Method Article

Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo

DOI:

10.3791/60003

⸱

June 4th, 2020

 ,  , 
1Imaging Facility, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo descreve rotulagem específica de nucleóides mitocondriais com uma mancha de gel de DNA comercialmente disponível, aquisição de série de lapso de tempo de células rotuladas ao vivo por microscopia de iluminação estruturada de super resolução (SR-SIM) e rastreamento automático do movimento nucleóide.

Abstract

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Nucleóides mitocondriais são partículas compactas formadas por moléculas de DNA mitocondrial revestidas de proteínas. O DNA mitocondrial codifica tRNAs, rRNAs e vários polipeptídeos mitocondriais essenciais. Os nucleóides mitocondriais dividem e distribuem dentro da dinâmica rede mitocondrial que sofre fissão/fusão e outras alterações morfológicas. Microscopia de fluorescência viva de alta resolução é uma técnica simples para caracterizar a posição e o movimento de um nucleóide. Para esta técnica, os nucleóides são comumente rotulados através de marcas fluorescentes de seus componentes proteicos, ou seja, fator de transcrição a (TFAM). No entanto, essa estratégia precisa de superexpressão de uma construção com etiqueta de proteína fluorescente, que pode causar artefatos (relatados para tfam), e não é viável em muitos casos. Corantes orgânicos de ligação de DNA não têm essas desvantagens. No entanto, eles sempre mostram a coloração de DNAs nucleares e mitocondriais, sem especificidade para os nucleóides mitocondriais. Levando em conta as propriedades físico-químicas desses corantes, selecionamos uma mancha de gel de ácido nucleico (SYBR Gold) e alcançamos rotulagem preferencial de nucleóides mitocondriais em células vivas. Propriedades do corante, particularmente seu alto brilho ao vincular ao DNA, permitem quantificação subsequente do movimento nucleóide mitocondrial usando séries temporais de imagens de iluminação estruturadas de super-resolução.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moléculas circulares de DNA de 16,5 kbp constituem o material genético das mitocôndrias, codificando 22 tRNAs, 2 rRNAs e 13 polipeptídeos necessários para complexos mitocondriais oxidativos de fosforilação. DNA mitocondrial ligado ao fator de transcrição mitocondrial a (TFAM) e várias outras proteínas formam os nucleóides mitocondriais1,,2,,3,,4. Os nucleóides mitocondriais movem-se e redistribuem entre os componentes da rede mitocondrial5,6 durante sua remodelagem morfológica, fissão ou fusão, dependendo da fase do ciclo celular, estresse e outros fatores (revisados em Pernas et al.7). Além disso, o movimento dos nucleóides mitocondriais está implicado na doença de lúpus eritematoso sistêmico8 e pode desempenhar um papel em outras doenças. A microscopia de fluorescência é uma técnica simples para estudos de células vivas de organelas, mas a técnica tem uma resolução de >200 nm, que é maior que o tamanho dos nucleóides mitocondriais (~100 nm9,,10,,11,12). Esse limite tem sido contornado pelas chamadas técnicas de "super-resolução", como esgotamento estimulado de emissões (STED) e microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM)13,14. Até agora, nucleóides mitocondriais e outros DNAs foram imagens em células vivas por microscopia direta de reconstrução óptica estocástica (dSTORM)15. Estruturas submitocínias finas com posições correlacionadas com o dNH foram observadas por DST em células vivas16. No entanto, essas técnicas de super-resolução requerem alta intensidade de iluminação, o que causa efeitos fototóxicos nas células vivas17. Portanto, a imagem de lapso de tempo de nucleóides mitocondriais com resolução além do limite de difração é desafiadora. Para lidar com isso, utilizamos microscopia de iluminação estruturada de super resolução (SR-SIM)18. O SIM requer uma dose de energia de iluminação muito menor do que o STED e o SMLM19. Além disso, ao contrário das técnicas STED e SMLM, o SIM permite imagens tridimensionais multicoloridas simples (3D) e não requer propriedades fotofísicas particulares dos fluoroforos ou composição de tampão de imagem19.

A estratégia convencional para rotular nucleóides mitocondriais em células vivas é a marcação fluorescente de uma proteína nucleóide mitocondrial, como a TFAM20. No entanto, em muitos casos, essa estratégia não é adequada. Além disso, a superexpressão do TFAM com proteína fluorescente produz um artefato sério21. A rotulagem de DNA com corantes orgânicos tem vantagens sobre uma estratégia baseada em proteína fluorescente (FP). Os corantes orgânicos são livres de restrições relacionadas à marcação FP: podem ser usados para qualquer tipo de células ou tecidos e podem ser aplicados a qualquer momento de um experimento. Imagens de células vivas de nucleóides mitocondriais foram relatadas com vários corantes de ligação de DNA: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24e picoGreen15,,25,26. Uma desvantagem substancial da maioria dos corantes de ligação de DNA para rotulagem nucleóide é que eles mancham todo o DNA dentro da célula. Direcionar um corante apenas para DNA mitocondrial é altamente desejável. Para isso, é necessária uma seleção cuidadosa de um corante que possua propriedades físico-químicas adequadas. Corantes lipofílicos que possuem carga positiva deslocalizada, como a rhodamina 123, são conhecidos por se acumularem em mitocôndrias vivas, que preservam seu potencial de membrana negativa. Além disso, um corante ideal para rotulagem específica de nucleóides mitocondriais deve ligar o DNA com alta afinidade e emitir fluorescência brilhante na ligação de DNA. Considerando esses requisitos, certas cianolinas são promissoras (por exemplo, picoGreen), mas o DNA nuclear é abundantemente manchado por esses corantes simultaneamente com DNA mitocondrial15,,25,26. O presente protocolo descreve a rotulagem específica de nucleóides mitocondriais em células vivas com outro corante de cianina, SYBR Gold (SG), e rastreamento dos nucleóides em vídeos SIM de super resolução de lapso de tempo. Além disso, as células vivas manchadas de SG podem ser imagens por qualquer tipo de microscópio fluorescente invertido (fusocal, disco giratório, epifluorescência, etc.) adequado para células vivas e equipado com uma fonte de luz de 488 nm.

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Protocol

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NOTA: Todas as linhas celulares aqui mencionadas foram cultivadas em alta glicose Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), glutamina, penicilina/estreptomicina e piruvato. Equilibre todos os meios de comunicação e suplementos a serem usados no dia da rotulagem e imagem aquecendo-os até 37 °C em uma incubadora definida para 5% de CO2. Todo o trabalho de cultura celular, incluindo rotulagem, ocorre em condições estéreis sob uma coifa de fluxo laminar.

1. Rotulagem de células ao vivo

  1. Um dia antes do procedimento de rotulagem, a cultura 4 x 105 células HeLa em 2 mL de meio em uma placa de Petri de 35 mm com fundo de vidro #1,5. Slides de câmara multi-bem podem ser usados, mas os volumes devem ser ajustados proporcionalmente ao volume do poço. Diluir a suspensão celular para ter aproximadamente 50.000 células/mL e sementes de 2 mL da suspensão celular em uma placa de Petri de 35 mm.
  2. Prepare as seguintes diluições da solução de estoque comercial SYBR Gold (SG): 1:5.000. Prepare Mitotracker Deep Red (mancha vermelha distante) ou Mitotracker CMXRos Vermelho (mancha vermelha) (Tabela de Materiais; estoque comercial diluído 1:2.000) em meio de cultura sem fenol vermelho. Prepare as mesmas diluições do picoGreen como para SG.
    NOTA: As soluções descritas na etapa 1.2 são as soluções de rotulagem 2x. Proteja todas as soluções que contenham corantes fluorescentes da luz o máximo possível.
  3. Lave as células aderentes com 2 mL PBS uma vez. Adicione 1 ml de cultura sem fenol ao prato petri de 35 mm. Para um slide de câmara de 8 poços, use um volume igual a 1/2 da capacidade total do poço (por exemplo, adicione 125 μL se a capacidade total do poço for de 250 μL).
  4. Adicione 1 mL da solução de rotulagem 2x preparada na placa de 1,2 a 35 mm de Petri. Para um slide de câmara de 8 poços, use um volume igual a 1/2 da capacidade total do poço. Incubar as células por 30 min a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
    NOTA: Não incubar as células com solução de rotulagem SG por mais de 1h, pois a incubação mais longa causará rotulagem de DNA nuclear.
  5. Aspire cuidadosamente o meio contendo os corantes fluorescentes e lave as células uma vez com PBS.
  6. Adicione o meio de cultura celular sem fenol e mantenha as células no escuro em uma incubadora de CO2 a 37 °C até a imagem.
  7. Células vivas de imagem em um microscópio SR-SIM equipado com uma unidade de incubação (veja abaixo).

2. Aquisição de Imagem SR-SIM

  1. Instale uma incubadora de topo de palco no estágio do microscópio. Ajuste a temperatura desejada e a concentração de CO2 (por exemplo, 37 °C e 5% para células de mamíferos) e mantenha-se aquecido por pelo menos 1h antes de iniciar a aquisição da imagem.
  2. Ligue todos os componentes do microscópio SR-SIM, incluindo os lasers, e deixe-os aquecer por pelo menos 1 h.
  3. Escolha um objetivo de imersão de alta ampliação, alta abertura numérica (NA) (por exemplo, 100x 1,46 na oil) recomendado para SR-SIM pelo fabricante do microscópio.
  4. Instale um slide de câmara ou um prato de 35 mm com células rotuladas (a partir da etapa 1.6) no estágio do microscópio incubado.
  5. Localize a área de interesse da amostra, de preferência com oculares. Para obter a melhor qualidade de imagem SR-SIM, escolha as células que estão bem ligadas ao vidro.
  6. Use uma câmera de dispositivo emcomento de elétrons de alta extremidade emarada de fundo (EM-CCD) para adquirir imagens SR-SIM.
  7. Usando o software de aquisição de imagens, defina um alto ganho EM recomendado para a câmera usada (por exemplo, 300).
  8. Antes de adquirir a série de lapso de tempo para rastreamento nucleóide, adquira uma imagem SR-SIM de duas cores do mesmo campo de visão: um canal para coloração mitocondrial e outro para SG. Defina o primeiro canal de cores apropriado para a mancha mitocondrial utilizada (por exemplo, para uma mancha mitocondrial muito vermelha, coloque a excitação em 633 nm ou mais e um filtro de emissão de longopass de 650 nm). Para o sinal SG, defina a excitação em 488 nm e um filtro de emissão de bandpass de 500-550 nm.
  9. Usando o software, defina a menor potência laser possível para linhas de manchas de 488 nm e muito vermelhas.
    NOTA: Uma configuração típica é 1% de potência de saída a laser ajustada por um filtro tunable tunable acousto-óptico (AOTF).
  10. Se o microscópio SIM adquirir canais apenas sequencialmente (configuração de câmera única), desligue o canal de detecção de manchas muito vermelho.
  11. Defina a aquisição de um único plano focal desligando a aquisição da pilha Z desfaçando a caixa Z-stack no software.
  12. Defina o menor tempo de exposição da câmera EM-CCD possível.
  13. Defina três rotações da grade em vez de cinco rotações.
  14. Para aumentar a taxa de quadros, na guia Aquisição do software, defina a câmera para ler os dados apenas a partir da área central do sensor de câmera em vez de "Full Chip".
    NOTA: Por exemplo, mudar de ler uma área de 1.000 x 1.000 pixels de sensor completo para ler apenas 256 x 256 pixels permite uma redução no tempo de exposição da câmera de 50 ms para 13,4 ms e o tempo total de período de 1,8 s para 1,2 s. Se apenas uma parte central do sensor de câmera for lida, então o campo de visão será muito pequeno para um objetivo de 63x ou 100x normalmente usado para SR-SIM. Um tempo de exposição mais curto reduzirá a relação sinal-ruído das imagens.
  15. Otimizar o tempo de exposição do laser e da câmera: adquira imagens bidimensionais SR-SIM (2D) de células rotuladas a vários valores de potência laser (por exemplo, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%) e vários tempos de exposição (por exemplo, 13,4 ms, 25 ms, 50 ms).
  16. Processe os conjuntos de dados SIM brutos (ver etapa 3.1).
  17. Escolha os tempos de exposição de energia a laser e câmera que produzam imagens SIM com pontos brilhantes nas mitocôndrias (ou seja, os nucleóides) com pouco ou nenhum artefato gerado pelo processamento de SIM. Inspecione as áreas fora das mitocôndrias (por exemplo, 1% de potência do laser de estado sólido de 488 nm e exposição de 25 ms da câmera EM-CCD).
  18. Inicie a aquisição da série time lapse usando as configurações otimizadas nas etapas 2.15-2.17.

3. Processamento e Análise de Dados

  1. Processe conjuntos de dados SIM brutos com o módulo de iluminação estruturado de um software adequado (Tabela de Materiais): escolha a caixa de seleção automática para parâmetros de processamento SIM. Para processamento automático de vários arquivos, use a ferramenta de processamento em lote, desmarque Use Corrente para Lote,clique em Executar batch e selecione vários arquivos para processamento SIM.
  2. Converta os conjuntos de dados da série temporal processados por SIM em formato ims com o software conversor de arquivos Imaris (ou seja, a versão correspondente à versão do software Imaris).
  3. Abra um arquivo convertido no software (versão 8.4.1 ou posterior) que tenha uma licença para o módulo Lineage (ou Track).
  4. Inicie o assistente de criação "Spots", clicando em adicionar novos pontos. Um mago para a criação será lançado.
  5. Escolha a guia Criar do assistente.
  6. Na primeira etapa do assistente, clique em Track Spots (ao longo do tempo) e prossiga para a segunda etapa do assistente.
  7. Defina O Diâmetro XY Estimado para 0,1-0,15 μm, clique em Subtração de Fundo e prossiga para a terceira etapa.
  8. Ajuste o limiar no filtro "Qualidade" arrastando a linha vertical no histograma para que a maioria dos nucleóides sejam detectados como "manchas", enquanto os artefatos não são detectados (ou seja, os pontos detectados são marcados como bolas sobrepostas na imagem). Verifique se esse é o caso em cada quadro e reajuste o limite, se necessário. Vá para o quarto e, em seguida, para o quinto passo do mago.
  9. Escolha o algoritmo Autoregressive Motion. Defina distância máxima para 0,5 μm. Ajuste o tamanho da lacuna máxima para 0.
  10. Olhe para cada quadro da série de tempo e verifique se alguma faixa falsa é desenhada e se alguma lacuna entre as faixas é introduzida (faixas construídas pelo assistente com configurações atuais são marcadas instantaneamente como linhas sobrepostas na imagem). Ajuste "Max Distance", se necessário. Vá para o sexto passo do mago. Escolha o filtro Duração da faixa e defina um limite de 3 a 5 s.
  11. Se os pontos ou faixas detectados atualmente não forem ideais, volte para as etapas anteriores do assistente usando botões de navegação (na parte inferior da janela do assistente) necessários para ajustar qualquer parâmetro para a criação de pontos ou faixas.
  12. Quando os parâmetros afinados permitirem que o software detecte todos os pontos e construa faixas corretamente, clique no botão de navegação do Arqueiro Verde no assistente para confirmar a criação das faixas.
  13. Extraia as estatísticas das faixas clicando na janela ícone Estatísticas. Escolha os parâmetros estatísticos necessários (guias ValoresDetalhados e Médios em Estatísticas) e exporte os valores como arquivos csv clicando no ícone Disquete para quantificação e visualização.
    NOTA: Velocidade máxima da pista, velocidade média da pista, comprimento da pista e deslocamento da faixa são exemplos de parâmetros que são importantes.
  14. Se o conjunto de dados de imagem precisar ser apresentado ou publicado, então crie instantâneos e/ou arquivos de vídeo representando a série de lapso de tempo com faixas sobrepostas opcionalmente usando as ferramentas Snapshot ou Animation.

4. Aquisição de Imagem Confocal

  1. Instale uma incubadora de topo de palco no estágio do microscópio, ajuste a temperatura desejada e a concentração de CO2 (ou seja, 37 °C e 5% para células de mamíferos) e mantenha-se aquecido por pelo menos 1h antes de iniciar a aquisição da imagem.
  2. Ligue todos os componentes de um microscópio de varredura a laser confocal, incluindo os lasers, e deixe-os aquecer por pelo menos 1 h.
  3. Escolha um objetivo de ampliação desejado para alta ampliação objetiva e amostragem espacial de acordo com os critérios de Nyquist.
  4. Para o canal SG, defina a excitação em 488 nm e uma faixa de detecção de 500-550 nm. Para o canal de manchas mitocondriais, definido para 561 nm e 570-630 nm de emissão para um corante vermelho, ou 633 nm excitação e >650 nm emissão para um corante vermelho distante.
  5. Defina a menor potência laser possível (tipicamente 1% ou menos) que permite a aquisição dos sinais com ganhos de detector PMT de 700 mV.
  6. Adquira imagens confocal de duas cores das células, onde os nucleóides mitocondriais são detectados no "canal SG" e mitocôndrias são detectadas no canal "vermelho" ou "vermelho distante".

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Results

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Caracterização da rotulagem de células vivas com SG
Primeiro, a distribuição de SG nas células após incubação com o corante em várias diluições foi caracterizada por microscopia confocal. Após a incubação com altas concentrações de SG ou picoGreen, ambos os corantes rotularam principalmente os núcleos e apresentaram uma coloração pontual no citoplasma (Figura 1),da mesma forma aos dados publicados para outro corante de cianeto carregado po...

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Discussion

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Existem vários componentes críticos no protocolo: Para alcançar a rotulagem preferencial do DNA mitocondrial, a concentração do corante de ligação de DNA durante a incubação deve ser mantida muito baixa (por exemplo, uma diluição de 1:10.000 de um estoque comercial típico), e o tempo de incubação deve ser de 30 minutos. O tempo de incubação nunca deve exceder 1 h. Deve-se usar o corante SYBR Gold; outros corantes de ligação de DNA não são brilhantes o suficiente para gerar um sinal forte ao rotular em baixa concentração....

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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Os autores reconhecem Asifa Akhtar e Angelika Rambold (ambos do Instituto Max Planck de Imunobiologia e Epigenética) por fornecer células HeLa.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Elyra PS1Carl Zeisscontendo módulo para microscopia de iluminação estruturada de super-resolução (SR-SIM)
Alta glicose DMEMGIBCO/ThermoFisher31966021
prato de 35 mm, fundo de vidroIbidi Gmbh81158
ibidi microSlide de 8 poços, fundo de vidroIbidi Gmbh80827
Imaris 8.4.1Bitplane/Oxford Instrumentspacote de software de visualização e porcessing de imagem
iXon 885Andor TechnologiesCâmera EMCCD com sensor retroiluminado
LSM880 AiryscanMicroscópio confocal de varredura a laserCarl Zeiss
Mitotracker CMXRos RedThermoFischerM7512mitocondrial de células vivas vermelhas mancha
Mitotracker Deep Red FMThermoFischerM22426mancha mitocondrial de células vivas vermelhas distantes
picoGreenThermoFischerP7581coloração de DNA permeou
célula Plano Apocromático 100x/1.46 Objetivo de óleoCarl Zeiss
SYBR GoldThermoFischerS11494mancha de DNA permeou a célula
Zen Black 2012 softwareCarl Zeisssoftware de aquisição e processamento de imagens
Microscópio multimodal de super-resolução com detector de matriz

References

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