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Artigo de método

Triagem cinética da atividade da nuclease usando sondas de ácido nucleico

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DOI:

10.3791/60005

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1 de novembro de 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, Chemistry and Biology, Linköping University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine (WCMM), 3Nucleic Acids Technologies Laboratory (NAT-lab), Linköping University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A atividade de nuclease alterada tem sido associada a diferentes condições humanas, subjacentes ao seu potencial como biomarcador. A metodologia modular e fácil de implementar a triagem apresentada neste artigo permite a seleção de sondas de ácido nucleico específico para aproveitar a atividade de nuclease como biomarcador da doença.

Resumo

Nucleases são uma classe de enzimas que quebram os ácidos nucleicos catalisando a hidrólise das ligações de fosfosfosterqueques que ligam os açúcares ribose. Nucleases apresentam uma variedade de papéis fisiológicos vitais em organismos procarióticos e eucarióticos, que vão desde a manutenção da estabilidade do genoma até o fornecimento de proteção contra patógenos. A atividade de nuclease alterada tem sido associada a várias condições patológicas, incluindo infecções bacterianas e câncer. Para este fim, a atividade nuclease tem mostrado grande potencial para ser explorada como um biomarcador específico. No entanto, um método de triagem robusto e reproduzível baseado nessa atividade permanece altamente desejável.

Aqui, introduzimos um método que permite o rastreamento para a atividade nuclease usando sondas de ácido nucleico como substratos, com o escopo de diferenciação entre condições patológicas e saudáveis. Este método oferece a possibilidade de projetar bibliotecas novas da ponta de prova, com especificidade crescente, em uma maneira iterativa. Assim, várias rodadas de triagem são necessárias para refinar o design das sondas com características aprimoradas, aproveitando a disponibilidade de ácidos nucleicos quimicamente modificados. O potencial considerável da tecnologia proposta reside na sua flexibilidade, alta reprodutibilidade e versatilidade para o rastreamento da atividade de nuclease associada às condições da doença. Espera-se que esta tecnologia permita o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico promissoras com um grande potencial na clínica.

Introdução

Nucleases são uma classe de enzimas capazes de clivagem as ligações fosfosfosfosterques que formam a estrutura espinha dorsal de moléculas de ácido nucleico. A vasta diversidade de nucleases torna a sua classificação bastante difícil. No entanto, existem alguns critérios comuns utilizados para descrever nucleases, como preferência por substrato (ácido desoxiribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA)), local de clivagem (endonucleases ou exonucleases), ou dependência de ions metálico, entre outros1. Nucleases são enzimas catalíticas altamente conservadas que têm papéis fundamentais em ambos, organismos procarióticos e eucarióticos e têm sido usadas, e continuam a ser usadas, como ferramentas de edição de genes2. Eles também são atores fundamentais na manutenção e replicação do DNA, ajudando a manter a estabilidade do genoma e participando de processos de leitura de prova3. Em bactérias, por exemplo, nucleases foram identificados como importantes fatores de virulência, capazes de promover a sobrevivência bacteriana, reduzindo a eficácia do sistema imunológico do hospedeiro4,5,6,7 8. Em mamíferos, nucleases têm sido sugeridos para ser implicado em apoptose9, biogênese mitocondrial e manutenção10 e mediação de antibacteriano e antiviral respostas imunes inatas11. Não surpreendentemente, as alterações de atividade nuclease, seja aprimoramento ou falta de, têm sido implicadas em uma ampla gama de doenças humanas. Estas doenças variam de uma grande variedade de cânceres12,13 a hipertrofia cardíaca10 ou doenças auto-imunes14. Portanto, nucleases tornaram-se candidatos interessantes como biomarcadores para um grupo heterogêneo de condições humanas. Na verdade, nucleases já mostraram seu potencial como ferramentas de diagnóstico bem-sucedidas para a detecção de infecções causadas por agentes bacterianos específicos, como Staphylococcus aureus ou Escherichia coli15, 16.Em muitos tipos de câncer, a expressão da proteína 1 (SND1) contendo domínio estaphylocóco sede é indicativa de mau prognóstico17. Em pacientes com câncer de pâncreas, níveis elevados de ribeirinhoI (RNase I) foram relatados18 e propostos para serem associados a fenótipos de células cancerosas19. Em doenças cardíacas isquêmicas, como infarto do miocárdio ou angina pectoris instáveis, os níveis de soro de desoxiribonuclease I (DNase I) mostraram-se um marcador diagnóstico válido20,21.

Tem sido a hipótese de que o modelo global de atividade nuclease pode ser diferente em estados saudáveis e doenças. Na verdade, relatórios recentes têm usado diferenças na atividade nuclease para distinguir entre fenótipos saudáveis e cancerosos22 ou para identificar infecções bacterianas patogênicas de uma forma específica da espécie15,23. Esses achados abriram um novo caminho para o uso de nucleases como biomarcadores da doença. Portanto, existe uma necessidade para o desenvolvimento de um método abrangente de rastreamento capaz de identificar sistematicamente as diferenças associadas à doença na atividade nuclease, o que pode ser de importância fundamental no desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico.

Aqui, introduzimos e descrevemos uma nova abordagem de rastreamento in vitro (Figura 1) para identificar sondas sensíveis e específicas capazes de discriminar entre a atividade nuclease em saudável e insalubre, ou atividade específica para um tipo de célula ou bactéria. Aproveitando a modularidade dos ácidos nucleicos, projetamos uma biblioteca inicial de sondas oligonucleotídeas fluorescentes saciadas que consistem em um conjunto abrangente de diferentes sequências e químicas, ambos sendo parâmetros importantes para o projeto da biblioteca. Estas sondas oligonucleotide são ladeadas por um fluorofóbico (fluorescein amidita, FAM) e um quencher (maré quencher 2, TQ2) nas extremidades 5' e 3', respectivamente (Tabela 1). Ao utilizar este ensaio fluorométrico à base de ressonância fluorescente (FRET) para medir a cinética da degradação enzimática, conseguimos identificar sondas candidatas com potencial para discriminar padrões diferenciais de atividade nuclease estados saudáveis ou de doença. Nós projetamos um processo iterativo, no qual novas bibliotecas são criadas com base nas melhores sondas de candidatos, que permite a identificação de sondas candidatas cada vez mais específicas em etapas de triagem subsequentes. Além disso, essa abordagem aproveita a natureza catalítica dos nucleases para aumentar a sensibilidade. Isto é conseguido aproveitando-se da natureza activatable das pontas de prova do repórter e da habilidade dos nucleases de processar continuamente moléculas substratos, representando vantagens chaves sobre o anticorpo alternativo ou métodos de seleção molécula-baseados pequenos.

Esta abordagem oferece uma ferramenta de triagem altamente modular, flexível e fácil de implementar para a identificação de sondas de ácido nucleico específico capazes de discriminar entre estados saudáveis e de doença, e uma excelente plataforma para o desenvolvimento de novos estados de ácido nucleico capazes de discriminar entre estados saudáveis e de doença, e uma excelente plataforma para o desenvolvimento de novos ferramentas de diagnóstico que podem ser adaptadas para futuras aplicações clínicas. Como tal, esta abordagem foi usada para identificar a atividade nuclease derivada de Salmonella Typhimurium (aqui referido como Salmonella)para a identificação específica desta bactéria. No protocolo a seguir, relatamos um método para rastrear a atividade de nuclease bacteriana usando análise cinética.

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Protocolo

1. Projeto e preparação da biblioteca de Oligonucleotide

  1. Projeto da biblioteca
    1. Com base nos seguintes critérios de projetar uma biblioteca de sondas oligonucleotídeas fluorescentes saciadas entre 8 e 12 mers de comprimento para evitar a formação da estrutura secundária, com comprimento igual para todas as sondas.
      1. Inclua pelo menos um DNA e uma sequência aleatória de RNA contendo uma combinação de adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T)/uracil (U) (sondas de DNA e RNA na Tabela 1).
        NOTA: As sequências de DNA e RNA descritas na Tabela 1 têm sido úteis como os substratos iniciais para classificar um tipo desconhecido de atividade nuclease, tanto dnase ou rnase. Estas duas seqüências são recomendadas como o ponto de partida para qualquer triagem, pois eles mostraram uma ampla capacidade para detectar perfis de atividade de nuclease em bactérias e amostras de tecido. Se a atividade nuclease não é observada com essas seqüências de DNA e RNA, o design de oligonucleotídeos adicionais é necessário.
      2. Inclua sequências de polinucleotídeos que consistem em um único tipo de nucleotídeo para determinar a dependência da sequência de uma determinada atividade nuclease (DNA-Poly A, DNA-Poly T, DNA-Poly C, DNA-Poly G, RNA-Poly A, RNA-Poly U, RNA-Poly C e RNA-Poly G na Tabela 1).
      3. Usando a mesma seqüência de resíduos de nucleotídeos como as sequências iniciais de DNA e RNA, incluem sequências que contêm análogos nucleosídeos que abrigam modificações químicas na posição 2 do açúcar ribose, como 2'-Fluoro e 2'-O-Methyl, como um passo rigoroso para aumentar a seletividade das nucleases.
        1. Inclua sequências totalmente modificadas que consistem inteiramente de análogos de nucleosídeo fluoro 2 ou análogos de nucleosídeo 2'-O-Methyl (Todos 2'-F e All 2'-OMe, Tabela 1)
        2. Inclua sequências quiméricas compostas por purinas naturais não modificadas e análogos de nucleosídeo de pirimidina 2'-Fluoro (RNA Pyr-2'F, Tabela 1).
        3. Inclua sequências quiméricas compostas por purinas naturais não modificadas e análogos de nucleosídeo de pirimidina 2'-O-Methyl (RNA Pyr-2'OMe, Tabela 1).
        4. Inclua sequências quiméricas compostas por pirimidinas naturais não modificadas e análogos de nucleosídeo de puroside 2'-Fluoro (RNA Pur-2'F, Tabela 1).
        5. Inclua sequências quiméricas compostas por pirimidinas naturais não modificadas e análogos de nucleosídeo de puré de 2'-O-Metil (RNA Pur-2'OMe, Tabela 1).
  2. Preparação e armazenamento da ponta de prova do Oligonucleotide
    NOTA: Oligonucleotides são sintetizados pelo método de fostempomidite. Após a síntese, os oligonucleotídeos são purificados usando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e a massa é medida pela espectrometria de massa.
    1. Desça as sondas oligonucleotídeas liofilizadas usando uma centrífuga e diluí-las no tampão Tris-EDTA (TE) para evitar a degradação da nuclease. Determine o volume de diluição de acordo com o rendimento de cada sonda para tornar uma solução de estoque com uma concentração de 500 pmol/μL.
    2. Armazenar oligonucleotídeos liofilizados a 4 °C ou temperatura ambiente por um curto prazo. Para armazenamento a longo prazo (meses a anos), armazenar oligonucleotídeos liofilizados em -20 °C. Após a resuspensão de oligonucleotídeos liofilizados na TE, guarde as soluções de ações a -20 °C ou, de preferência, a -80 °C.

2. Cultura bacteriana

  1. Pegue uma conta de vidro porosa do frasco de armazenamento criogênico em condições estéreis.
  2. Para isolar colônias bacterianas individuais(Salmonella e E. coli), use o métodoquadrante 24 por estrias / rolando a conta diretamente em uma placa de Petri contendo Tryptic Soy Agar (TSA) médio complementado com ovelhas defibrinadas Sangue.
  3. Incubar a cultura a 37 °C por 24 h.

3. Preparação supernatant

  1. Transfira uma única colônia de mídia sólida para 50 mL Caldo de soja tripética (TSB) e incubar a 37 °C por 24 h a 200 rpm.
  2. Diluir a cultura (1:500) no TSB (subcultura) e incubar a 37 °C por 24 h a 200 rpm em uma incubadora tremer.
    NOTA: Espera-se que após 24 h de incubação as culturas bacterianas estão em fase estacionária atingindo valores superiores a 109 CFU/mL.
  3. Após o período de incubação, transfira as culturas para tubos estéreis e centrífugas limitados a 4.500 x g por 30 min.
  4. Recolher o supernatant e usá-lo imediatamente. Alternativamente, guarde as supernatantes a 4 °C ou -20 °C.

4. Ensaio de Atividade de Nuclease

  1. Preparação de soluções de trabalho
    1. Prepare uma solução de trabalho de 20 μL para cada sonda em tubos de microcentrífuga livre de nuclease de 1,5 mL diluindo (proporção de 1:10) a solução de estoque (500 pmol/μL) para uma concentração de trabalho final de 50 pmol/μL. Para esse efeito, misture 18 μL de Phosphate Buffer Saline (PBS) contendo MgCl2 e CaCl2 com 2 μL de solução de estoque de sonda.
      NOTA: Esteja ciente de que na solução de trabalho, os oligonucleotídeos são mais vulneráveis à degradação do nuclease, portanto, recomenda-se preparar as soluções de trabalho pouco antes de configurar a reação.
    2. Evite o contato direto de luz durante a preparação e mantenha no escuro (envolto em papel alumínio), ao lidar com fluorofóbicos.
  2. Reação configurada
    1. Pré-aqueça o flódromo (por exemplo, Cytation 1) a 37 °C.
    2. Prepare um conjunto (um tubo/sonda) de tubos de microcentrífuga sem nuclease de 1,5 mL para cada amostra (TSB, E. coli e Salmonella)e rotule em conformidade.
    3. Adicione cuidadosamente 96 μL de mídia de cultura estéril TSB, Salmonella supernatant ou Supernatant E. coli (a partir da etapa 3.4.). Posteriormente, adicione 4 μL/tubo de solução de trabalho de sonda em conformidade. Executar este passo à temperatura ambiente.
      NOTA: 10 sondas foram usadas para a primeira rodada da triagem e 6 sondas para a segunda rodada.
    4. Misture bem por pipetting cima e para baixo para obter uma solução homogênea. Evite introduzir bolhas de ar nas amostras durante a mistura.
    5. Carregue 95 μL de cada solução (sonda + mídia de supernatant ou cultura) em um poço separado de uma placa de 96 poços de fundo preto e não tratada. Minimize a formação de bolhas nos poços ao carregar, dispensando cuidadosamente a ponta próxima à parede do poço.
    6. Cubra a placa com a tampa. Inspecione visualmente a tampa e verifique se há marcas de caneta ou acúmulo de partículas de poeira que podem introduzir artefatos de medição. Substitua a tampa para um novo se aquele for o caso.
  3. Medida configurada
    1. Abra o software de aquisição (Gen5 3.05) clicando no ícone do atalho do software(Figura S1A).
    2. Selecione Leia Agora a partir da janela do gerenciador de tarefas e escolha Novo... para criar o protocolo de medição cinética(Figura S1B).
    3. Clique no Set Temperature na janela de diálogo intitulada Procedimento e selecione 37 °C. Confirmar e salvar as configurações pressionando OK (Figura S1C).
    4. Clique no Iniciar a Cinética na janela de diálogo intitulada Procedimento. Em seguida, na janela de diálogo pop-up, intitulado Kinetic Step, selecione 2 h na caixa de entrada Run Time e 2 min na caixa de entrada Interval. Confirmar e salvar as configurações pressionando OK (Figura S1D).
    5. Clique em Ler na janela de diálogo intitulada Procedimento. Em seguida, na janela de diálogo pop-up, intitulado Método de Leitura, selecione Fluorescência Intensidade como um método de detecção, Endpoint / Cinética como um tipo de leitura e filtros como tipo de óptica. Confirmar e salvar as configurações pressionando OK (Figura S1E).
    6. Na janela de diálogo pop-up intitulada Read Step (Cinética),selecione Green do Conjunto de Filtros. Confirmar e salvar as configurações pressionando OK (Figura S2A).
    7. Na janela de diálogo intitulada Procedimento,selecione a tampa de uso e clique na validação para garantir que o protocolo criado seja válido. Isto é confirmado por uma janela de diálogo pop-up(Figura S2B).
    8. Selecione o protocolo na barra do menu e escolha o procedimento (Figura S2C).
    9. Na janela de diálogo intitulada Procedimento,defina os poços a serem medidos(Figura S2D).
    10. Digite o nome do experimento na caixa de entrada de nome de arquivo(Figura S2E).
    11. Carregue a placa com sua tampa no leitor da placa. Certifique-se de que a placa está na orientação certa.
    12. Comece a aquisição clicando leia novo botão na barra de ferramentas(Figura S2F).
  4. Análise de dados
    1. Clique em um dos poços medidos na janela de diálogo intitulado Placa 1 (Figura S3A).
    2. Clique em poços selecionados e inclua todos os poços medidos na janela de diálogo de seleção de poços. Confirmar e salvar as configurações pressionando OK. (Figura S3B).
    3. Selecione dados na janela de diálogo intitulada Placa 1 para visualizar os resultados tabulados(Figura S3C).
    4. Exportar os dados para uma folha de spread, selecionando a exportação rápida do menu de contexto(Figura S3C).
    5. Na folha de spread, rotule as colunas de dados em conformidade para cada amostra e sonda.
    6. Gerar gráficos cinéticos, usando linha com estilo de marcadores, traçando unidades relativas de fluorescência (RFU) versus tempo (x-eixo: cronograma da reação e eixo y: RFUs).
      NOTA: A descrição da geração de um gráfico é aplicável ao usar programas de planilha (por exemplo, Excel). No entanto, quaisquer outros programas podem ser usados para gerar gráficos a partir dos dados brutos obtidos, traçando RFU versus tempo.
    7. Calcule a taxa da reação enzimática para cada intervalo medido figure-protocol-1 de acordo com a seguinte fórmula25:taxa = , onde se é RFU no ponto de tempo máximo do intervalo e ii é RFU no ponto de tempo mínimo do intervalo, e Tf e Ti são os pontos de tempo máximos e mínimos do intervalo, respectivamente.
    8. Selecione a taxa com o maior valor (Rmax)para cada curva. Se houver mais de um Rmax por amostra, selecione aquele que ocorre no primeiro ponto de tempo de medição.
    9. Calcule a razão entre Rmax e o valor médio do intervalo de tempo em que ocorre Rmax: coeficiente de taxa =figure-protocol-2
    10. Calcule a diferença de dobra (FD) entre o coeficiente de taxa de Salmonella e E. coli para cada sonda.
    11. Considere um valor de diferença de dobra superior a 3 como significativo.
    12. Considere as sondas significativas com os valores de diferença de dobra mais altas (FD) como sondas candidatas e como base para o projeto da biblioteca na próxima rodada de triagem.

5. Critérios de seleção das rodadas de triagem (Figura 1)

  1. Primeira rodada de triagem
    1. Realize o ensaio de atividade nuclease (conforme descrito na seção 4) usando sondas de DNA, RNA e polinucleotídeos.
    2. Avalie a preferência pela química do DNA ou química do RNA comparando o número e o desempenho (valor do FD) das sondas candidatas ao DNA e ao RNA.
    3. Selecione o tipo de química do ácido nucleico tornando o maior número de sondas candidatas, como ilustrado na Figura 1.
  2. Segunda rodada de triagem
    1. Realize o ensaio de atividade nuclease (conforme descrito na seção 4) usando sondas totalmente modificadas e sondas quiméricas projetadas com base no substrato de ácido nucleico selecionado na primeira rodada de triagem.
    2. Avalie a preferência por sequências contendo análogos de nucleosídeo 2'-O-Metil, comparando os resultados obtidos para sondas candidatas modificadas 2'-Fluoro e 2'-O-Methyl.
    3. Selecione o tipo de modificação analógica nucleosídea tornando o maior número de sondas candidatas, como ilustrado na Figura 1.

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Resultados

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho dessa metodologia, que é dividida em duas rodadas de triagem. Na primeira rodada de triagem, usamos 5 sondas de DNA (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C e DNA Poly G) e também 5 sondas de RNA (RNA, RNA Poly A, RNA Poly RNA Poly C e RNA Poly G). Os dados brutos desta rodada de triagem podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1. Na segunda rodada, sondas quimicamente modificadas foram sintetizadas substituindo a sequência de RNA por...

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Discussão

Alterações da atividade nuclease têm sido associadas a uma grande variedade de fenótipos de doenças, incluindo diferentes tipos de câncer e infecções bacterianas. Estas alterações são propostas para ser o agente causal de uma condição14,enquanto em outros casos são consequência de um evento fisiológico prejudicial20 ou agente patogênico16,26. Não surpreendentemente, as tentativas de usar nucleases e atividade nuclea...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de reconhecer Luiza I. Hernandez (Universidade linköping) por sua cuidadosa revisão do manuscrito e conselhos valiosos. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Knut e Alice Wallenberg e pela Área de Pesquisa Estratégica do Governo Sueco em Ciência de Materiais em Materiais Funcionais Avançados na Universidade de Linköping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU No. 2009-00971).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fundo preto, placa de 96 poços não tratadaFisher Scientific10000631
Cytation1BioTekCYT1FAV
Eppendorf tubosThermofisher11926955
Escherichia coliATCC25922
Frasco de armazenamento criogênico de microbanco contendo esferasPro-Lab Diagnostics22-286-155
Sondas de ácido nucleicoBiomers.net#
Tampão fosfato Salino contendo MgCl2 e CaCl2Gibco™
Salmonella enterica subs. EntericaATCC14028
Tris-EDTAFisher Scientific10647633
Ágar Soja Triptona com sangue de ovelha desfibrinadoThermo Fisher Scientific10362223
Caldo de Soja TrípticoSigma Aldrich22092
14040117

Referências

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

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