Discriminação e mapeamento das transcrições primárias e processadas em Mitocídrias de milho usando uma estratégia circular RT-PCR-based

Summary

Nós apresentamos uma estratégia RT-PCR-baseada circular combinando o RT-PCR circular, o RT-PCR quantitativo, o RNA 5 ' polyphosphatase-Treatment, e o borrão do Norte. Este protocolo inclui um passo de normalização para minimizar a influência do trifosfato 5 ' instável, e é adequado para discriminar e mapear as transcrições primárias e processadas estavelmente acumuladas em mitocódrias de milho.

Abstract

Em mitocôndria de plantas, alguns transcritos de estado estacionário têm 5 ' trifosfato derivado do início da transcrição (transcritos primários), enquanto os outros contêm 5 ' monofosfato gerado pós-transcripcionalmente (transcrições processadas). Para discriminar entre os dois tipos de transcrições, várias estratégias foram desenvolvidas, e a maioria deles depende da presença/ausência de 5 ' trifosfato. No entanto, o trifosfato na primária 5 ' Termini é instável, e dificulta uma clara discriminação dos dois tipos de transcrições. Para diferenciar e mapear sistematicamente as transcrições primárias e processadas estavelmente acumuladas em mitocídrias de milho, desenvolvemos uma estratégia circular RT-PCR (cRT-PCR), combinando cRT-PCR, tratamento com polifoshpatase de RNA 5, quantitativo RT-PCR (RT-qPCR), e Northern blot. Como uma melhoria, esta estratégia inclui uma etapa da normalização do RNA para minimizar a influência do triphosphate 5 ' instável.

Neste protocolo, o RNA mitochondrial enriquecido é pre-treated pelo RNA 5 ' polyphosphatase, que converte 5 ' triphsophate ao monofosfato. Após a circularização e a transcrição reversa, os dois cDNAs derivados de 5 ' RNAs polifosfatase-tratados e não-tratados são normalizados pelo milho 26S maduro rRNA, que tem um 5 ' final processado e é insensível a 5 ' polifosfatase. Após a normalização, as transcrições primárias e processadas são discriminadas comparando-se os produtos cRT-PCR e RT-qPCR obtidos a partir das RNAs tratadas e não tratadas. A transcrição Termini são determinados pela clonagem e sequenciamento dos produtos cRT-PCR e, em seguida, verificados pelo Northern blot.

Ao usar essa estratégia, a maioria dos transcritos de estado estacionário em mitocrídrias de milho foram determinados. Devido ao teste padrão complicado do Transcript de alguns genes mitochondrial, alguns transcritos do estacionário-estado não foram diferenciados e/ou mapeados, embora fossem detectados em um borrão do Norte. Não temos certeza se esta estratégia é adequada para discriminar e mapear as transcrições de estado estacionário em outras mitocôndrias de plantas ou em plastids.

Introduction

Nas mitocôndrias de plantas, muitos RNAs maduros e precursores são acumulados como múltiplas isoformas, e as transcrições de estado estacionário podem ser divididas em dois grupos com base na diferença em seus 5 ' fins^1,2,3, a ⁴. Os transcritos preliminares têm 5 ' extremidades do trifosfato, que são derivadas da iniciação da transcrição. Por outro lado, as transcrições processadas têm 5 ' monofosfato gerados pelo processamento pós-transcripcional. A discriminação e o mapeamento dos dois tipos de transcrições são importantes para desvendar o....

Protocol

1. projeto da primeira demão

1. Projete primers gene-específicos para a transcrição reversa (RT) usando o software do projeto da primeira demão do PCR (tabela dos materiais) baseado nas réguas gerais do projeto¹⁷da primeira demão.
   Nota: Os primers RT são altamente específicos para as transcrições de destino, e eles são geralmente ancorados na parte 5 ' de seqüências de codificação (mRNAs maduros e RNAs precursor), ou ~ 500 – 600 NT a jusante do antecipado 5 ' final (18S e 26S rRNAs).
2. Projete pares de primers divergentes para amplificar as transcrições circularizadas por cRT-PCR.
   Nota: os ....

Results

Estimativa da eficiência da circularização do RNA mitocondrial

Em um estudo precedente, ambos os RNAs totais e mitochondrial foram usados para o mapeamento do cRT-PCR de Termini do transcrito mitochondrial em Arabidopsis (Arabidopsis thaliana de Arabidopsis), e os dois tipos de RNAs deram resultados similares do traço¹². Inicialmente, utilizou-se também RNAs totais para .......

Discussion

Em estudo prévio, foram utilizados RNAs totais e mitocondriais da cultura de suspensão celular de Arabidopsis para mapear a transcrição mitocondrial Termini por CRT-PCR, e resultados semelhantes foram obtidos¹². No entanto, apenas o RNA mitocondrial enriquecido foi utilizado para mapear a transcrição mitocondrial Termini em muitos outros estudos^1,2,3,9. Nós enco.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido acético	Aladdin, China	A112880	Para preparar 1x tampão TAE
Aplicador Termociclador Applied Biosystems 2720	Thermo Fisher Scientific, EUA	4359659	Termociclador para amplificação de PCR
Ácido ascórbico	Sigma-aldrich, EUA	V900134	Para preparação do tampão de extração
Biowest Agarose	Biowest, Espanha	9012-36-6	Para resolver PCR produtos e RNAs
Albumina de soro bovino	Sigma-aldrich, EUA	A1933	Para preparação de tampão de extração
Azul de bromofenol	Sigma-aldrich, EUA	B8026	Para preparação de tampão de carga para eletroforese em gel de agarose e Northern blot
DEPC	Sigma-aldrich, EUA	V900882	Desativação do kit inicial RNase
DIG Northern	Roche, EUA	12039672910	Para marcação de DIG-RNA e Northern blot. Este kit contém os reagentes para marcação de transcrição de RNA com DIG e RNA polimerase T7, hibridização e detecção quimioluminescente.
EDTA	Sigma-aldrich, EUA	V900106	Para preparação de tampão de extração e 1x tampão TAE
EGTA	Sigma-aldrich, EUA	E3889	Para preparação de tampão de lavagem Sistema de documentação de
gel	Bio-Rad, EUA	Gel Doc XR+	Para obter imagens do gel de agarose
Glicerol	Sigma-aldrich, EUA	G5516	Para preparação de tampão de carga para eletroforese em gel de agarose
GoldView II (5.000x)	Solarbio,. China	G8142	coloração de DNA
Hybond-N +, membrana de nylon	Amersham Biosciences, EUA	RPN119	para Northern blot
Image Lab	Bio-Rad, EUA	Image Lab 3.0	Image gel e comparar a abundância de produtos de PCR.
KH2PO4	Sigma-aldrich, EUA	V900041	Para a preparação do tampão de extração
KOH	Aladdin, China	P112284	Para a preparação do tampão de extração
L-cisteína	Sigma-aldrich, EUA	V900399	Para a preparação do tampão de extração
Millex	Millipore, EUA	SLHP033RB	Para extração estéril e tampões de lavagem por filtração
Miracloth	Calbiochem, EUA	475855-1R	Para filtrar os tecidos do kernel moído
MOPS	Sigma-aldrich, EUA	V900306	Para preparação de tampão de corrida para Northern blot
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, EUA	2000C	Para concentração de RNA e ensaio de pureza
NaOH	Sigma-aldrich, EUA	V900797	Para preparação do tampão de lavagem
pEASY-Blunt vetor de clonagem simples	TransGen Biotech, China	CB111	Clonagem da banda recuperada em gel. Ele contém um promotor T7 vários bps a montante do local de inserção.
DNA polimerase de superfidelidade Phanta max	Vazyme, China	P505	DNA polimerase para amplificação de PCR
Polivinilpirrolidona 40	Sigma-aldrich, EUA	V900008	Para preparação de tampão de extração
Primer Premier 6.24	PREMIER Biosoft, EUA	Primer Premier 6.24	Para projetar primers para transcrição reversa e amplificação de PCR
PrimeScript II transcriptase reversa	Takara, Japão	2690	Para sintetizar o primeiro kit de cDNA
PureLink RNA Mini de	Thermo Fisher Scientific, EUA	12183025	Para purificação de
RNA RNA 5' polifosfatase	Epicentro, EUA	RP8092H	Para converter 5' trifosfato em inibidor de RNase monofosfato
	New England Biolabs, Reino Unido	M0314	Um componente da autoligação do RNA e das reações de tratamento da polifosfatase 5', e é usado para inibir a atividade da RNase.
Acetato de sódio	Sigma-aldrich, EUA	V900212	Para preparação de tampão de corrida para Northern blot
Cloreto de sódio	Sigma-aldrich, EUA	V900058	Para preparar 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes	Bio-Rad, EUA	1725202	Para RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs, UK	M0437	Para circularização de RNA
Tetrassódico pirofosfato	Sigma-aldrich, EUA	221368	Para preparação do tampão de extração
TIANgel kit de purificação midi	Tiangen Biotech, China	DP209	Para purificar fragmentos de DNA do gel de agarose
Tris	Aladdin, China	T110601	Para preparar 1x tampão TAE
TRIzol reagente	Invitrogen, EUA	15596026	Para extrair RNA mitocondrial.
Kit universal de purificação de DNA	Tiangen Biotech, China	DP214	Para recuperar plastmídeos linearizados da reação de digestão da enzima de restrição
Xileno cianol FF	Sigma-aldrich, EUA	X4126	Para preparação de tampão de carga para eletroforese em gel de agarose