Modulação da localização subcelular tau como uma ferramenta para investigar a expressão de genes relacionados à doença

Resumo

Tau é uma proteína neuronal presente tanto no citoplasma, onde liga microtúbulos, e no núcleo, onde exerce funções não convencionais, incluindo a modulação dos genes relacionados à doença de Alzheimer. Aqui, descrevemos um método para investigar a função do tau nuclear, excluindo quaisquer interferências provenientes de Tau citoplasmamic.

Resumo

Tau é uma proteína de ligação microtúnuo expressa nos neurônios e sua principal função conhecida está relacionada à manutenção da estabilidade citosquelética. No entanto, evidências recentes indicaram que Tau também está presente em outros compartimentos subcelulares, incluindo o núcleo onde está implicado na proteção do DNA, na transcrição do rRNA, na mobilidade de retrotransposons e na organização estrutural do Nucléolo. Recentemente, demonstramos que tau nuclear está envolvido na expressão do gene VGluT1, sugerindo um mecanismo molecular que poderia explicar o aumento patológico da liberação de glutamato nos estágios iniciais da doença de Alzheimer. Até recentemente, o envolvimento do tau nuclear na modulação da expressão de genes-alvo tem sido relativamente incerto e ambíguo devido a limitações técnicas que impediram a exclusão da contribuição de Tau citoplasmic ou o efeito de outros fatores a jusante não relacionados ao nuclear Tau. Para superar essa incerteza, desenvolvemos um método para estudar a expressão de genes-alvo especificamente modulados pela proteína tau nuclear. Nós empregamos um protocolo que acople o uso de sinais da localização e do fration subcellular, permitindo a exclusão da interferência das moléculas citoplasmômicas de Tau. Mais notavelmente, o protocolo é fácil e é composto por métodos clássicos e confiáveis que são amplamente aplicáveis para estudar a função nuclear de Tau em outros tipos de células e condições celulares.

Introdução

As funções da proteína Tau no núcleo têm atraído interesse significativo nos últimos anos, uma vez que tem se mostrado intimamente associada com os ácidos nucleicos^1,2,3,4,5,6. Na verdade, um estudo recente em todo o genoma demonstrou que Tau liga seqüências de DNA genic e intergênicos in vivo⁷. Um papel na organização nucleolar foi sugerido^8,9,10,11. Além disso, Tau foi proposto para se envolver na proteção do DNA contra o estresse oxidativo e hipertermiômico^5,10,12,13, enquanto tau mutado tem sido associada à instabilidade cromossômica e aneuploide^14,15,16.

Até agora, os desafios em estudar as funções de Tau no compartimento nuclear permaneceram quase sem solução devido às dificuldades em dissecar a contribuição específica de Tau nuclear da contribuição de Tau citoplasmic. Além disso, as funções atribuídas às moléculas tau no compartimento nuclear, até agora, são apenas correlativas porque não têm uma demonstração inequívoca do envolvimento direto das proteínas nucleares Tau. De fato, o envolvimento de Tau na mobilidade de retrotransposons ou na transcrição rRNA ou na proteção do DNA^{11,12,17,18,19} também pode ser explicado pela contribuição de Tau citoplasmic ou pelo efeito de outros fatores a jusante não relacionados ao nuclear Tau.

Aqui, fornecemos um método que pode resolver este problema explorando um procedimento clássico para isolar o compartimento nuclear combinado com o uso de tau constrói 0N4R marcado com localização nuclear (NLS) ou sinais de exportação nuclear (NES). Esta abordagem elimina as questões complexas relacionadas com possíveis artefatos devido à repercussão das moléculas tau do compartimento citoplasmático. Além disso, as construções Tau-NLS e Tau-NES induzem o enriquecimento ou a exclusão das moléculas tau do compartimento nuclear, respectivamente, fornecendo controles positivos e negativos para o envolvimento de moléculas nucleares tau em uma função específica. O protocolo é tecnicamente fácil e é composto por métodos clássicos e confiáveis que são amplamente aplicáveis ao estudo da função nuclear de Tau em outros tipos de células, diferenciados ou não, como células cancerosas que reativam a expressão tau^20,21. Além disso, pode ser aplicado também a outras proteínas que estão presentes tanto no citoplasma quanto no núcleo, a fim de dissecar funções biológicas relacionadas a diferentes compartimentos.

Protocolo

1. Cultura celular

1. Células Cultura SH-SY5Y (linha de células neuroblastoma humanas, CRL-2266) em meio completo (o meio modificado eagle de Dulbecco:mistura de nutrientes F12 [DMEM/F-12] complementada com 10% de soro bovino fetal [FBS], 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina). Manter as células em uma incubadora a 37 °C e 5% CO₂. Crescer as células em placas de 10 cm e dividir quando confluent.

2. Diferenciação celular

1. Para diferenciar as células SH-SY5Y, no dia seguinte ao revestimento, adicione 10 μM ácido retinóico (AR) para completar o meio por 5 dias.
2. O sexto dia substitui médio por meio de diferenciação: DMEM/F-12 complementado com 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamina. Não adicione FBS ou antibióticos.
3. Crescer as células em meio de diferenciação por 3 dias.

3. Chimeric Constrói Cloning

1. Gerar Tau-NLS construir por clonagem por restrição digestão enzimática no quadro no final de 3' de Tau seqüência 0N4R (383aa) o 3xNLS (SV40NLS):5'-CCAAAAAAAAHAGAAGGTAGATCCAtCCAAAAAAGAGAAGGATCCAAAAAAAAGAAGAAGAAGAAAGGTA-3'.
   Nota: O 3xNLS no final de 3' de Tau é clonado no plasmid pCMV-Tau para expressão de mamíferos explorando os locais de restrição XhoI e BamHI no local de multiclonagem (MCS).
2. Gere tau-nes construção por clonagem por restrição enzima digestão no quadro no final de 3' tau seqüência 0N4R (383aa) a seqüência NES: 5'-AGTGAGGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATGGGGACTCGCGTACA-3'.
   Nota: O NES no final de 3' de Tau é clonado no plasmid pCMV-Tau para expressão de mamíferos explorando os locais de restrição EcoRI e BamHI no MCS.
3. Transforme a cepa DH5alpha E.coli com 100 ng de DNA a partir do passo 3.1 ou 3.2 e células de placa em placas LB-Agar com 100 mg/mL ampicilina. Deixe crescer durante a noite a 37 °C.
4. Escolha uma única colônia e spike as células em 5 mL de LB com ampicilina. Deixe as células crescerem a 37 °C em agitação durante a noite.
5. Extraia plasmid com um miniprep do ADN(tabela dos materiais)e seqüência para verificar as construções.
6. Transforme a cepa DH5alpha E. coli com a sequência de construções e células de placa verificadas em placas LB-Agar com ampicilina. Deixe crescer durante a noite a 37 °C.
7. Escolha uma única colônia e spike as células em 5 mL de LB com ampicilina. Deixe as células crescerem a 37 °C em agitação por 2 h.
8. Coloque as células do passo 3.7 em 200 mL de LB com ampicilina. Deixe crescer durante a noite a 37 °C.
9. Pelotas as células a 3.500 x g por 10 min a 4 °C.
10. Extrato plasmídeo com um dna maxiprep (Tabela de Materiais).

4. Transfecção celular

1. Sementes 400.000 células do passo 1.1 em placas de 6 poços ou 20.000 células em lâminas de câmara de 8 poços. Amostras da placa quatro: células de controle a serem transpartidas com um vetor vazio, células a serem transpartidas com Tau não escaloado, células a serem transpartidas com Tau-NLS e células a serem transpartidas com Tau-NES.
2. No dia seguinte à semeadura transfect 400 ng de DNA para cada poço usando os lipídios cationic(Tabela de Materiais)em placas de 6 poços ou 200 ng de DNA para cada poço para slides de câmara de 8 poços, de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Incubar o DNA e os lipídios cationic separadamente em 250 μL (para placas de 6 poços) ou 25 μL (para slides de câmara de 8 poços) de médio sérico reduzido para 5 min em RT. Em seguida, combiná-los para gerar o complexo dna-lipídios e incubar por 20 min.
   2. Substitua o meio de cultura por 2 mL (para placas de 6 poços) ou 250 μL (para slides de câmara de 8 poços) de meio de cultura completa fresco. Adicione o complexo dna-lipídio s as células e incubar a 37 °C durante a noite.
3. Alternativamente, dna transfect com o reagente cationic polietiletilimina (PEI).
   1. Misture 2 μg de DNA e 6 μL de PEI com 200 μL de meio de cultura completa (para cada poço em placas de 6 poços), ou 1 μg de DNA e 3 μL de PEI com 100 μL de meio de cultura completa (para cada poço em slides de câmara de 8 poços) , vórtice e incubação de 10 min em RT.
   2. Adicione a mistura às células e adicione 1,8 mL de meio de cultura completa por poço em placas de 6 poços ou 150 μL de meio de cultura completa por poço em lâminas de câmara de 8 poços para alcançar o volume de revestimento.
4. Mude o meio no dia seguinte à transfecção e adicione os meios de diferenciação, conforme descrito na etapa 2.2.

5. Imunofluorescência

1. Retire o meio de cultura e lave as células com 1x PBS. Corrija células com 100% de gelo frio metanol para 3 min sem tremer. Retire a solução de fixação e lave brevemente com 1x PBS.
2. Permeabilize com 0,1% surfactante não-iônico em 1x PBS por 5 min à temperatura ambiente (RT). Resumidamente, lave com 1x PBS, 3 vezes.
3. Incubar células com tampão de bloqueio (0,1% Tween 20 e 1% BSA em PBS) por 30 min em RT em um agitador orbital.
4. Incubado com anticorpos primários apropriados (por exemplo, anticorpo monoclonal monoclonal anti-Tau13) diluído 1:500 no bloqueio tampão durante a noite em 4 °C em um agitador orbital. Retire a solução de anticorpos e lave, brevemente, com 1x PBS.
5. Incubado com anticorpos secundários conjugados ao fluorophore (por exemplo, anticorpos anti-rato de cabra conjugados a Alexa Fluor 633) diluído 1:500 no tampão de bloqueio por 1 h em RT. Remover a solução de anticorpos e lavar brevemente com 1x PBS 3 vezes.
6. Para manchar núcleos, incubar com DAPI diluído 1:20,000 em bloqueio tampão por 10 min em RT. Wash com 1x PBS 3 vezes. Monte coverslips em um slide usando antifade montagem médio.

6. Blot ocidental

1. Para coletar a pelota da pilha da etapa 4.4, remova o meio, e lave pilhas com PBS. Incubar com 500 μL de 0,1% de trippsina por 4 min a 37 °C. Adicione um volume igual de células médias completas e resuspende.
2. Coletar células em um tubo e centrífuga a 500 x g por 5 min. No final da centrifugação remover cuidadosamente o supernatant. Adicione 1 mL de PBS, centrífuga a 500 x g por 5 min e retire cuidadosamente o supernatant. Armazenar pelotas de células no gelo para uso imediato ou congelar a -80 °C para armazenamento a longo prazo.
3. Para extratos totais de proteína, incubar a pelota de células por 30 min no gelo em lupa (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glicerol, 1% octylphenoxy poli (etilenoxia) etanol, ramificado(Tabela de Materiais), 10 mM EDTA) complementado com inibidores protease e phosphatase. De acordo com a abundância da pelota, use 50 μL a 100 μL de tampão de lyse.
   1. Centrífuga o extrato a 16.000 x g por 15 min. Recolher o supernatant e quantificar a concentração de proteína por qualquer ensaio quantificação padrão. Prepare as amostras de proteína para o SDS-PAGE misturando 20 μg de proteínas com 5 μL de 4x Laemmli buffer em um volume total de 20 μL e ferver a 100 °C por 5 min.
      Nota: A amostra pode ser armazenada a -20°C.
4. Para fracionamentos subcelulares, resuspenda as células do passo 6.2 em meio completo e coleta 1 x 10⁶ células por cada amostra. Centrífuga a 500 x g por 10 min para obter pelotas celulares para as seguintes etapas.
   1. Para isolar compartimentos subcelulares, fracionado de acordo com as especificações do kit. Para isolar cada fração, incubar a pelota celular do passo 6.4 com o amortecedor correspondente, centrífuga, recolher o supernatant e adicionar o próximo buffer para a pelota, conforme descrito em 6,4.1.1-6.4.1.5. Adicione em ordem o amortecedor de extração citoplasmática, o amortecedor de extração de membrana, o amortecedor de extração nuclear, o amortecedor de extração nuclear complementado com 5 mM CaCl₂ e 3 U/μL microcococtal nuclease e tampão de extração citoesquelética.
      Nota: Todos os buffers devem ser complementados com inibidores da protease. Escala de volumes tampão de acordo com o volume da pelota celular.
      1. Para isolar a fração citossólica, as pelotas de células incubadas em 100 μL de tampão de extração citoplasmática gelada complementada com inibidores protease a 4 °C com mistura suave por 10 min. Centrífuga a 500 x g a 4 °C por 5 min e transferem o supernatant para tubos pré-refrigerados.
      2. Adicione 100 μL de tampão de extração de membrana gelada complementado com inibidores da protease à pelota do passo 6.4.1.1, e incubar a 4 °C com mistura suave por 10 min. Centrífuga a 3.000 x g a 4 °C por 5 min e coletar o supernatant.
      3. Para a fração nuclear solúvel, adicione 50 μL de buffer de extração nuclear complementado com inibidores da protease à pelota do passo 6.4.1.2 e vórtice. Incubar a 4 °C por 30 min, centrífuga a 5.000 x g a 4 °C por 5 min, e recolher o supernatant.
      4. Para a fração nuclear insolúvel, adicione 50 μL de buffer de extração nuclear complementado com inibidores da protease, CaCl₂ e nuclease microcócica à pelota do passo 6.4.1.3 e vórtice. Incubar a 37 °C para 5 min, e depois vórtice novamente. Centrífuga a 16.000 x g em RT por 5 min e recolher o supernatant.
      5. Para a fração citoesquelética, adicione 50 μL de tampão de extração citoesquelética complementado com inibidores da protease à pelota do passo 6.4.1.4 e vórtice. Incubar 10 min em RT. Centrífuga o tubo em 16.000 x g por 5 min, recolher o supernatant e descartar a pelota.
         Nota: Volumes de buffer de escala de acordo com o volume celular, como indicado no protocolo do kit. Consulte o protocolo do kit para mais detalhes sobre incubação e tempo de centrífuga e temperatura^{22,23,24,25,26,27,28,29.} Alternativamente, use todos os métodos padrão³⁰ que, usando detergentes e aumentando a força iônica e a velocidade da centrífuga, separam o citosólico, o membrana-limite, o citoskeletal e as frações nucleares. Separe a fração nuclear solúvel e a fração nuclear insolúvel explorando amortecedores padrão da extração nuclear. A amostra pode ser armazenada a -20°C.
   2. Para o SDS-PAGE, adicione 7 μL de buffer 4x Laemmli a 20 μL de frações subcelulares obtidas a partir dos passos 6,4,1,1-6,4,1,5, ferva a 100 °C por 5 min.
5. Carregue amostras em um gel de acrilamida e realize eletroforese em uma tensão constante de 120 V. Transfira proteínas para membrana nitrocelulose a 250 mA por 90 min.
6. Verifique a eletroforese de gel de proteína adequada e aborrecto bem sucedido incubando a membrana por 5 min na solução de coloração Ponceau. Lave a membrana em água destilada até que o fundo esteja limpo. Retire a mancha continuando a lavar com Tris soline amortecida com Tween 20 (TBST) por 10 min em uma coqueteleira.
7. Incubar a membrana com solução de bloqueio (5% de leite em TBST) para 1 h no RT em shaker. Lave 3 vezes com TBST por 5 min.
8. Hibridize a membrana com o anticorpo primário na solução de bloqueio (1% de leite no TBST) durante a noite a 4 °C. Lave 3 vezes com TBST por 5 min.
9. Hibridize a membrana com o anticorpo secundário sARRh-conjugado na solução de bloqueio para 1 h no RT. Lave 3 vezes com TBST por 5 min.
10. Detecte a banda de proteínausando chemiluminescence. Quantifique a intensidade das bandas western blot por ImageJ. Normalize a expressão proteica no produto de um gene de limpeza: histona H2B para a fração solúvel e insolúvel nuclear, GAPDH para a fração citoplasmaee e extratos totais.

Resultados

A estratégia utilizada para dissecar o impacto do tau nuclear na expressão gênica evitando a contribuição de proteínas tau citoplasmasais tem sido retratada na Figura 1. Resumidamente, as proteínas Tau marcadas com NLS ou NES são acumuladas ou excluídas do compartimento nuclear, respectivamente. O efeito funcional deste desequilíbrio é a alteração da expressão gênica medida como produto do gene VGluT1.

Discussão

Descrevemos um método para medir o impacto da proteína tau nuclear na expressão gênica. Com este protocolo, a contribuição do tau citoplasmic é fortemente limitada. Os passos críticos deste protocolo são os seguintes: a diferenciação das células neuroblastoma humana SH-SY5Y, o fracionamento subcelular e a localização da proteína Tau no compartimento nuclear.

Primeiro, como mostrado na seção de resultados representativos, a diferenciação das células SH-SY5Y, adicionando RA e BDNF é crucial para...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alexa Fluor 633 cabra anti-rato IgG	Life Technologies	A21050	IF 1:500
anti actina anticorpo	BETHYL LABORATORIE	A300-485A	anti-coelho WB 1:10.000
anti GAPDH anticorpo	Fitzgerald Industries International	10R-G109a	anti-rato WB 1:10.000
anti H2B anticorpo	Abcam	ab1790	anti-coelho WB 1:15.000
anticorpo Tau-13	Santa Cruz Biotechnology	sc-21796	anti-mouse WB 1:1.000; IF 1:500
anti Tubulina alfa Anticorpo	Thermo Fisher Scientific	PA5-16891	anti-rato WB 1:5.000
anti VGluT1 Anticorpo	Sigma-Aldrich	AMAb91041	anti-rato WB 1:500
BCA Kit de Ensaio de Proteína	Euroclone	EMPO14500
BDNF	Alomone Labs	B-250
Blotting-Grade Blocker	Biorad	1706404	Leite em pó desnatado
BOVIN ALBUMINA SÉRICA	Sigma-Aldrich	A4503-50g
cOmplete Mini	Roche	11836170001	inibidor de protease
Criterion TGX 4-20% Livre de manchas, 10 poços	Biorad	5678093
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
DMEM/F-12	GIBCO	21331-020
Águia Modificada de DulbeccoEuroclone de Glicose Média Baixa		ECM0060L
EDTA	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH = 8, 0,5 M
Soro Bovino Fetal	Euroclone	EC50182L
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516-500ml
Cabra anti-rato IgG-HPR	Santa Cruz Biotecnologia	sc-2005	WB 1:1.000
Cabra anti-coelho IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004	WB 1:1,000
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ml	Octilfenoxi poli(etilenooxi)etanol
Immobilon Western	MERCK	WBKLS0500
Lab-Tech Lâmina de câmara 8 poços lâmina de vidro	nunc	177402
L-glutamina	Euroclone	ECB3000D	100X
Lipofectamine 2000 reagente de transfecção	Thermo Fisher Scientific	12566014	lipídio catiônico
Metanol	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1kg
Opti-MEM reduziu o meio sérico	Gibco	31985070
PEI	Sigma-Aldrich	40,872-7
Penicilina/Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL, 100 mL
Solução salina tamponada com fosfato (Dulbecco A)	OXOID	BR0014G
Inibidor	fosfatase	Roche	4906837001
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163	Etapa 3.10
Ácido retinóico	Sigma-Aldrich	R2625-100mg
Kit de fracionamento de proteínas subcelulares para células cultivadas	Thermo Fisher Scientific	78840
Membrana de nitrocelulose suportada	Biorad	1620097
TC-Plate 6well	SARSTEDT	833.920
TCS SP2 microscópio confocal de varredura a laser	Leica	N/A
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	Surfactante não iônico
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	15400054	0,50%
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ml
VECTASHIELD antifade meio de montagem	Vector Laboratories	H-1000
Wizard Plus SV Minipreps Sistemas de Purificação	de DNAPromega	A1330	Etapa 3.5