Triagem cinética da atividade da nuclease usando sondas de ácido nucleico

Alien Balian; Javier Garcia Gonzalez; Nora Bastida; Khadija-Tul Kubra Akhtar; Baris A. Borsa; Frank  J. Hernandez

doi:10.3791/60005

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Artigo de método

Triagem cinética da atividade da nuclease usando sondas de ácido nucleico

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DOI:

10.3791/60005

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1 de novembro de 2019

Alien Balian^*¹^,²^,³ , Javier Garcia Gonzalez^*¹^,²^,³ , Nora Bastida¹^,³ , Khadija-Tul Kubra Akhtar¹^,³ , Baris A. Borsa¹^,²^,³ , Frank J. Hernandez¹^,²^,³

¹Department of Physics, Chemistry and Biology, Linköping University, ²Wallenberg Centre for Molecular Medicine (WCMM), ³Nucleic Acids Technologies Laboratory (NAT-lab), Linköping University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A atividade de nuclease alterada tem sido associada a diferentes condições humanas, subjacentes ao seu potencial como biomarcador. A metodologia modular e fácil de implementar a triagem apresentada neste artigo permite a seleção de sondas de ácido nucleico específico para aproveitar a atividade de nuclease como biomarcador da doença.

Resumo

Nucleases são uma classe de enzimas que quebram os ácidos nucleicos catalisando a hidrólise das ligações de fosfosfosterqueques que ligam os açúcares ribose. Nucleases apresentam uma variedade de papéis fisiológicos vitais em organismos procarióticos e eucarióticos, que vão desde a manutenção da estabilidade do genoma até o fornecimento de proteção contra patógenos. A atividade de nuclease alterada tem sido associada a várias condições patológicas, incluindo infecções bacterianas e câncer. Para este fim, a atividade nuclease tem mostrado grande potencial para ser explorada como um biomarcador específico. No entanto, um método de triagem robusto e reproduzível baseado nessa atividade permanece altamente desejável.

Aqui, introduzimos um método que permite o rastreamento para a atividade nuclease usando sondas de ácido nucleico como substratos, com o escopo de diferenciação entre condições patológicas e saudáveis. Este método oferece a possibilidade de projetar bibliotecas novas da ponta de prova, com especificidade crescente, em uma maneira iterativa. Assim, várias rodadas de triagem são necessárias para refinar o design das sondas com características aprimoradas, aproveitando a disponibilidade de ácidos nucleicos quimicamente modificados. O potencial considerável da tecnologia proposta reside na sua flexibilidade, alta reprodutibilidade e versatilidade para o rastreamento da atividade de nuclease associada às condições da doença. Espera-se que esta tecnologia permita o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico promissoras com um grande potencial na clínica.

Introdução

Nucleases são uma classe de enzimas capazes de clivagem as ligações fosfosfosfosterques que formam a estrutura espinha dorsal de moléculas de ácido nucleico. A vasta diversidade de nucleases torna a sua classificação bastante difícil. No entanto, existem alguns critérios comuns utilizados para descrever nucleases, como preferência por substrato (ácido desoxiribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA)), local de clivagem (endonucleases ou exonucleases), ou dependência de ions metálico, entre outros¹. Nucleases são enzimas catalíticas altamente conservadas que têm papéis fundamentais em ambos, organismos procarióticos e eucarióticos e têm sido....