O protocolo descreve rotulagem específica de nucleóides mitocondriais com uma mancha de gel de DNA comercialmente disponível, aquisição de série de lapso de tempo de células rotuladas ao vivo por microscopia de iluminação estruturada de super resolução (SR-SIM) e rastreamento automático do movimento nucleóide.
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Artigo de método
Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nucleóides mitocondriais são partículas compactas formadas por moléculas de DNA mitocondrial revestidas de proteínas. O DNA mitocondrial codifica tRNAs, rRNAs e vários polipeptídeos mitocondriais essenciais. Os nucleóides mitocondriais dividem e distribuem dentro da dinâmica rede mitocondrial que sofre fissão/fusão e outras alterações morfológicas. Microscopia de fluorescência viva de alta resolução é uma técnica simples para caracterizar a posição e o movimento de um nucleóide. Para esta técnica, os nucleóides são comumente rotulados através de marcas fluorescentes de seus componentes proteicos, ou seja, fator de transcrição a (TFAM). No entanto, essa estratégia precisa de superexpressão de uma construção com etiqueta de proteína fluorescente, que pode causar artefatos (relatados para tfam), e não é viável em muitos casos. Corantes orgânicos de ligação de DNA não têm essas desvantagens. No entanto, eles sempre mostram a coloração de DNAs nucleares e mitocondriais, sem especificidade para os nucleóides mitocondriais. Levando em conta as propriedades físico-químicas desses corantes, selecionamos uma mancha de gel de ácido nucleico (SYBR Gold) e alcançamos rotulagem preferencial de nucleóides mitocondriais em células vivas. Propriedades do corante, particularmente seu alto brilho ao vincular ao DNA, permitem quantificação subsequente do movimento nucleóide mitocondrial usando séries temporais de imagens de iluminação estruturadas de super-resolução.
Introdução
Moléculas circulares de DNA de 16,5 kbp constituem o material genético das mitocôndrias, codificando 22 tRNAs, 2 rRNAs e 13 polipeptídeos necessários para complexos mitocondriais oxidativos de fosforilação. DNA mitocondrial ligado ao fator de transcrição mitocondrial a (TFAM) e várias outras proteínas formam os nucleóides mitocondriais1,,2,,3,,4. Os nucleóides mitocondriais movem-se e redistribuem entre os componentes da rede mitocondrial5,6 durante sua remodelagem morfológica, fissã....
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Protocolo
NOTA: Todas as linhas celulares aqui mencionadas foram cultivadas em alta glicose Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), glutamina, penicilina/estreptomicina e piruvato. Equilibre todos os meios de comunicação e suplementos a serem usados no dia da rotulagem e imagem aquecendo-os até 37 °C em uma incubadora definida para 5% de CO2. Todo o trabalho de cultura celular, incluindo rotulagem, ocorre em condições estéreis sob uma coifa de fluxo laminar.
1. Rotulagem de células ao vivo
- Um dia antes do procedimento de rotulagem, a cultura 4 x 105 cé....
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Resultados
Caracterização da rotulagem de células vivas com SG
Primeiro, a distribuição de SG nas células após incubação com o corante em várias diluições foi caracterizada por microscopia confocal. Após a incubação com altas concentrações de SG ou picoGreen, ambos os corantes rotularam principalmente os núcleos e apresentaram uma coloração pontual no citoplasma (Figura 1),da mesma forma aos dados publicados para outro corante de cianeto carregado po.......
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Discussão
Existem vários componentes críticos no protocolo: Para alcançar a rotulagem preferencial do DNA mitocondrial, a concentração do corante de ligação de DNA durante a incubação deve ser mantida muito baixa (por exemplo, uma diluição de 1:10.000 de um estoque comercial típico), e o tempo de incubação deve ser de 30 minutos. O tempo de incubação nunca deve exceder 1 h. Deve-se usar o corante SYBR Gold; outros corantes de ligação de DNA não são brilhantes o suficiente para gerar um sinal forte ao rotular em baixa concentração........
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem Asifa Akhtar e Angelika Rambold (ambos do Instituto Max Planck de Imunobiologia e Epigenética) por fornecer células HeLa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | contendo módulo para microscopia de iluminação estruturada de super-resolução (SR-SIM) | |
| Alta glicose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| prato de 35 mm, fundo de vidro | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi microSlide de 8 poços, fundo de vidro | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | pacote de software de visualização e porcessing de imagem | |
| iXon 885 | Andor Technologies | Câmera EMCCD com sensor retroiluminado | |
| LSM880 Airyscan | Microscópio confocal de varredura a laser | Carl Zeiss | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | mitocondrial de células vivas vermelhas mancha |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | mancha mitocondrial de células vivas vermelhas distantes |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | coloração de DNA permeou |
| célula Plano Apocromático 100x/1.46 Objetivo de óleo | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | mancha de DNA permeou a célula |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | software de aquisição e processamento de imagens |
Referências
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al.
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Reimpressões e permissões
