Este método é útil para quantificar a dinâmica precoce da adesão celular e disseminação de células dependentes de ancoragem para a fibronectina. Além disso, este ensaio pode ser usado para investigar os efeitos da homeostase redox alterada na propagação da pilha e/ou nas vias de sinalização intracelular adesão-relacionadas da pilha.
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Artigo de método
Examinando a dinâmica da adesão celular e disseminação de células epiteliais em fibronectina durante o estresse oxidativo
Neste artigo
Resumo
Resumo
A adesão e disseminação de células para a matriz extracelular (ECM) são processos celulares essenciais durante o desenvolvimento organizador e para a homeostase de tecidos adultos. Curiosamente, o estresse oxidativo pode alterar esses processos, contribuindo assim para a fisiopatologia de doenças como o câncer metastático. Conseqüentemente, compreender o mecanismo (s) de como as pilhas anexam e espalham no ECM durante as perturbações no status redox pode fornecer a introspecção em Estados normais e da doença. É descrito abaixo um protocolo passo-sábio que utilize um ensaio immunofluorescence-baseado para quantificar especificamente a adesão e a propagação da pilha de pilhas imortalizado do fibroblasto no fibronectina (FN) in vitro. Brevemente, as células dependentes de ancoragem são mantidas em suspensão e expostas ao inibidor da quinase ATM Ku55933 para induzir o estresse oxidativo. As pilhas são chapeadas então na superfície FN-revestida e permitidas anexar por períodos de tempo predeterminados. As células que permanecem ligadas são fixas e rotuladas com marcadores de anticorpos de adesão à base de fluorescência (por exemplo, paxillin) e espalhamento (por exemplo, F-Actina). A aquisição e a análise dos dados são executadas usando o equipamento de laboratório geralmente disponível, incluindo um microscópio da epifluorescência e software livremente disponível de Fiji. Este procedimento é altamente versátil e pode ser modificado para uma variedade de linhas celulares, proteínas de ECM, ou nervos inibidores a fim examinar uma escala larga de perguntas biológicas.
Introdução
Aderências de matriz celular (ou seja, aderências focais) são grandes e dinâmicos complexos proteicos multimoleculares que mediam a adesão e disseminação celular. Estes processos são críticos para o desenvolvimento do tecido, a manutenção, e a função physiological. As aderências focais são compostas de receptores ligados à membrana, como as integrinas, bem como as proteínas de andaimes que ligam a actina citoesquelética à matriz extracelular (ECM)1. Esses complexos são capazes de responder a pistas fisioquímicas presentes no ambiente extracelular através da ativação de várias vias de transdução de sinalização. Como tal, as aderências focais ser....
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Protocolo
1. os preparativos
Nota: o protocolo descrito abaixo foi otimizado para o uso com células REF52 e ATM+/+ ou ATM-/- fibroblastos humanos. Outros tipos de célula podem exigir mais otimização conforme descrito nas seções de anotações e solução de problemas abaixo.
- Faça 500 mL de meio de cultura celular completo para células REF52. Para 500 mL de alta-glicose contendo Dulbecco ' s modificado Eagle ' s médio (DMEM) adicionar 10% FBS, 2 mM L-glutamina, e 100 unidades/mL penicilina-estreptomicina.
- Prepare uma solução de 25 μg/mL de fibronectina (FN) adicionando 300 μL de 1 mg/mL de solução FN a 12 mL de so....
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Resultados
Um esquema geral da set-up experimental
A Figura 1 representa o esquema geral para a adesão da célula e o protocolo de espalhamento começando com a inanição sérica de células REF52 e terminando com a análise computacional de imagens de fluorescência adquiridas. As etapas principais no protocolo são ilustradas na linha do tempo. Da nota, a etapa 2 do protocolo descreve a preparação dos COVERSLIP FN-revestidos, que devem ser executados simultaneamente com etapa 3: pil.......
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Discussão
O protocolo descrito aqui é uma maneira versátil e econômica de tela ràpida uma série de tipos ancoragem-dependentes da pilha para o citoesqueleto dinâmico que remodela durante espalhar da pilha. Em particular, este método examina quantitativamente a fibra de estresse e a formação de adesão focal durante o estresse oxidativo quando as células aderem à FN (Figura 1a). Além disso, estes fenótipos celulares podem sugerir um papel regulamentar para membros da família de Rho de GTPases pequenos d.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos Drs. Scott R. Hutton e Meghan S. Blackledge pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pela High Point University ' s Research and patrocinado Programs (MCS) e o programa de biotecnologia da North Carolina State University (MCS).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina-EDTA (1x) | Gibco da Life Technologies | 25300-054 | dissociação celular |
| 10 cm2 pratos | Cell Treat | 229620 | estéril, tratado com cultura de tecidos |
| 15 mL tubos cônicos | Fisher Scientific | 05-539-5 | estéril |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, estéril, livre de Mg2+ e Ca2+ |
| Placas tratadas com cultura de células de 24 poços | Fisher Scientific | 07-200-740 | estéril, tratadas com cultura de tecidos |
| 4° C geladeira | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anticorpo primário anti-paxilina (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marcador de aderências focais |
| Aspirador | Argos | EV310 | |
| Gabinete de biossegurança | Nuair | NU-477-400 | Classe II, Tipo A, série 5 |
| Albumina de soro bovino deslipidado (livre de ácidos graxos) em pó | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimetil Sulfóxido Fisher | Scientific | BP231-100 | solvente orgânico para dissolver Ku55933 |
| Meio de Águia Modificado de Dulbecco, Alta Glicose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 meio de cultura de células base |
| Soro bovino fetal | Certificado Fisher Scientific | 16000044 | suplemento de meio de cultura de células |
| Fiji | Programa de análise de imagem http://fiji.sc/ National Institutes of Health | ||
| Seringa de filtro | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µ M, lamínulas de vidro estéreis |
| (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave em folha para esterilizar |
| anticorpo secundário IgG anti-camundongo de cabra Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | anticorpo secundário fluorescente, soro de cabra sensível à luz |
| Gibco da Life Technologies | 16210-064 | componente da solução de bloqueio para imunofluorescência | |
| Hemocitômetro | Fisher Scientific | 22-600-107 | para contagem de células |
| Fibronectina Plasmática Humana | Gibco da Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Microscópio de Fluorescência Invertida | Olympus | para visualizar fluorescência, morfologia celular, contagem e dissociação | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM inibidor de quinase, indutor de oxigênio reativo espécies |
| L-glutamina | Fisher Scientific | 25-030-081 | suplemento de meio de cultura de células |
| Câmera monocromática CMOS de 16 bits | Optimos | ||
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixador para imunofluorescência |
| Penicilina-estreptomicina | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, solução antibiótica para meio de cultura |
| Alexa Fluor 594 faloidina (sonda de actina F) | Marcador Invitrogen | A12381 | de F-actina, sensível à luz |
| ProLong Gold Reagente anti-desbotamento com DAPI | Invitrogen | P36941 | meio de montagem de lamínula incluindo corante nuclear DAPI, |
| células | Graham, DM et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Placa de agitação com controle de calor | Corning Incorporated | Seringa PC-420D | |
| BD Biosciences | 309653 | seringa de 60 mL | |
| Incubadora de cultura de tecidos | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergente usado para permeabilizar membranas celulares |
| Solução Trypan Blue | Fisher Scientific | 15-250-061 | para contagem de células |
| Solução Neutralizante de Tripsina (1x) | Gibco da Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutraliza a tripsina em vez do rotador do tubo de soro bovino fetal |
| Fisher Scientific | 11-676-341 | ||
| banho-maria | Fisher Scientific | FSGPD02 |
Referências
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
- Geiger, B., Yamada, K. M.
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Reimpressões e permissões
