Nós apresentamos uma estratégia RT-PCR-baseada circular combinando o RT-PCR circular, o RT-PCR quantitativo, o RNA 5 ' polyphosphatase-Treatment, e o borrão do Norte. Este protocolo inclui um passo de normalização para minimizar a influência do trifosfato 5 ' instável, e é adequado para discriminar e mapear as transcrições primárias e processadas estavelmente acumuladas em mitocódrias de milho.
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Artigo de método
Discriminação e mapeamento das transcrições primárias e processadas em Mitocídrias de milho usando uma estratégia circular RT-PCR-based
Neste artigo
Resumo
Resumo
Em mitocôndria de plantas, alguns transcritos de estado estacionário têm 5 ' trifosfato derivado do início da transcrição (transcritos primários), enquanto os outros contêm 5 ' monofosfato gerado pós-transcripcionalmente (transcrições processadas). Para discriminar entre os dois tipos de transcrições, várias estratégias foram desenvolvidas, e a maioria deles depende da presença/ausência de 5 ' trifosfato. No entanto, o trifosfato na primária 5 ' Termini é instável, e dificulta uma clara discriminação dos dois tipos de transcrições. Para diferenciar e mapear sistematicamente as transcrições primárias e processadas estavelmente acumuladas em mitocídrias de milho, desenvolvemos uma estratégia circular RT-PCR (cRT-PCR), combinando cRT-PCR, tratamento com polifoshpatase de RNA 5, quantitativo RT-PCR (RT-qPCR), e Northern blot. Como uma melhoria, esta estratégia inclui uma etapa da normalização do RNA para minimizar a influência do triphosphate 5 ' instável.
Neste protocolo, o RNA mitochondrial enriquecido é pre-treated pelo RNA 5 ' polyphosphatase, que converte 5 ' triphsophate ao monofosfato. Após a circularização e a transcrição reversa, os dois cDNAs derivados de 5 ' RNAs polifosfatase-tratados e não-tratados são normalizados pelo milho 26S maduro rRNA, que tem um 5 ' final processado e é insensível a 5 ' polifosfatase. Após a normalização, as transcrições primárias e processadas são discriminadas comparando-se os produtos cRT-PCR e RT-qPCR obtidos a partir das RNAs tratadas e não tratadas. A transcrição Termini são determinados pela clonagem e sequenciamento dos produtos cRT-PCR e, em seguida, verificados pelo Northern blot.
Ao usar essa estratégia, a maioria dos transcritos de estado estacionário em mitocrídrias de milho foram determinados. Devido ao teste padrão complicado do Transcript de alguns genes mitochondrial, alguns transcritos do estacionário-estado não foram diferenciados e/ou mapeados, embora fossem detectados em um borrão do Norte. Não temos certeza se esta estratégia é adequada para discriminar e mapear as transcrições de estado estacionário em outras mitocôndrias de plantas ou em plastids.
Introdução
Nas mitocôndrias de plantas, muitos RNAs maduros e precursores são acumulados como múltiplas isoformas, e as transcrições de estado estacionário podem ser divididas em dois grupos com base na diferença em seus 5 ' fins1,2,3, a 4. Os transcritos preliminares têm 5 ' extremidades do trifosfato, que são derivadas da iniciação da transcrição. Por outro lado, as transcrições processadas têm 5 ' monofosfato gerados pelo processamento pós-transcripcional. A discriminação e o mapeamento dos dois tipos de transcrições são importantes para desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à transcrição e à maturação final do transcrito.
Para distinguir entre as transcrições primárias e processadas em mitocrídrias vegetais, foram desenvolvidas quatro estratégias principais. A primeira estratégia é pré-tratar as RNAs mitocondriais com a pirofosfatase ácida do tabaco (TAP), que converte 5 ' trifosfato para monofosfato e permite que as transcrições primárias sejam circularizadas por RNA ligase. As abundâncias de transcrição de amostras de RNA tratadas com TAP e não tratadas são comparadas por amplificação rápida de extremidades de cDNA (raça) ou RT-PCR circular (cRT-PCR)2,3,4. Na segunda estratégia, as transcrições processadas são primeiramente esgotadas de RNAs mitocondriais usando o exterminador de terminação 5 '-fosfato-dependente (Tex), e as transcrições primárias deixadas são então mapeadas pela análise de extensão de primer5,6 . A terceira estratégia é a pré-tampão das transcrições primárias utilizando guanil transferase e, em seguida, a posição de trifosodiado 5 ' Termini é determinada pela extensão da cartilha, juntamente com ribonuclease ouS1 análise de proteção nuclease 7,8 ,9. Diferente daqueles dependendo da presença/ausência de 5 ' trifosfato, a quarta estratégia combina in vitro a transcrição, mutagenesis local-dirigido, e a análise da extensão da primeira demão para caracterizar os promotores putativo e para determinar a transcrição sites de iniciação8,10,11. Usando estas estratégias, muitos transcritos preliminares e processados foram determinados na mitocôndria da planta.
No entanto, vários estudos relataram que o 5 ' trifosfato de transcritos primários foram instáveis, e eles foram facilmente convertidos em monofosfato por motivo desconhecido2,4,12,13. Este problema dificulta uma discriminação clara dos dois tipos de transcrições, utilizando técnicas dependendo da presença/ausência de 5 ' trifosfato, e os esforços anteriores para discriminar sistematicamente entre as transcrições primárias e processadas em plantas a mitocôndria falhou2,12.
Neste protocolo, nós combinamos cRT-PCR, RNA 5 ' tratamento da polifosfatase, RT-qPCR, e o borrão do Norte para distinguir sistematicamente os transcritos preliminares e processados estàvel acumulados no milho (Zea Mays) mitodrion (Figura 1). cRT-PCR permite o mapeamento simultâneo de 5 ' e 3 ' extremidades de uma molécula de RNA, e geralmente é adaptado para mapear a transcrição Termini nas plantas2,12,14,15. O RNA 5 ' polyphosphatase poderia remover dois fosfatos do 5 ' Termini trifosodiado, que faz as transcrições preliminares disponíveis para o Self-Ligation pela ligase do RNA. Estudos prévios mostraram que o rRNA maduro de 26S no milho tinha processado 5 ' Terminus, e era insensível ao RNA 5 ' polyphosphatase1,16. Para minimizar a influência do trifosfato instável em 5 ' Termini preliminar, os 5 ' RNAs polyphosphatase-tratados e não-tratados são normalizados pelo rRNA 26S maduro, e os transcritos preliminares e processados são diferenciados então comparando o produtos de cRT-PCR obtidos a partir das duas amostras de RNA. Os resultados de mapeamento e discriminação de cRT-PCR são verificados por Northern blot e RT-qPCR, respectivamente. Finalmente, os primers alternativos são usados para amplificar aquelas transcrições detectadas no borrão do Norte mas não pelo cRT-PCR. Usando essa estratégia baseada em cRT-PCR, a maioria dos transcritos de estado estacionário em mitocrídrias de milho foram diferenciadas e mapeadas1.
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Protocolo
1. projeto da primeira demão
- Projete primers gene-específicos para a transcrição reversa (RT) usando o software do projeto da primeira demão do PCR (tabela dos materiais) baseado nas réguas gerais do projeto17da primeira demão.
Nota: Os primers RT são altamente específicos para as transcrições de destino, e eles são geralmente ancorados na parte 5 ' de seqüências de codificação (mRNAs maduros e RNAs precursor), ou ~ 500 – 600 NT a jusante do antecipado 5 ' final (18S e 26S rRNAs). - Projete pares de primers divergentes para amplificar as transcrições circularizadas por cRT-PCR.
Nota: os primers divergentes pareados ladeiam a junção 5 '-3 ' das transcrições circularizadas, e suas posições variam entre os transcritos alvo analisados (Figura S1). Algumas transcrições têm UTRs longos; por exemplo, nad2-1 5 ' UTR e rps4-1 3 ' UTR são 1.985 e 1826/1834 NT, respectivamente1. Se ambos os primers estiverem ancorados na região de codificação, será difícil amplificar as transcrições de destino. Por outro lado, alguns UTRs são curtos; por exemplo, os 3 ' UTRs de nad2-1 e nad4-1 são 34/35 e 29 – 31 NT, respectivamente1. Se os primers emparelhados estiverem localizados longe das sequências de codificação, a PCR falhará. Geralmente, dois pares de primers divergentes são projetados para cada transcritos alvo, enquanto vários pares podem ser necessários para mapear aqueles cujos padrões de transcrição são complicados e/ou UTRs são muito longos. - Projete pares de primers convergentes para preparar pontas de prova do RNA para o borrão do Norte.
Nota: Os primers emparelhados estão localizados na região codificadora do gene alvo, e o tamanho do produto PCR deve estar na faixa de 100 a 1.000 BP. Cada iniciador dianteiro deve conter um local de enzima de restrição para minimizar sequências vetoriais nas sondas resultantes.
2. preparação de Mitocrídrias brutas de grãos em desenvolvimento de milho
- Esterilize pilões, argamassas, funis de vidro, tubos, e pontas pela autoclave, e seque-os no forno.
- Realize todos os procedimentos a 4 ° c ou no gelo, e pré-resfrie todas as soluções.
- Prepare 100 ml de tampão de extração (EB), composto de 0,3 M de sacarose, 5 mm de pirofosfato de tetrasódio, 10 mm KH2po4, 2 mm EDTA, 1% [w/v] polivinilpirrolidona 40, 1% [w/v] albumina sérica bovina, 5 mm L-cisteína e 20 mm de ácido as Ajustar a pH 7,3 com KOH e esterilizar por filtração.
- Prepare 100 mL de tampão de lavagem (WB) consistindo de 0,3 M de sacarose, 1 mM EGTA, e 10 mM MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfonic ácido). Ajuste ao pH 7,2 com NaOH e esterilize pela filtração.
Nota: Sugere-se para preparar EB e WB usando DEPC-tratados deionizada H2O. - Colete 20 g desenvolvendo grãos em 11 – 20 dias após a polinização (DAP) para um tubo de 50 mL colocado no gelo e, em seguida, transfira os grãos para argamassas pré-resfriadas.
Nota: Use uma proporção de 100 mL de EB para 20 g de grãos de milho. - Adicione 10 – 20 mL de EB gelada a cada argamassa e moer os grãos completamente.
- Adicione mais EB, e filtre os tecidos terrestres através de duas camadas de pano de filtro (tabela de materiais).
- Centrifugue o filtrado em 8.000 x g por 10 min, e descarte o pellet.
- Transfira o sobrenadante para um novo tubo e Centrifugue-o a 20.000 x g durante 10 min.
- Despeje o sobrenadante, e ressuscita o pellet em 6 mL WB.
- Aliquot a suspensão a cinco 1,5 mL de tubos RNase-livres, e centrifugue-os em 14.000 x g por 5 minutos.
- Descarte o sobrenadante, congele a pelota mitocondrial em nitrogênio líquido e armazene a-80 ° c.
3. extração de RNA mitocondrial
- Extraia o RNA mitocondrial com um reagente comercial (tabela de materiais) de acordo com as instruções da manufatura.
Atenção: Este reagente contém fenol e isotiocianato de guanidina. Trabalhe com ele em uma capa de fumaça, e usar jaleco e luvas. - Dissolva o RNA mitocondrial isolado em H2O desionizado tratados com DEPC e estime a concentração e a pureza do RNA com um espectrofotômetro (tabela de materiais).
Nota: Geralmente, ~ 250 μg de RNA mitocondrial é obtido a partir de 20 g de 15-DAP grãos de milho. - Prepare um gel de agarose composto de 1x TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM de ácido acético, 1mM EDTA), 1,5% agarose (tabela de materiais), e 1x mancha nuclear corante (tabela de materiais).
- Adicionar um volume apropriado de 10x buffer de carga (0,5% bromofenol azul, 0,5% xilol cianol FF, e 50% glicerol), e carga de RNA mitocondrial/carga tampão de mistura sobre o 1,5% gel de agarose.
- Executar o gel em 1x TAE buffer em 5 – 6 V/cm por 20 – 25 min, e avaliar a integridade do RNA mitocondrial por imagem o gel com um sistema de documentação de gel (tabela de materiais).
Nota: A presença de duas bandas distintas (~ 3.510 e ~ 1.970 NT para o milho mitocondrial 26S e 18S rRNAs, respectivamente) é um padrão aceitável para RNA mitocondrial intacto. Para excluir a possível degradação, a integridade do RNA deve ser investigada durante as múltiplas etapas da preparação do RNA circularizado (Figura 2).
4. RNA 5 ' Polifosfatase tratamento
- Configurar o tratamento de RNA 5 ' polifosfatase (tabela e materiais) (tabela 1) e incubar a 37 ° c durante 30 – 60 min.
- Recupere o RNA 5 ' polyphosphatase-tratado com um jogo da purificação do RNA (tabela dos materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
- Repita os passos 3,3 a 3,5.
5. circularização do RNA
- Prepare duas reações de circularização utilizando as mesmas quantidades de 5 ' RNAs mitocondriais tratadas com polifosfatase e não tratadas (tabela 2), e incubar ambas as reações a 16 ° c por 12 – 16 h.
- Recupere os dois conjuntos de RNAs autoligadas usando o mesmo kit que na etapa 4,2.
Nota: Deve-se notar que apenas uma fração do RNA mitocondrial será autoligada, e o RNA recuperado será uma mistura de transcritos lineares e circularizados. - Repita os passos 3,3 a 3,5.
6. transcrição reversa
- Sintetizar dois conjuntos de cDNAs a partir das mesmas quantidades de RNAs de 5 ' polifosfatase tratadas e não tratadas (200 ng) circularizadas.
- Prepare uma mistura de primer adicionando uma proporção igual de 26S-CRT e até 7 outros primers RT.
Nota: A concentração final da mistura de primer deve ser de 1 μM. - Prepare duas pré-misturas combinando os reagentes listados na tabela 3, incubar a 65 ° c por 5 min, e depois Chill no gelo por 2 min.
- Montar dois sistemas de reacção RT (tabela 4) e incubar-los a 42 ° c por 50 min.
- Aqueça as duas reacções RT a 70 ° c durante 5 min e, em seguida, Chill-los no gelo.
7. normalização
- Prepare duas reações de PCR adicionando o mesmo volume de cDNAs do modelo derivado de 5 ' RNAs polifosfatase-tratadas ou não-tratadas, os primers divergentes que flanqueam a junção 5 '-3 ' do rRNA de 26S molde (isto é 26S-CF1 e-o-de-2), etc. (tabela 5).
- Execute as duas reações em um termociclador (tabela de materiais) em condições descritas na tabela 6.
- Prepare um gel do agarose compor do amortecedor de 1x TAE, do agarose de 1,0%, e do corante de coloração nuclear 1x.
- Adicione 2 μL de tampão de carga 10x (0,5% de bromofenol azul, 0,5% de xileno cianol FF e 50% de glicerol) a cada um dos dois produtos de PCR e carregue-os no gel.
- Execute o gel em 1x TAE buffer em 5 – 6 V/cm por 30 – 40 min, e imagem-lo usando o mesmo gel sistema de documentação como etapa 3,5.
- Compare a abundância dos dois produtos do PCR usando o software de computador (tabela dos materiais, figura 4a), e aperfeiçoe a normalização mudando as quantidades de cDNAs do molde se necessário.
8. amplificação do PCR
- Prepare pares de reações do PCR adicionando o volume apropriado dos cDNAs normalizados e um par de primers divergentes que flanqueam a junção 5 '-3 ' das transcrições do alvo (tabela 7).
Nota: A quantidade de cDNAs do molde usada para a amplificação do PCR das transcrições do alvo é determinada pelos resultados da normalização do rRNA 26S. - Realize as reações de PCR de acordo com o programa descrito na tabela 8.
- Repita os passos 7,3 a 7,5.
- Mude aos primers divergentes aninhados, e verifique os primeiros resultados redondos do PCR repetindo etapas 8,1 e 8,2.
- Repita os passos 7,3 a 7,5.
- Recupere as bandas proeminentes que poderiam ser repetidas em duas rodadas de amplificação de PCR usando um kit de recuperação de DNA de gel (tabela de materiais).
9. determinação da transcrição Termini
- Clone os produtos gel-purified do PCR em um vetor da Blunt-extremidade (tabela dos materiais) usando técnicas padrão.
- Realize a PCR de colônia para selecionar clones positivos que contenham as inserções de destino e sequencia-as comercialmente.
Nota: Clones positivos contendo pastilhas com tamanho variável são geralmente detectados a partir de uma única banda recuperada, pois muitas transcrições de estado estacionário na planta mitocondrial têm heterogéneos 5 ' e/ou 3 ' extremidades1,12. - Alinhe os dados de sequenciamento com o genoma mitocondrial do milho usando a ferramenta básica de busca de alinhamento local (BLAST) do centro nacional de informação sobre biotecnologia (NCBI). Escolha o organismo "milho (taxid: 4577)", e banco de dados de pesquisa "nucleotide Collection (NR/NT)".
- Encontrar o 5 '-3 ' junção da transcrição molde, e determinar as posições de 5 ' e 3 ' transcrição Termini.
- Calcule o tamanho das transcrições de destino.
10. verificação dos resultados do mapeamento do cRT-PCR pela hibridação do borrão do gel do RNA
Nota: A hibridação do borrão do gel do RNA é executada usando um jogo comercial (tabela dos materiais), que contenha os reagentes para a transcrição-rotulagem do RNA com Digoxigenina (Dig) e o POLYMERASE do RNA T7, a hibridação, e a deteção imunológica. Refira por favor os protocolos fornecidos neste jogo para mais detalhes. Certifique-se de que somente o equipamento livre de RNase está usado para o procedimento inteiro.
- Amplificar o fragmento de DNA usado para preparar a sonda de RNA, e cloná-lo para o mesmo vetor como na etapa 9,1, que contém um promotor T7 17 BP a montante do local de inserção.
- Linearize a construção usando a enzima apropriada da limitação, recupera o plasmídeo linearizada por um jogo da purificação do ADN (tabela dos materiais), e dissolve-o no H2O deionizada DEPC-Tratado.
- Pontas de prova do RNA da etiqueta com DIG-11-UTP por um jogo comercial (tabela dos materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
- Prepare 500 mL de tampão MOPS 10x (0,2 M MOPS, acetato de sódio de 50 mM e EDTA de 10 mM) usando H2O desionizado tratado com DEPC. ajuste ao pH 7,0 por NaOH, e esterilize pela filtração.
- Adicione 2 – 3 volumes de tampão de carga (50% de formamida, 6,2% de formaldeído, 1x MOPS, 10% de glicerol e 0,1% de bromofenol azul) ao RNA mitocondrial preparado nas etapas 3.1 – 3.3.
- Denature a mistura do tampão da amostra/carregamento do RNA em 65 ° c por 10 minutos, e esfrie então no gelo por 1 minuto.
- Prepare um gel de agarose desnaturado (2% formaldeído, 1,2% agarose, e 1x MOPS), e carregar a amostra de RNA/carga tampão de mistura para o gel (1 – 2 μg de RNA mitocondrial por poço).
- Executar o gel em 1x MOPS em 3 – 4 V/cm para ~ 4 h.
- Prepare 2 L de 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M citrato de sódio, pH 7,0). Tratá-lo com 0,1% DEPC durante a noite, e esterilizar por autoclave.
- Enxague o gel duas vezes em 20x SSC (15 min cada vez), e transfira o RNA do gel a uma membrana de nylon (tabela dos materiais) pela transferência capilar com 20x SSC para 10 – 16 h.
- Fixar o RNA à membrana por cozimento a 120 ° c por 30 min.
- Realize a hibridação do RNA e a deteção imunológica com um jogo comercial (tabela dos materiais) de acordo com a instrução do fabricante.
11. discriminação das extremidades primárias e processadas 5 '
- Discriminar as extremidades primárias e processadas 5 ' comparando os produtos cRT-PCR obtidos a partir dos 5 ' normalizados polifosfatase-tratados e não tratados RNAs.
Nota: Para as transcrições primárias, a abundância de produtos de PCR de 5 ' RNA tratado com polifosfatase é muito maior do que a de contrapartes não tratadas (Figura 1, ' gene A ' e figura 4a). No entanto, para transcrições processadas, um nível comparável de produtos de PCR seria amplificado a partir dos dois conjuntos de RNAs mitocondrial (Figura 1, ' gene B '). - Projete os primers RT-qPCR baseados nos resultados do mapeamento cRT-PCR.
- Verifique os resultados da discriminação do cRT-PCR pelo RT-qPCR.
Nota: As duas amostras de cDNA derivadas de 5 ' RNAs polifosfatase-tratadas e não-tratadas são normalizadas pelos produtos de RT-qPCR de 26S amadurecem rRNA.
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Resultados
Estimativa da eficiência da circularização do RNA mitocondrial
Em um estudo precedente, ambos os RNAs totais e mitochondrial foram usados para o mapeamento do cRT-PCR de Termini do transcrito mitochondrial em Arabidopsis (Arabidopsis thaliana de Arabidopsis), e os dois tipos de RNAs deram resultados similares do traço12. Inicialmente, utilizou-se também RNAs totais para ...
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Discussão
Em estudo prévio, foram utilizados RNAs totais e mitocondriais da cultura de suspensão celular de Arabidopsis para mapear a transcrição mitocondrial Termini por CRT-PCR, e resultados semelhantes foram obtidos12. No entanto, apenas o RNA mitocondrial enriquecido foi utilizado para mapear a transcrição mitocondrial Termini em muitos outros estudos1,2,3,9. Nós enco...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 31600250, Y.Z.), ciência e projetos de tecnologia da cidade de Guangzhou (subvenção n º 201804020015, H.N.), e do sistema de pesquisa agrícola da China (não conceder. CARROS-04-PS09, H.N.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido acético | Aladdin, China | A112880 | Para preparar 1x tampão TAE |
| Aplicador Termociclador Applied Biosystems 2720 | Thermo Fisher Scientific, EUA | 4359659 | Termociclador para amplificação de PCR |
| Ácido ascórbico | Sigma-aldrich, EUA | V900134 | Para preparação do tampão de extração |
| Biowest Agarose | Biowest, Espanha | 9012-36-6 | Para resolver PCR produtos e RNAs |
| Albumina de soro bovino | Sigma-aldrich, EUA | A1933 | Para preparação de tampão de extração |
| Azul de bromofenol | Sigma-aldrich, EUA | B8026 | Para preparação de tampão de carga para eletroforese em gel de agarose e Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, EUA | V900882 | Desativação do kit inicial RNase |
| DIG Northern | Roche, EUA | 12039672910 | Para marcação de DIG-RNA e Northern blot. Este kit contém os reagentes para marcação de transcrição de RNA com DIG e RNA polimerase T7, hibridização e detecção quimioluminescente. |
| EDTA | Sigma-aldrich, EUA | V900106 | Para preparação de tampão de extração e 1x tampão TAE |
| EGTA | Sigma-aldrich, EUA | E3889 | Para preparação de tampão de lavagem Sistema de documentação de |
| gel | Bio-Rad, EUA | Gel Doc XR+ | Para obter imagens do gel de agarose |
| Glicerol | Sigma-aldrich, EUA | G5516 | Para preparação de tampão de carga para eletroforese em gel de agarose |
| GoldView II (5.000x) | Solarbio,. China | G8142 | coloração de DNA |
| Hybond-N +, membrana de nylon | Amersham Biosciences, EUA | RPN119 | para Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, EUA | Image Lab 3.0 | Image gel e comparar a abundância de produtos de PCR. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, EUA | V900041 | Para a preparação do tampão de extração |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | Para a preparação do tampão de extração |
| L-cisteína | Sigma-aldrich, EUA | V900399 | Para a preparação do tampão de extração |
| Millex | Millipore, EUA | SLHP033RB | Para extração estéril e tampões de lavagem por filtração |
| Miracloth | Calbiochem, EUA | 475855-1R | Para filtrar os tecidos do kernel moído |
| MOPS | Sigma-aldrich, EUA | V900306 | Para preparação de tampão de corrida para Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, EUA | 2000C | Para concentração de RNA e ensaio de pureza |
| NaOH | Sigma-aldrich, EUA | V900797 | Para preparação do tampão de lavagem |
| pEASY-Blunt vetor de clonagem simples | TransGen Biotech, China | CB111 | Clonagem da banda recuperada em gel. Ele contém um promotor T7 vários bps a montante do local de inserção. |
| DNA polimerase de superfidelidade Phanta max | Vazyme, China | P505 | DNA polimerase para amplificação de PCR |
| Polivinilpirrolidona 40 | Sigma-aldrich, EUA | V900008 | Para preparação de tampão de extração |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, EUA | Primer Premier 6.24 | Para projetar primers para transcrição reversa e amplificação de PCR |
| PrimeScript II transcriptase reversa | Takara, Japão | 2690 | Para sintetizar o primeiro kit de cDNA |
| PureLink RNA Mini de | Thermo Fisher Scientific, EUA | 12183025 | Para purificação de |
| RNA RNA 5' polifosfatase | Epicentro, EUA | RP8092H | Para converter 5' trifosfato em inibidor de RNase monofosfato |
| New England Biolabs, Reino Unido | M0314 | Um componente da autoligação do RNA e das reações de tratamento da polifosfatase 5', e é usado para inibir a atividade da RNase. | |
| Acetato de sódio | Sigma-aldrich, EUA | V900212 | Para preparação de tampão de corrida para Northern blot |
| Cloreto de sódio | Sigma-aldrich, EUA | V900058 | Para preparar 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, EUA | 1725202 | Para RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | Para circularização de RNA |
| Tetrassódico pirofosfato | Sigma-aldrich, EUA | 221368 | Para preparação do tampão de extração |
| TIANgel kit de purificação midi | Tiangen Biotech, China | DP209 | Para purificar fragmentos de DNA do gel de agarose |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | Para preparar 1x tampão TAE |
| TRIzol reagente | Invitrogen, EUA | 15596026 | Para extrair RNA mitocondrial. |
| Kit universal de purificação de DNA | Tiangen Biotech, China | DP214 | Para recuperar plastmídeos linearizados da reação de digestão da enzima de restrição |
| Xileno cianol FF | Sigma-aldrich, EUA | X4126 | Para preparação de tampão de carga para eletroforese em gel de agarose |
Referências
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