além com fórceps finos.
9. Amarre duas ligaduras de seda 7-0 com distância mínima entre cada uma em torno do meio da artéria carótida comum e transect a artéria carótida comum com microtesourafina entre as ligaduras.
10. Passe a extremidade proximal, ligada através do punho e conserte-o com uma braçadeira pequena da artéria.
    NOTA: Os punhos que foram usados neste procedimento foram cortados com microtesouras de tubos de poliida com um diâmetro externo de 0,610 mm e uma espessura da parede de 0,0254 mm. Os punhos terminados tiveram um comprimento de ~2 milímetros com uma metade, que é usada para o processo cuffing, sendo um cilindro cheio e a outra metade, que é apertou, sendo um metade-cilindro.
11. Retire a ligadura com microtesoura fina, o mais próximo possível da ligadura, e lave o lúmen com soro salina heparinizada (50 IU/mL) com uma agulha de 30 G, tomando cuidado para não danificar as paredes do vaso.
12. Distenda o lúmen aberto usando dilatadores vasculares finos e sempre o coto carótida sobre o punho, puxando-o suavemente sobre o tubo de poliimida.
13. Imediatamente corrigir o carótida everted com um loop de seda vagamente pré-amarrado 7-0.
    NOTA: Vagamente pré-tie 4 7-0 loops de seda com um diâmetro de cerca de 1,5 mm antes da cirurgia para tornar o procedimento de algemas mais suave e mais fácil.
14. Realize o mesmo procedimento (2.10-2.13) na outra extremidade da artéria carótida.
15. Defina o animal receptor de lado e hidratar o campo operativo com soro para soro até que o segmento da aorta é explantado.

3. Operação de doadores

1. Anestesie o rato doador (BALB/c) da mesma forma que o animal receptor.
   1. Aperte os pés traseiros com fórceps para verificar se há reflexos para confirmar anestesia suficiente.
2. Corte todo o cabelo da região abdominal e torácica com um clipper elétrico do cabelo para animais pequenos e aplique a pomada oftalmológico com cotonetes do algodão para impedir que os olhos sequem durante o procedimento.
3. Coloque o animal em uma posição supina em uma almofada de aquecimento o microscópio e bata suavemente as pernas para a mesa de operação com tiras de gesso sensíveis à pele.
4. Esfregue o campo operativo várias vezes com álcool.
5. Realize uma laparotomia abdominal midline com tesouras pequenas e empurre os intestinos ligeiramente para cima para expor a cava de vena inferior (IVC).
6. Injete a veia cava inferior (IVC) com 1 mL de soline heparinizado usando uma agulha de 30 G.
7. Corte a aorta abdominal e IVC abaixo das artérias renais com pequenas tesouras para exsanguinate o animal doador. Vagamente colocar uma compressa no abdômen para absorver o sangue.
8. Realize uma toracotomia no desvio bilateral das costelas com tesoura e incline a parede do peito anterior cranially com uma braçadeira cirúrgica para expor o mediastinum.
9. Corte o IVC e o esôfago diretamente acima do diafragma com microtesoura.
10. Retire o coração e os pulmões, inclinando-os para cima com fórceps segurando o ivc corte / esôfago e, em seguida, extirque-os com microtesouras de sua base para ter acesso à aorta torácica no mediastinum dorsal.
11. Mobilize a aorta torácica de seu tecido circundante, separando o tecido conjuntivo circundante e gordura com fórceps finos, tendo o cuidado de não danificar quaisquer artérias intercostais.
12. Cauterize todos os ramos da aorta torácica com fórceps bipolares cautery e extirpar o segmento da aorta entre o diafragma e o arco da aorta usando microtesouras.
13. Nivele o segmento extótico da aorta com soro fisiológico heparinizado com uma agulha de 30 G, tomando cuidado para não danificar as paredes dos vasos, para remover qualquer sangue ou coágulos restantes e transferir o enxerto para o animal receptor.
    NOTA: Coloque diretamente o enxerto da aorta na posição aproximadamente certa no destinatário durante a transferência. Se há uns problemas que confundem as extremidades diferentes da corrupção no animal receptor, uma ligadura frouxa em torno da extremidade distal poderia ajudar.

4. Implantação

1. Puxe a extremidade proximal do segmento aórtico doador sobre o manguito proximal em cima da artéria carótida sempre com fórceps finos e imediatamente corrigi-lo com um loop de seda livremente pré-amarrado 7-0.
2. Apare a extremidade distal, livre da corrupção aórtica com microtesouras de modo que o comprimento da corrupção caiba a distância entre os dois punhos.
3. Repita o passo 4.1 do outro lado da aorta com o outro manguito para completar a anastomose.
4. Retire a braçadeira distal para permitir a perfusão retrógrada.
5. Depois de alcançar a hemostasis, retire a braçadeira proximal para completar a anastomose.
6. Finalmente, feche a ferida com 6-0 sutura contínua.

5. Cuidados pós-operatórios

1. Monitore o mouse de perto no primeiro 6 h após a operação e, em seguida, várias vezes ao dia para o primeiro 72 h após o transplante para detectar quaisquer complicações instantaneamente.
2. Para a analgesia pós-operatória, injete o camundongo transplantado com buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) subcutâneamente diretamente após o transplante e, em seguida, a cada 12 h para 72 h para fornecer aalgesia apropriada e de longo prazo.

6. Explicações do enxerto aórtico

1. Anestesia o animal transplantado com injeção intraperitoneal de midazolam (5 mg/kg; 5 mg/mL), medetomidina (0,5 mg/kg; 1 mg/mL) e fentanil (0,05 mg/kg; 0,05 mg/mL) 4 semanas após o transplante.
   1. Aperte os pés traseiros com fórceps para verificar se há reflexos para confirmar anestesia suficiente.
2. Corte todo o cabelo da região abdominal, torácica e cervical com um clipper elétrico do cabelo para animais pequenos.
3. Coloque o animal em uma posição supina em uma almofada de aquecimento o microscópio e bata suavemente as pernas para a mesa de operação com tiras de gesso sensíveis à pele.
4. Esfregue o campo operativo várias vezes com álcool.
5. Realize uma laparotomia abdominal midline com tesouras pequenas e empurre os intestinos ligeiramente para cima para expor a cava de vena inferior (IVC).
6. Injete a veia cava inferior (IVC) com 1 mL de soline heparinizado usando uma agulha de 30 G.
7. Corte a aorta abdominal e IVC abaixo das artérias renais com pequenas tesouras para exsanguinate o animal doador. Vagamente colocar uma compressa no abdômen para absorver o sangue.
8. Faça uma incisão da pele da incisão jugular à mandíbula inferior direita com tesouras pequenas correspondentes à incisão da pele feita durante o procedimento da transplantação.
9. Identificar o enxerto aórtico transplantado, juntamente com o manguito distal e proximal e blunt remover qualquer tecido circundante com fórceps.
10. Usando microtesouras, corte através da artéria carótida comum distal e proximal ao enxerto aórtico com os punhos, a fim de explantar o enxerto aórtico, juntamente com as duas extremidades do punho.
11. Corte o segmento da aorta ao meio e preserve os espécimes para análises adicionais (seções congeladas, seções embutidas de parafina, material congelado instantâneo)^13,14.

Resultados

No modelo de transplante totalmente incompatível com O MHC, uma camada neoinsinual concêntrica pode ser vista 4 semanas após o transplante (Figura 2). Esta camada consiste primeiramente em pilhas lisas vasculares do músculo como a coloração imunohistological para SM22 (um marcador seletivo para pilhas suaves maduras do músculo) revelada. Como dito antes, estas pilhas lisas vasculares do músculo são pathognomonic para as lesões consideradas na vasculopatia crônica do allograft. Para análises ...

Discussão

A vasculopatia aloenxerto crônica é a principal causa de perda tardia do enxerto após o transplante de órgãos sólidos do coração e provável renal e pulmão aloenxertos⁸. Até agora, nenhum regime terapêutico causal poderia ser desenvolvido a fim impedir a formação de CAV.

A fisiopatologia da CAV é multifatorial e envolve aspectos imunológicos e não imunológicos^16. O uso de modelos de roedores no transplante tem sido essencial para entender a fisiop...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos Balb-c (H2-d)	Cepa do Rio Charles	# 028	Animal doador
Sistema de cauterização bipolar	ERBE	ICC 50 / 20195-023	Cautério bipolar
C57BL/6J (H-2b)	Cepa do Rio Charles	# 027	Animal receptor
Halsey Porta-agulhas	FST	12501-12
Porta-agulha Halsted-Mosquito Fórceps	AESCULAP	BH111R	Grampo Curvo Tubo
Poliimida Médica	Nordson MEDICAL	141-0031	Material do manguito
Micro Serrefines	FST	18055-04	Micro Vessel Clip
Micro-Adson Forceps (serrilhado)	FST	11018-12	Fórceps padrão
Micro-Serrefine Clamp Aplicando Fórceps	FST	18057-14	Clipapplicator
S& Pinça T - Pontas SuperGrip (Angular 45°)	S& T	00649-11	Pinça Fina
S & Pinça Dilatadora de Vaso T - Angular 10° (Diâmetro da ponta 0,2 mm)	S& T	00125-11	Vasodilatador
Schott VisiLED Set	Schott	MC 1500 / S80-55	Microscópio
Estereoscópico	ZEISS	SteREO Discovery.V8
Tesoura Fina / Tesoura Cirúrgica - Sharp-Blunt	FST	91460-11 / 14001-12	Sissors Padrão
Vannas-Tü Tesoura de Mola bingen (curva, 8,5 cm)	FST	15004-08	Microsissors (curvada)
Vannas-Tü bingen Tesoura de mola (reta, 8,5 cm)	FST	15003-08	Microsissors (reta)