Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo

Summary

O protocolo descreve rotulagem específica de nucleóides mitocondriais com uma mancha de gel de DNA comercialmente disponível, aquisição de série de lapso de tempo de células rotuladas ao vivo por microscopia de iluminação estruturada de super resolução (SR-SIM) e rastreamento automático do movimento nucleóide.

Abstract

Nucleóides mitocondriais são partículas compactas formadas por moléculas de DNA mitocondrial revestidas de proteínas. O DNA mitocondrial codifica tRNAs, rRNAs e vários polipeptídeos mitocondriais essenciais. Os nucleóides mitocondriais dividem e distribuem dentro da dinâmica rede mitocondrial que sofre fissão/fusão e outras alterações morfológicas. Microscopia de fluorescência viva de alta resolução é uma técnica simples para caracterizar a posição e o movimento de um nucleóide. Para esta técnica, os nucleóides são comumente rotulados através de marcas fluorescentes de seus componentes proteicos, ou seja, fator de transcrição a (TFAM). No entanto, essa estratégia precisa de superexpressão de uma construção com etiqueta de proteína fluorescente, que pode causar artefatos (relatados para tfam), e não é viável em muitos casos. Corantes orgânicos de ligação de DNA não têm essas desvantagens. No entanto, eles sempre mostram a coloração de DNAs nucleares e mitocondriais, sem especificidade para os nucleóides mitocondriais. Levando em conta as propriedades físico-químicas desses corantes, selecionamos uma mancha de gel de ácido nucleico (SYBR Gold) e alcançamos rotulagem preferencial de nucleóides mitocondriais em células vivas. Propriedades do corante, particularmente seu alto brilho ao vincular ao DNA, permitem quantificação subsequente do movimento nucleóide mitocondrial usando séries temporais de imagens de iluminação estruturadas de super-resolução.

Introduction

Moléculas circulares de DNA de 16,5 kbp constituem o material genético das mitocôndrias, codificando 22 tRNAs, 2 rRNAs e 13 polipeptídeos necessários para complexos mitocondriais oxidativos de fosforilação. DNA mitocondrial ligado ao fator de transcrição mitocondrial a (TFAM) e várias outras proteínas formam os nucleóides mitocondriais^1,,2,,3,,4. Os nucleóides mitocondriais movem-se e redistribuem entre os componentes da rede mitocondrial^5,6 durante sua remodelagem morfológica, fissã....

Protocol

NOTA: Todas as linhas celulares aqui mencionadas foram cultivadas em alta glicose Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), glutamina, penicilina/estreptomicina e piruvato. Equilibre todos os meios de comunicação e suplementos a serem usados no dia da rotulagem e imagem aquecendo-os até 37 °C em uma incubadora definida para 5% de CO₂. Todo o trabalho de cultura celular, incluindo rotulagem, ocorre em condições estéreis sob uma coifa de fluxo laminar.

1. Rotulagem de células ao vivo

1. Um dia antes do procedimento de rotulagem, a cultura 4 x 10⁵ cé....

Results

Caracterização da rotulagem de células vivas com SG
Primeiro, a distribuição de SG nas células após incubação com o corante em várias diluições foi caracterizada por microscopia confocal. Após a incubação com altas concentrações de SG ou picoGreen, ambos os corantes rotularam principalmente os núcleos e apresentaram uma coloração pontual no citoplasma (Figura 1),da mesma forma aos dados publicados para outro corante de cianeto carregado po.......

Discussion

Existem vários componentes críticos no protocolo: Para alcançar a rotulagem preferencial do DNA mitocondrial, a concentração do corante de ligação de DNA durante a incubação deve ser mantida muito baixa (por exemplo, uma diluição de 1:10.000 de um estoque comercial típico), e o tempo de incubação deve ser de 30 minutos. O tempo de incubação nunca deve exceder 1 h. Deve-se usar o corante SYBR Gold; outros corantes de ligação de DNA não são brilhantes o suficiente para gerar um sinal forte ao rotular em baixa concentração........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Elyra PS1	Carl Zeiss		contendo módulo para microscopia de iluminação estruturada de super-resolução (SR-SIM)
Alta glicose DMEM	GIBCO/ThermoFisher	31966021
prato de 35 mm, fundo de vidro	Ibidi Gmbh	81158
ibidi microSlide de 8 poços, fundo de vidro	Ibidi Gmbh	80827
Imaris 8.4.1	Bitplane/Oxford Instruments		pacote de software de visualização e porcessing de imagem
iXon 885	Andor Technologies		Câmera EMCCD com sensor retroiluminado
LSM880 Airyscan	Microscópio confocal de varredura a laser	Carl Zeiss
Mitotracker CMXRos Red	ThermoFischer	M7512	mitocondrial de células vivas vermelhas mancha
Mitotracker Deep Red FM	ThermoFischer	M22426	mancha mitocondrial de células vivas vermelhas distantes
picoGreen	ThermoFischer	P7581	coloração de DNA permeou
célula Plano Apocromático 100x/1.46 Objetivo de óleo	Carl Zeiss
SYBR Gold	ThermoFischer	S11494	mancha de DNA permeou a célula
Zen Black 2012 software	Carl Zeiss		software de aquisição e processamento de imagens